【毕业学位论文】（Word原稿）铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性的研究农产品质量与食物安全硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性的研究 on of of on 2 on of of on I 摘 要 目的：通过研究铅镉复合暴露对大鼠肾脏组织的影响，初步 探讨 铅镉复合暴露（联合染毒）存在的复合效应类型， 研究 复合效应的可能机理，为制定铅镉联合作用卫生标准、预防其对人体和动物的健康损害提供毒理学依据。 方法：对初始体重为 180 鼠进行 90 天染毒实验。用蒸馏水作为对照溶液，用含铅 醋酸铅溶液 、 含镉 氯化镉溶液以及这两种剂量的混合溶液对大鼠进行灌胃染毒。观察 并记录大鼠 一般性状及体重变化。 90 天后，收集 12 小时夜尿，对大鼠肾脏功能指标尿 白蛋白（ 行评价。 大鼠处死后， 立刻摘取肾脏 ，除去包膜，分析天平上称重 测定脏器系数 ， 一份在 存 ，用 于 测定 丙二醛（ 还原型谷胱甘肽（ 超氧化物歧化酶（ 黄嘌呤氧化酶（ 、 一氧化氮（ 组织蛋白含量和 肾脏中铅镉的含量，一份用中性福尔马林溶液固定，用于切片观察 肾 脏形态学变化情况 。 同时，收集血液，测定血铅和血镉的含量。 结果： 铅镉单独染毒组和联合染毒组出现明显的中毒症状 ； 染镉组和联合染毒组出现体重降低现象；肾脏 脏器系数、 值表现为联合染毒组单独染毒组空白组；铅 在染铅组和联合染毒组的肾脏、血液和尿液 的含量 极 显著高于对照组 ，联合染毒组肾脏和尿液的含铅量极 显著高于染铅组；镉在 染镉组和联合染毒组的 肾脏、血液和尿液中 的含量显著高于对照组 ，但染镉组和联合染毒组 间无显著差异；铅镉单独染毒组和联合染毒组均出现 平降低，平增高 ，联合染毒组尤为明显。 染毒组的肾脏形态学略有改变，但组间无明显差异。 结论： 铅镉对大鼠肾脏功能和形态学均有损伤作用，铅镉联合染毒时毒性更加明显。镉对肾小球的毒性要强于铅，但铅对肾小管的毒性大于镉。大鼠肾脏功能改变表现为联合染毒组 单独染毒组 对照组，但是染毒组间形态学差异并不显著，表明肾脏功能改变出现在形态学之前。铅镉均在肾脏、血液中累积，并通过尿液排放，累积量与染毒浓度正相关。镉可以提高铅在肾脏中的蓄积，并提高铅通过尿液的排泄量；铅对镉的蓄积和排泄并没有显著影响。铅镉在肾脏及血液中累积可以引起肾脏变化和脂 质过氧化，联合染毒时尤为明显，累积量与病变具有显著的正相关性，这可能是铅镉引起肾脏毒性的机理。铅镉对 互作用均表现为简单相加作用。铅镉联合染毒对脂质过氧化指标表现为协同作用和简单相加作用两种交互效应，这表明铅镉联合染毒交互作用 存在不规律性 。 关键词：铅；镉； 复合暴露 ；大鼠 of on of of on of in b d It to b d in in of of 80a 0 in 0 20 . of in of of in of of of in of Pb Pb in of in of SH O in of in in of to in in in in it in in in in to of in of in of of in of to of of of by of in of It of t 录 摘 要 . I . 录 . 一章 引言 . 1 镉单独 暴露对 肌 体共性部位的影响 . 1 肾脏的影响 . 1 神经系统的影响 . 2 生殖系统的影响 . 2 发育的影响 . 2 癌作用 . 2 死效应 . 3 镉暴露评估研究进展 . 3 和镉的摄入量评估 . 3 和镉在食物中的暴露量 . 4 镉复合暴露风险评估的研究现状 . 5 镉联合毒性研究概况 . 5 镉毒性形成的机理研究 . 6 课题的立题依据及意义 . 