【毕业学位论文】抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究-微生物学博士论文

博士学位论文 抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究 作者姓名： 吴学玲 学科专业： 微生物学 学院（系、所）： 资源加工与生物工程学院 指导教师： 邱冠周 教授 中 南 大 学 2007 年 4 月 分类号 密级 博士学位论文 抗性浸矿细菌的选育及抗性机理研究 （作者姓名： 吴学玲 学科专业： 微生物学 学院（系、所）： 资源加工与生物工程学院 指导教师： 邱冠周 教授 刘新星 教授 论文答辩日期 2007 年 5 月 28 日 答辩委员会主席 周集中 中 南 大 学 2007 年 4 月 博士学位论文 摘 要 本研究选育对重金属等毒性离子具有抗性的高效浸矿菌株， 并对抗性菌株对重金属等毒性离子的耐受能力、 耐受机理、抗性相关基因及基因差异表达、阴离子对细菌的影响等进行研究。用 9及元素 来自江西德兴铜矿、湖北大冶铜矿、广西大厂等多个矿区的矿坑水样本进 行了硫化矿浸矿细菌的富集、 筛选、驯化、分离纯化，得到能氧化 及元素 取纯化细菌基因组 过 6S 定其 16S 6S 9 等重金属离子，通过重铬酸钾滴定法测定培养基中的 浓度来确定所分离的菌株在重金属离子抑制情况下对 的氧化能力变化并筛选出重金属抗性菌株。 对抗性菌株的最高耐受能力进行测定并在最高耐受浓度时对 的氧化能力进行测定和分析。 对筛选出的重金属抗性菌株进行紫外诱变以获得具有更高的 氧化能力及更高重金属离子耐受能力的突变菌株。根据 实验菌株的重金属抗性基因（抗铜基因、抗砷基因及抗银基因）进行 子克隆及序列测定，用 上述抗性基因编码的蛋白质进行分析并构建进化树。 在不同铜离子浓度时对抗铜基因差异表达进行分析 并进行铜蓝浸矿实验。在以 为能源的 9究在同种阳离子存在时阴离子对浸矿菌株的 氧化能力的影响。 16S 研究的 实验菌株均为嗜酸氧化亚铁硫杆菌 (称为 实验菌株对重金属离子的耐受能力测定结果表明， 驯化后筛选出对重金属离子有较高抗性的抗性菌株，对 ， ， ， ， 的最高耐受能力分别为 32000 ， 240 ， 0.9 ， 3500 ，22500 。而野生菌株对上述离子的最高耐受浓度分别为 19000 ， 60 ， 0.1 ， 400 ， 13500 ，说明驯化后抗性菌株对重金属离子的耐受能力明显增强。对具有较高 抗性和 抗性的抗性菌株进行紫外诱变，获得 的突变菌株生长性能稳定，比诱博士学位论文 摘 要 氧化能力和更强的耐受重金属离子性能。其对 和 耐受能力分别是野生菌的 2 3倍，是驯化菌的 其抗铜机理及抗银机理研究的结果表明： 抗铜基因 没有发现抗银基因 不同铜离子浓度时抗铜基因表达有明显差异。铜蓝浸矿实验发现 浸矿能力明显高于 26#，在 9时 出率可达 对抗铜基因编码的蛋白质进行分析发现了结构域 构域 性有关。通过自行设计的抗砷基因引物对另一个抗性基因抗砷基因 隆及测序。结果显示，实验菌株的抗砷基因 序列与模式菌株 4个碱基不同。 对 到了一段以硫作为信号的 原性辅酶）依赖的素单核苷酸） 还原酶的功能域。 推测 中 功能可能与 因编码的还原酶的氧化还原作用有关。 除了重金属离子对 离子对细菌生长活性及 氧化能力也有重要影响，其影响的强弱顺序为： l to of 博士学位论文 目 录 录 摘 要 .一章 文献综述 .言 .酸氧化亚铁硫杆菌的生物学特征 . 形态特征 . 生长条件 . 分类地位 .响嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的因素 . 的影响 . 温度的影响 . 金属离子的影响 .属离子对细胞毒性作用的机理 .胞对重金属离子的抗性机制研究 . 细胞壁与膜的表面富集 . 细胞外的沉淀和结晶作用 . 与细胞运输有关的抗性机制 . 细胞内的隔离作用和解毒作用 . 金属离子的转化作用 . 重金属离子抗性的抗性基因研究 . 同价阳离子的存在会增加微生物的重金属抗性 .酸氧化亚铁硫杆菌驯化诱变育种理论 .酸氧化亚铁硫杆菌在细菌浸出中存在的问题和本文的研究内容 .二章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的筛选及 16S 定 .言 .验材料与方法 . 实验菌株及培养方法 . 实验仪器 . 实验试剂 . 