【毕业学位论文】（Word原稿）野败型CMS育性恢复基因的微卫星标记定位生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 野败型 性恢复基因的微卫星标记定位 in a in a 系杂交水稻育种和生产应用的首要基础是细胞质雄性不育 （ 其育性恢复，在生产上应用的多种 型中，野败型 用最早且最广泛。本研究应用由 704 株系组成的 珍汕97A/(珍汕 97B/密阳 46)交 群体，针对前人定位了水稻 性恢复基因的主要区间，即第10 染色体和第 1、 11 染色体短臂，构建了微卫星标记连锁图谱，采用 析方法检测控制 野败型 性恢复的基因，筛选与育性恢复基因紧密连锁的微卫星标记。 以完整测交群体（ 704 个测交株系）的数据为基础 ， 检测到控制野败型 性恢复的 4 个中位于第 10 染色体长臂中下部的 有主效效 应，位于第 1 染色体短臂的 有较大效应，位于第 10 染色体长臂近着丝粒处的 第 11 染色体短臂近着丝粒处的 现出微效作用。其中， 间存在显著性互作，二者的作用介于重叠效应和累加效应之间。 进一步明确各恢复基因的效应，根据分别与 因型为珍汕 97B 者归一组，其测交株系为母本纯合型，不携带相应的恢复基因；基因型为密阳 46 者归一组，其测交株系为杂合型，携带相应的恢复基因。 分别应用各亚群体 进行恢复基因 测。结果表明： （ 1） 单独存在或与其他恢复基因同时存在时，均对育性恢复具有主效效应。（ 2）在主效基因 存在时，其他 3 个基因对育性恢复都具有一定作用，其中 效应大于另两个基因。（ 3）在主效基因 在时，其他 3 个基因仍具有提高结实率的作用，但在 时存在时， 效应不明显。 关键词： 水稻，野败型细胞质雄性不育，育性恢复基因，微卫星标记，基因定位 of in of In 704 of 7A/(7B/6)F6 to 0 of 1, in MS 04 f4 on of 0 a on of a in of 0 1, f4 To of in f4 on f4 In at at of of to in in f3 It to in in of f3 略词 胞质雄性不育 (子标记辅助选择（ 合酶链式反应 (量性状基因（ 机扩增多态性 组自交系（ 单倍体 (制性片段长度多态性（ 实率（ 单序列重复 (单序列长度多态性（ 列特性扩增区域 (列标签位点（ 增片段多态性分析（ 败型 细胞质雄性不育 (团分离分析（ 和品系分析方法（ V 目 录 摘 要 . 错误 !未定义书签。 . 略词 . 一章 文献综述 . 1 稻细胞质雄性不育的主要类型及其应用 . 1 稻细胞质雄性不 育的主要类型 . 1 稻细胞质雄性不育的应用 . 2 稻细胞质雄性不育及育性恢复遗传研究 . 3 性指 标 . 3 胞质雄性不育及育性恢复遗传研究 . 4 子标记在水稻恢复基因定位研究中的应用 . 6 用的 分子标记类型及其原理 . 6 稻恢复基因的分子定位 . 10 究问题的提出 . 13 第二章 野败型 性恢复 基因的微卫星标记定位 . 15 料和方法 . 15 稻材料和性状考察 . 15 取 . 15 卫星标记检测 . 16 据处理 . 17 果与分析 . 23 整群体恢复基因 位 . 23 同 因型背景下的恢复基因效应 . 29 第三章 结论与讨论 . 33 论 . 33 论 . 33 主效和微效恢复基因的位置及效应比较 . 33 大样本量对提高 测可靠性和灵敏性的作用 . 34 性恢复基因的分子标记辅助育种应用 . 35 阳 46 中的野败型和矮败型恢复基因比较分析 . 35 败型恢复基因的精细定位与克隆探讨 . 36 后研究展望 . 36 子标记辅助选择 . 36 败型主效和微效恢复基因的稳定性检测 . 37 性恢复基因的精细定位及克隆 . 37 参考文献 . 38 致 谢 . 46 作者简历 . 47 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 1 第一章 文献综述 水稻是我国重要的粮食作物，米饭是中国人民的主食，因此水稻产量的提高是多年来国家解决人民温饱问题的重要举措。 20 世纪五六十年代，我国通过半矮秆高产品种的选育和应用实现了水稻单 产的第一次飞跃，七八十年代又成功实现了杂交水稻配套 和 杂交水稻的大面积推广，我国水稻单产从原来的 2 吨 /公顷提高到 6 吨 /公顷，水稻总产量有了历史性突破，促使我国实现了粮食的自给自足。