7 第二章 铅镉复合暴露大鼠动物模型的建立 . 8 料与方法 . 8 剂 . 8 要设备及仪器 . 8 法 . 8 果与分析 . 9 鼠一般情况及体重变化 . 9 鼠肾脏脏器系数 . 10 液生化指标 . 11 论与小结 . 12 论 . 12 结 . 13 第三章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏功能及结构的影响 . 14 料与方法 . 14 要试剂 . 14 要仪器 . 14 法 . 15 计分析 . 15 果与分析 . 15 镉复合暴露对大鼠功能的影响 . 15 镉复合暴露对大鼠肾脏结构的影响 . 16 论与小结 . 19 论 . 19 结 . 20 第四章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性机理的探讨 . 21 V 料与方法 . 21 要试剂 . 21 要仪器 . 21 法 . 22 计分析 . 24 果与分析 . 24 脏铅镉含量 . 24 液中铅镉含量 . 24 液中铅镉含量的分析 . 25 脏脂质过氧化指标分析 . 26 镉蓄积水平与效应指标相关性分析 . 28 论与小结 . 31 论 . 31 结 . 32 第五章 讨 论与结论 . 33 论 . 错误 !未定义书签。 论 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 34 附录 . 0 缩 略 词 . 4 致 谢 . 5 作者简介 . 6 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 镉 单独 暴露对 肌 体 共 性 部位 的影响 铅 (元素符号为 子序数为 82，原子量为 重为 点为 沸点为 1620 。 它是一种蓝色或银灰色的软金属，具有良好的延展性、润滑性、抗侵蚀性以及高密度、高膨胀系数、低熔点等特性 ， 在工业上和生活中有着广泛的用途。铅可与乙酸、氨三乙酸、半胱氨酸等形成铅羧基络合物，易与 铅 还与 (N 10H)2 等硫基类试剂形成稳定络合物 。 铅的重要金属有机化合物还有四乙基铅等。这些络合物或金属有机化合物是铅在生命活动和污染行为中的重要化学形态。 镉 (元素符号为 子序数为 48，原子量为 层电子构型为 4一种稳定地分布于自然界中的金属元素。镉容易失去两个 5s 电子成为 +2 价的氧化态 ， 二价镉与硫的结合比较牢固 ,这使镉与生物学效应关系密切。生物体中发现的金属硫蛋白（ 就是一种富含 蛋白质 ,它对镉在生物体内的代谢起重要作用。 通过食物进入体内的铅镉可以同时对动物的肾脏、神经系统、生殖系统及生长发育产生明显毒害作用 ， 并引起致癌、致死效应 。 按照危害鉴定理论 ,可以将其总结为： 肾脏的影响 肾脏在肌体代谢废物的排泄和细胞外液体积的调节、电解质组成以及酸碱平衡等方面起主要作用，肾脏还能合成和释放激素。对肾脏的毒性刺激能干扰任何一种或所有 生理机能 ，并可能对肌体代谢产生影响。肾脏自身具有解毒机制。然而，当毒性刺激的性质以及严重性导致解毒和补偿性机制超负荷，这时就会发 生肾脏中毒。 肾脏是铅毒性作用的主要靶器官之一，急性或慢性铅中毒均可影响肾的排泄机制。在急性和慢性铅中毒时，肾脏的排泄机制大多受到影响，使肾组织出现进行性变性，伴随肾功能不全 ， 导致近曲肾小管的衬细胞变性，肾小球萎缩，肾小管间质纤维化，不同程度的细胞坏死和核包涵体的出现以及氨基酸、葡萄糖、磷酸盐的重吸收减少 （ 邵时陵， 2000） 。在临床上，急性铅性肾病是以氨基酸、葡萄糖、磷酸盐的重吸收过少为特征；慢性铅肾病人特征是肾组织缓慢地进行性变性与肾功能的改变，甚至可导致肾衰竭 :两者均不同程度的出现核包涵体 （ 魏肖莹， 1996） 。