实验菌株的分离及对亚铁的氧化 . 实验菌株对硫的氧化及 的变化 .士学位论文 目 录 验菌株基因组 取 . 基因组 琼脂糖凝胶电泳检测 . 实验菌株 16S 增 . 增产物检测 .0 增产物的纯化及测序 .验结果与分析 . 实验菌株分离纯化 . 实验菌株对亚铁及升华硫的氧化能力分析 . 基因组 提取及 16S 增 . 实验菌株 16S 列分析 . 实验菌株的系统发育分析 .章小结 .三章 抗铜嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化诱变育种及抗铜机理分析 .言 .料与方法 . 实验菌株与培养基 . 菌株的富集 . 筛选天然抗铜能力最高菌株 . 菌株的驯化 . 紫外诱变 . 制作驯化诱变菌与驯化菌生长曲线 . 基因组 提取 . 琼脂糖凝胶电泳检测 . 抗铜基因的引物设计及 增 .0 琼脂糖凝胶电泳检测及 应产物分析 .1 用 行抗铜基因差异表达分析 .2 铜蓝浸出实验 .实验结果及分析 . 天然铜抗能力最强菌株的选择 . 26#菌株最高铜耐受能力测定 . 菌株驯化 . 诱变菌的致死率及生长曲线 . 抗铜基因与 比对分析 .士学位论文 目 录 铜蛋白的同源蛋白的搜索 . 抗铜蛋白序列分析 . 抗铜蛋白的进化分析 . 嗜酸氧化亚铁硫杆菌抗铜机理的预测 . 因的差异表达 .1 铜蓝浸出实验 .论 .章小结 .四章 银抗性嗜酸氧化亚铁硫杆菌的选育诱变及抗银机理研究 .言 .材料与方法 . 菌种来源及富集 . 银抗性菌株的驯化及分离纯化 . 银抗性菌对 氧化能力测定 . 银抗性菌对其它重金属离子的耐性实验 . 银抗性菌的 16S 定 . 银抗性菌的紫外诱变 . 银抗性菌的抗银机理分析 .验结果 . 菌种来源与富集 . 银抗性菌的驯化及分离纯化 . 对 化能力的影响 . 银抗性菌对其它重金属离子的耐受能力 . 16 定 . 紫外诱变 . 抗银机理分析 .析讨论 .章小结 .五章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌抗砷基因 克隆测序及功能分析 .言 .料与方法 . 实验菌株与生长条件 . 纯化菌株的总 取 .士学位论文 目 录 砷基因 物设计及 幅 . 增产物的纯化及克隆 . 隆产物的序列分析 .验结果 . 细菌基因组 提取及鉴定 . 细菌 因的扩增克隆及测序 . 因表达产物 白分析 . 白的结构分析 .论 .章小结 .六章 阴离子对嗜酸氧化亚铁硫杆 菌亚铁氧化活性的影响.言 .料与方法 . 菌种来源和富集 . 菌种的分离纯化 . 菌种氧化活性研究 . 纯化菌株的 16S 定 . 不同金属盐对细菌 化活性的影响 .实验结果 . 菌种富集及分离纯化 . 实验菌株对 的氧化 . 实验菌株对硫的氧化 . 不同阴离子锌盐条件下的生长活性 .果分析 .章小结 .七章 结 论 .考文献 . 谢 .读学位期间主要的研究成果 .士学位论文 第一章 文献综述 1第一章 文献综述 言 在世界矿产资源日渐贫乏的情况下， 传统的方法已经不再适用于那些低品位的矿石。由于资源的枯竭及人们对矿物原料需求量的不断增加，迫使人们不得不开发利用品位低、分散、难处理矿石，同时还要保护环境，细菌冶金因此而有代替传统冶金工艺之势 2002; 2001; 2002; 2001; 2001。生物浸矿作为一种新的、成本低、操作简单、作用对象广泛、环境污染小的矿产开发技术 邱冠周等， 1998，越来越引起人们的兴趣。生物浸矿是指利用微生物从矿石中溶解有价金属 (如铜、镍、铀 ) ，主要依据微生物在矿物表面的吸附作用及微生物的氧化作用来处理难浸矿石， 多为用传统方法无法利用的低品位矿、废石、多金属共生矿等 李宏煦等， 2003。近 20 年来微生物浸矿已被广泛采用，从各种贫矿、废矿、尾矿中提取回收金、铜等许多重要金属，既可节约资源，又可减少环境污染。据初步统计 ，全世界铜的总产量中有 1520来自生物浸出 邓恩建等， 2005。美国每年铜产量约 10%是通过生物浸矿实现的 王伟等， 1997。微生物在矿物表面的吸附，可不同程度地改变矿物表面的物理化学性质，如疏水性、表面元素的氧化、还原、溶解、沉淀等行为。浸矿细菌与硫化矿物短暂接触后即引起矿物表面性质的改变，常使其失去疏水性。有研究表明 1991，细菌在其固紧器、菌毛或矿物表面粘着力的作用下，选择性地吸附于硫化矿物表面的晶界、位错区及某些活性中心，并利用其细胞内特有的活性酶的催化氧化作用，沿着金属、硫化矿物晶界及晶体缺陷部位不断地氧化金属矿物，以获得自身新陈代谢所需的能量。