在杂交水稻应用过程中，利用水稻光敏或温敏雄性不育系配置杂交稻组合的“两系法”由于配组自由，程序简便等特点，得到育种家的重视，已开始呈现出广阔的前景。而利用胞质不育系的“三系”法虽受恢保关系的影响，程序有些复杂，但由于多年的研究和推广，已形成了一套完整科学的技术和推广体系，目前三系杂交稻仍是生产上的主要应用类型。 水稻三系杂交稻育种通 过培育细胞质雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系，达到选配强优势杂交稻组合的目的。 生产上应用的三系杂交稻为 不育系和恢复系配组产生的 交水稻提高水稻单产的作用来源于 种优势，即杂种一代具有高的生活力和生产力，要利用杂种优势来提高稻谷产量，首先必须保证 有正常的结实率，即恢复系必须对相应不育系具有强的育性恢复能力。几十年来，水稻细胞质雄性不育（ 性恢复遗传机理研究得到广泛的重视，特别是近十几年来，随着 子标记和分子遗传连锁图谱的应用， 性恢复基因的定位取得较快的进展，为育 性恢复基因的分子标记辅助选择提供了基础，并促进了恢复基因的克隆研究。 稻细胞质雄性不育的主要类型及其应用 稻细胞质雄性不育的主要类型 细胞质是引起三系不育系雄性不育的重要原因，多年来国内外学者通过各种方法培育了多种不同胞质类型的不育系，迄今已报道了 35 种。按其来源分类，目前在生产上应用的主要 育系类型有 9 种（谢建坤等， 2003；江宇飞， 2004），即野败型、 K 型、矮败型、 D 型、冈型、印尼水田谷型、红莲型、滇一型、包台型，其特点见表 1李实蕡 ， 1997； 曾千春 等， 2000；罗 琼 等， 2000； 梅启明 ， 1998； 文宏灿 和 王文明 ， 1995； 王文明 等， 1996）。在这 9 种胞质不育类型中，前 7 种类型用于籼型杂交稻，后两种类型用于粳型杂交稻。同时根据 雄性不育的败育时期、败育特点及恢保关系等方面还可以将水稻雄性不育系类型分为三大类： 野败型、红莲型、滇一型 (李泽炳等， 1983；朱英国， 2000)。凡使用我国不同地区的普通野生型水稻作母本与栽培稻杂交育成的野栽不育系，都属于野败型，另外， D 型、冈型、印尼水田谷型也属于这一类。该类型不育系属孢子体不育，花粉在单核期败育，形态为典败，因而不育系的花粉 败育彻底，不育性稳定。保持系一般为我国长江流域的早籼品种，恢复系一般为东南亚的籼稻品种（如 我国华南晚籼品种等，不育系和恢复系杂交 花粉可育率可达 90% ，体一般可分离出一定比例的不育株。 红莲型和野败型在雄性不育的败育时期、败育特点及恢保关系等方面都不一样，红莲型不育系属 配 子体不育 ，花粉在二核期败育，以圆败为主。野败型中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 2 的主要恢复系一般不能恢复 红莲 型的不育系，而恰恰是该类型保持系，其不育系与其相应的恢复系杂交， 体单株育性成连续性变异，很少出现不育 株。滇一型不育系类型一般为配子体不育，花粉败育以染败为主，不育系和恢复系配组的 杂种，只有 50%左右的花粉可育，自交结实正常， 没有不育株分离。日本和我国的大部分粳稻品种对该类型的不育系具有保持能力。该类型的恢复基因存在于籼稻品种中，生产上应用的恢复系主要是将籼稻中的恢复基因导入粳稻育成的。包台型不育系也属于这一类。 表 1我国生产上应用的按细胞质来源分类的 要类型 MS as on of 型 细胞质来源 败育特点 遗传特点 败育时期 野败（ 海南野生稻 典败 孢子体不育 单核期 K 型（ K） 云南粳稻 败 孢子体不育 单核期 矮败（ 矮杆野生稻 典败 孢子体不育 单核期 D 型（ D） 败 孢子体不育 单核期 冈型（ 冈比亚卡 典败 孢子体不育 单核期 印尼水田谷（ 印尼水田谷 6 号 典败 孢子体不育 单核期 红莲（ 红芒野生稻 圆败 配子体不育 二核期 滇一型（ 粳野生稻 染败 配子体不育 三核期 包台（ 败 配子体不育 三核期 稻细胞质雄性不育的应用 野败型细胞质雄性不育系属于籼型不育系，也是三系杂交稻最早应用的不育系类型，由于其不育系育性稳定，可恢性较好，多年来其推广组合及面积在杂交稻中一直居于主导地位。