核包涵体 是 一种铅蛋白的复合物，也是铅中毒的一 种 病理形态学特征，蛋白与铅结合后，铅暂时被封闭住，使之成为非扩散型，保护了铅对细胞的直接损害。因此，相当部分学者认为这是机体对铅产生的一种防卫机能反应。一些动物试验也显示，铅染毒 可以 致大鼠肾组织损伤及脂质过氧化。 肾脏同样是镉作用的主要器官。 镉不仅可以损害肾近曲小管，而且也可以损害肾小球和远曲小管，导致肾小球和肾小管重吸收功能的改变，使肾尿浓缩能力下降，尿理化性质改变。 刘杰等通过比较急性和慢性镉暴露小鼠的尿液成分和病理变化发现 ， 慢性染镉与急性染镉都产生明显 的肾毒性 ， 表现为尿蛋白、尿糖、尿酶活力的增强和血尿素氮浓度的升高 ， 但急性染镉比慢性染镉产生更明显的肾毒性 。 慢性染镉造成的肾损伤涉及到整个肾脏 ， 表现为肾小管（主要是近曲小管）细胞混浊肿胀、凋亡、坏死、增生和管腔萎缩。此外 ， 肾小球肿胀、增生及肾间质炎症明显可见。中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 而急性染镉所引起的肾损伤则以广泛的近曲小管坏死为主 （刘杰， 1998） 。 神经系统的影响 当人暴露于高浓度的铅时，最明显的临床病症是脑部疾病。症状常为易怒、注意力不集中、头痛、肌肉发抖、失忆以及产生幻觉，严重的将导致死亡。该种情况通常在血铅水 平超过了 300 g/发生。在血铅水平为 100 g/还观察到了其他一些针对中枢神经系统的间歇作用（ 1997； 1996） 。 镉毒性也可导致注意力不集中、头痛及失忆等症状。 究发现 ,一次性亚致死量和持续性中等剂量的消化道镉暴露 ,都可导致成年大鼠运动神经元机能显著地下降 （ N 等 ，1977） 。 报道长期口服中等剂量的镉可以引起神经麻痹 ， 导致肌无力和肌萎缩 （ ，1978） 。 生殖系统的影响 铅可导致流产和死产 （ K 等 ， 1994） ；另外，严重职业性铅暴露会导致男性精子数量减少和畸态精子数量增多 （ 1995） 。 美国科学家一项最新研究发现，铅污染可能造成男性不育。研究发现男性精液中含铅量高，受精成功率降低 ； 在含铅量高的精液中，精子头部用来识别卵细胞表面糖类并与之结合的受体较少，穿透卵细胞外层与卵细胞结合的能力差，而且在到达卵细胞之前发生自毁的情况更为普遍，科学家认为这可能是由于铅取代了对精子功能非常重要的钙元素的缘故。 镉可以破坏或抑制卵细胞的 减数分裂过程，降低卵细胞的受精能力和存活率，从而导致动物生育能力降低甚至造成不育或不孕（沈维干 ,1999）。 用每天 剂量让大鼠染镉 ， 10 天后雄性大鼠发生了睾丸的坏死和精子的损伤 ， 而使用剂量增加到每天 138989） 。 道 ,染镉大鼠的妊娠期可以发生明显的延长（ 987）。 发育的影响 人 （ 1979） 曾报道了儿童血 铅水平与儿童智商（ 减少之间的负 相关性。 国际化学安全特别行动组分析了儿童血铅与智力的关系 ， 大于 4 岁的儿童 ， 当血铅水平每增加 10 g/ ， 智商降低 1（ G， 2001）。 镉可影响胚胎的正常发育 （ 罗扬， 1997） ,同时也能导致幼儿的体重下降 （ 1998） 。 癌作用 铅对动物具有肯定的致癌作用，对人的致癌作用目前证据不充分，国际癌症研究机构（ 其分类为 2B 类，即对动物是致癌物，对人类为可疑致癌物。有报道铅冶炼厂和电池厂工人的肺癌、消化道癌以及肾癌 的标准死亡率从 1 升至 其对应的血铅范围为 40 100 g/ 士学位论文 第一章 引言 3 （ K， 2000） 。 许多动物实验也支持了镉致癌性的存在，染毒的大鼠出现了睾丸癌、乳腺癌、腺上皮癌等症状（ ， 1990） 。 流行病学调查显示 ， 镉污染区的居民某些癌症的发病率与镉具有一定的相关性 （ A， 1976） 。 死效应 研究发现 ，血铅含量超过 50 g/， 动物 死亡率增加。