氧化结果导致矿物晶格严重破坏，矿物形成多孔状，重金属被暴露出来。 1947 年， 美国 矿山酸性坑水中分离鉴定出嗜酸氧化亚铁硫杆菌 (称 ，并证实了微生物在浸出矿石中的生物化学作用 细菌浸出在冶金工业上获得成功应用主要是 3 种金属的回收：铜、铀、金 自 1958 年美国利用微生物浸铜和 1966 年加拿大利用微生物浸铀的研究及工业化应用成功之后，已有 30 多个国家开展了微生物在矿冶工程中的应用研究工作 而且继铜、铀、金的微生物湿法提取实现工业化生产之后，钴、锌、镍、锰的微生物湿法提取也正由 实验室研究向工业化生产过渡 李雄等， 2006我国微生物浸矿技术方面的研究是从 20 世纪 60 年代末开始的，已先后在铀 铜等金属的生产应用中取得成功 黄导等， 2004 博士学位论文 第一章 文献综述 2生物浸出中主要使用的是化能自养微生物， 这类细菌可从无机物的氧化过程中获得能量，并以 类自养细菌又可分为硫化细菌、 氢细菌、铁细菌和硝化细菌 4 种生理亚群。在硫化矿生物浸出中应用最多的是硫化细菌中的 最初是由 现并命名的 武华平等， 2004； 1953; 1947。微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属 李宏煦等， 2003。它是一种嗜酸、革兰氏阴性、专性好氧的化能自养菌，能氧化元素硫、亚铁离子及还原态化合物来获得细胞新陈代谢所需要的能量 1956。 泛分布于土壤 1982、淡水 1983、海 水 2000、矿 泥 童雄， 1997、酸性矿水 沈萍， 2000、矿泉及其它含硫丰富的地方 钟慧芳， 1982，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水中 ( U 0 、 、 而 、 、 几乎对它氧化 和细胞生长没有影响，但 和 阻止 的氧化；金属对 物的化学状态和 细菌与周围环境相对作用的程度的影响。 例如 )的毒性就比 )小， 0g/L )和 40g/L ) 2001。 张苏文 1998在 重金属的耐性实验中得出： 铜锌锰镉的适应性好，对汞银锡砷的适应性差。其顺序为： =。 砷化物作为重金属盐对细菌有很强的毒性 1996，主要由于作为磷酸盐类似物的砷酸盐，可被细菌的磷酸盐转移 系统所转移，从而干扰细胞内磷酸化中间体的形成，使细菌表现出 “磷酸盐饥饿 ”症状 et 1992；亚砷酸盐毒性更大，它可以与蛋白质的巯基作用，使酶失活 et 2005。 针对砷化物的毒性， 微生物已进化出一些相应的机制对抗砷毒性或相应的酶来将五价砷还原为三价砷或将三价砷氧化为五价砷。 et 2005 ; 004； 2004； 2002； et 2002. 在微生物中去除砷的机制和途径都比较相似，第一步是将 五价砷还原为三价砷 2001；et 1997； et 1998 ，第二步是将三价砷转到细胞外 et 2004。由于砷在自然界存在的普遍性，在许多种类的微生物博士学位论文 第五章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的抗砷基因 克隆及序列分析 71中发现了抗砷基因， 这些基因存在于染色体， 质粒或操纵子上 et 2004；2003。抗砷基因赋予细胞的抗砷能力主要是抗砷基因编码砷还原酶及专一的转运蛋白，还原酶将砷 ) 还原为 1994，泵出蛋白再将 转运细胞 et 2002； 1999，于是降低了细胞内毒性砷的浓度。 目前在细菌中发现了 6个抗砷基因操纵子，研究人员对它们的基因序列进行了测定并研究了它们的抗砷机制，其功能分别为： 与膜内蛋白 (结合，利用 亚砷酸排出细胞 et 2000。 2003； 1996。在有 s( )泵出细胞外。在没有 单独利用化学渗透作用将 )排出细胞外 2006； 2003。 2004，可以将低毒的五价砷还原为高毒的三价亚砷， 2001然后泵出细胞 et 2005； et 2000；et 1996 这与一般意义上的解毒功能似乎相矛盾，但它的活性与 而使细胞内的砷不会蓄积。 et 2005，这是一种转录抑制蛋白，是抗砷基因的阻遏物。 码第二个转录抑制蛋白。 另一个抗砷基因， 于 1996年在 et 1997， 的功能目前还不清楚，但 Y. 重要的浸矿细菌，其抗砷能力与其浸矿效率密切相关，在工业上运用于贵重金属中砷化物的预处理。作为浸矿细菌， 砷酸盐具有一定程度的抗性，但是由