在该暴露情况下的死亡原因常与铅污染引起的心血管疾病 、 肾病以及癌症相关 （ ， 1988）。 研究人员对镉的致死效应也进行了研究。 报道空气镉暴露 15大鼠的 h）为 30mg/为 940 mg/小鼠为 46.7 mg/猪为 204 mg/狗为 230 mg/1999） 。人吸入含镉 5mg/空气超过 8 小时可以致死 ， 敏感人群吸入含镉 1 mg/空气即可出现明显反应（ ,1986）。冯健等（冯健等 ， 2001）报道 ， 灌服 液 ， 肉雏鸡的 7D）为 对雏鸭进行的研究显示 7D）为 289秀英 ， 2001）。人经口接触大剂量镉后也会致死 ， 道的一起人为投毒致人死亡的剂量为 25mg/W(1998)。 镉暴露评估研究进展 和镉的摄入量评估 我国根据 定的有害重金属摄入量制定了 暂定每周允许摄入量（ 每日允许摄入量（ （表 1），长期摄入低于此标准的有害元素将被认为不会对人体产生慢性危害。通过对比中国与其他发达 国家铅镉摄入量 可以发现（表 2），我国人群的铅镉摄入量仍然处于比较高的水平。通过控制含铅汽油等措施，我国人群铅摄入量有所降低，但镉摄入量略有上升。 表 1 铅镉 参考摄入量 2 中国及一些发达国家成人有害元素的摄入量 元素 g/g/5 214 60 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 of 家 铅 镉 参考资料 摄入量 (g/%入量 (g/%国 0 3 陈君石等 国 8 2 陈君石等 ， 1997 美国 5 ， 2002； ， 1995 英国 24 11 14 11 ， 2000 澳大利亚 342 102001 西班牙 43 18 11 16 ， 1996 丹麦 18 7 16 22 ， 2002 加拿大 33 15 18 30 ， 1995； ， 1993 日本 - - 35 58 ， 1995； ， 2001 和镉在食物中的暴露量 饮食是铅进入体内的最重要途径，体内有 40%的铅来源于食物：面包、谷类、饮料提供了这些铅的 35%（赖建强 ,1999）。 食品中铅的污染 绝大多数属于外来污染，因此食品中的铅含量与一个国家环境中的铅污染状况有很大关系。欧美等发达国家由于较早地开始控制铅对食品的污染，因此食品中的铅含量多数处于较低的水平。美国的食品铅含量水平最低，高含量也仅为 G,2000）。其他发达国家有 85%以上的食品铅含量低于 别含铅量较高的食品集中在绿叶蔬菜、内脏和一些罐装食品（ ,2000； H,2002） 。 我国所调查的 12 类食品中，有 7 类在 上，并且多数是消费量较大的食品。这 7 类食品 分别 为蛋类、肉类 、 水产类、谷类、蔬菜、豆类和薯类。 蔡一新 等报导了福建省 2001 年监测的 42 份蛋类食品中有 4 份超标，其中 3 份是皮蛋，铅含量最高可达 蔡一新 ,2001）。张磊于 2004 年对我国 食品中铅含量 进行了调查 ， 在所调查的 164种食品中 ， 铅平均含量低于 食品仅占 37%（张磊 ， 2004）。 一般而言，动物内脏（尤其是肾脏）和甲壳贝类动物的含镉量高于其它食品，但是就消费量而言，谷类和蔬菜（包括薯类）中的镉含量更受各 国关注。在这两类食品中又以水稻、菠菜及根茎 类 的 食 物 含 量 较 高 。 发 达 国 家 谷 类 食 品 的 含 镉 量 为 单独染毒组 对照组。这与大鼠体重变化情况基本相一致。染镉组中 数量显著高于染铅组，同时染镉组体重也略低与染铅组，这提示镉对肾 小球 的毒性要强于铅 。 对 示铅对肾小管的毒性大于镉， 这可能与铅镉在肌体内的代谢途径有关。 对比 组 的数据发现， 于肾脏损伤更具敏感性。 铅暴露可以造成肾脏线粒体呼吸及磷酸化被抑制，致使能量传递功能受到损坏；导致肾小球过滤速率降低以及肾小管的不可逆萎缩 （蔡原， 1997） 。镉对肾脏的毒性靶部位主要为近曲小管，可使小管上皮细胞溶酶体增多、增大，线粒体肿胀变形，继而近曲小管上皮细胞变性直至坏死，严重者近曲小管变性，对肾小球也有损伤作用（ ， 2001）。本研究对肾脏病理切片的观察也发现了大鼠肾小管和肾小球的结构损伤。铅暴露组、镉暴露组和铅镉复合暴露组同时出 现了肾小管上皮细胞排列紊乱和肾小球的部分消失，表明铅镉在作用部位上存在一定的相中国农业科学院 硕 士学位论文 第三章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏功能及结构的影响 20 似性，这也提示铅镉复合暴露状况下，在肌体抵抗力完全破坏前，存在铅镉毒性相加的可能性，与实验所得的 结果吻合。从病理学切片观察得出，大鼠肾脏的形态学改变较轻，可见肾脏功能改变出现在形态学改变之前，这与相关文献报道一致（ 等， 2002）。 结 从对大鼠肾脏功能和病理切片观察可以看出：铅镉对大鼠肾脏功能和形态学均有损伤作用，铅镉联合染毒时毒性更加明显。 镉对肾小球的毒性要强于铅，但铅对肾小管的毒性 大于镉。 大鼠肾脏功能改变表现为联合染毒组 单独染毒组 对照组，但是染毒组间形态学差异并不显著，表明肾脏功能改变出现在形态学之前。铅镉对 互作用均表现为简单相加作用。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第四章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性机理的探讨 21 第四章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性机理的探讨 铅镉进入体内后，初期分布于肝、肾、脾、肺、脑中，以肝、肾中含量最高，数周后转移到骨骼、毛发、牙齿等，以磷酸铅的形式沉积下来，其中 90%以上存在于骨骼内。急性剂量下镉主要在肝脏中积累，但低剂量下镉主要在肾脏中蓄积，产生慢性中毒。铅镉作用肌体 可以破坏消化系统、免疫系统、生殖系统、 神经系统、造血系统产生致病性、致癌性和致死性。铅镉单独作用的机制已经进行了大量研究，但是铅镉复合暴露下肌体病变机制的研究还很少。本小结通过研究铅镉复合暴露下重金属在大鼠肾脏的含量变化和肾脏脂质过氧化，探讨铅镉的分布状况、铅镉含量与肾功能指标的相关性、脂质过氧化的变化，对铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性机理做初步研究。 料与方法 要试剂 实验用水均为石英亚沸高纯水 硝酸（优级纯）：北京化学试剂研究所 盐酸（优级纯）：北京化学试剂研究所 高氯酸（优级纯）： 天津市西青鑫源化工厂 30过氧化氢溶液（优级纯）：北京化工厂 铅标准溶液（ 1000 g/国家标准物质中心 镉标准溶液（ 1000 g/国家标准物质中心 丙二醛（ 定试剂盒：南京建成生物工程研究所 还原型谷胱甘肽（ 定试剂盒：南京建成生物工程研究所 超氧化物歧化酶（ 定试剂盒：南京建成生物工程研究所 黄嘌呤氧化酶（ 定试剂盒：南京建成生物工程研究所 一氧化氮（ 定试剂盒：南京建成生物工程研究所 蛋白定量测定试剂盒：南京建 成生物工程研究所 要仪器 石英亚沸高纯水蒸馏器 ：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 电子天平（岛津 220H）：日本岛津制作所 调压式电热板消化器：广东朝发电热仪器有限公司 石墨炉原子吸收分光光度计（ 日本岛津制作所 心阴极灯：北京有色金属研究院 心阴极灯：北京有色金属研究院 石墨管：日本岛津制作所 波消解仪：美国 司 中国农业科学院 硕 士学位论文 第四章 铅镉复合暴露对大鼠肾脏毒性机理的探讨 22 7500a 国 司 37恒温培养箱：日本三洋公司 电动磁力搅拌器 ：德国 司 排枪 12 通道：德国