但由于该类型不育系的米质较差，由此所配的杂交稻品质也欠佳。近年来为了避免单一不育系质源给杂交稻造成的影响，加上国内外市场的需求，其它胞质类型的籼型不育系的研究和应用越来越受到重视，由此所配的杂交组合也迅速推广。目前 印水 型和岗 D 型杂交籼稻由于其米质好，种植面积持续增长， 2000分别占三系杂交稻总种植面积的 和 表 1。 表 1不同胞质类型的杂交稻主要 组合 种植面积和比例（ 2000） of MS of 000 002 型 2000 年 2001 年 2002 年 面积 (m % 面积 (m % 面积 (m % 野败型 水型 D 型 败型 莲型 型 台型 国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 3 三系杂交稻粳型不育系生产上主要应用包台型，但包台型不育系花粉败育较晚，育性不够稳定，有自交结实现象，常给制种纯度带来较大的影响；另一方面包台型不育系和其相应的恢复系同质， 种优势不强，在一定程度上制约了杂交粳稻的推广。所以，在我国推广的三系杂交稻中以杂交籼稻为主，杂交粳稻的推广面积很小。近年来，据报道滇一型杂交稻组合榆杂 29 在云南省宾川县以单产达 下了世界最高纪录 (李铮友和陈丽娟， 1996)，从而对滇一型不育系 的研究和应用有了推动作用，也为粳型杂交稻应用开拓了广阔的前景。 稻细胞质雄性不育及育性恢复遗传研究 性指标 育性指标是考察 育系的育性和恢复系的育性恢复能力的基本指标。在遗传研究和生产应用中所采用的育性指标主要包括以下几种：花粉育性、开放结实率（田间结实率）、套袋结实率、基本结实率、花粉和花药的性状和颜色，其中以前三种应用最多。 所谓花粉育性，是指植株在正常状况下，花粉经 1% 染色后所呈现的可育、典败、圆败和染败的育性表现形式。可育表现为花粉圆形而饱满，染色深，大小较 一致；典败花粉皱缩，为菱形或三角形，不染色；圆败花粉呈圆形，大小不一，不染色；染败花粉呈圆形，大小不一，部分染色或浅染色。由于花粉育性受环境影响小，遗传力大，所以较能反映植株的客观育性。不过，在同一单株的不同分蘖和同一穗上的不同部位，颖花育性可能有所变异 (杨华德和 陈芳远 ，1990)，在考察花粉育性，需要注意这种差异对结果的影响。 结实率与花粉育性是相关但不等的育性性状，但结实率作为水稻最直接的育性指标和育种选择中最直接的表现形式，也常被研究者应用。遗传力测定表明，开放结实率大于套袋结实率，但二者稳定性都较差 ，受环境影响较大（周天理等， 1983；李泽炳等， 1988；胡锦国， 1983）。开放结实率易遭外来花粉串粉的影响，套袋结实率虽然避免了串粉的影响，但袋内小环境不利于散粉受精，加重了生理环境造成的败育。 在进行育性遗传分析时，有人采用一种育性指标，有人则采用多种育性指标。傅强（ 1985）认为应该选用一种性状作为育性指标，不宜同时考察几种性状作为一种综合的育性指标。而周天理（ 1983）研究表明用田间结实率一种育性指标和用花粉育性及田间结实率等综合指标推测同一组合的育性基因对数不同，并指出综合指标才能正确反映育性的 遗传本质。 由于多数研究表明花粉育性最能反映细胞质雄性不育系的育性，因此一般采用花粉育性作为衡量不育系育性的指标。对于恢复系的育性考察而言，不同研究采取 的 指标不甚一致。结实率是育种选择和生产应用上最直接的表现形式，开放结实率又比套袋结实率更接近实际表现；在育性恢复遗传研究中，由于遗传群体中各个体生育期存在极大差异，一方面增加了采用花粉育性指标的难度，另一方面降低了不同材料间串粉的概率，因此，开放结实率不失为一种衡量 性的可行指标。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 4 胞质雄性不育及育性恢复遗传研究 从 20 世纪 70 年代后期起， 国内外研究者应用经典遗传学分析方法，开展了大量的水稻 这些研究中，主要应用不育系和恢复系配制杂交组合，构建 体和回（测）交群体，根据研究群体的育性分离情况，判断控制育性恢复的基因数及其相互作用，并结合相关群体育性遗传控制的比较，判断不同恢复基因的连锁关系和等位性关系。尽管由于不同研究所采用的水稻材料和育性指标有所不同，所得结论不尽一致，但一般认为，野败型 括与野败型 有相同或相似恢保关系的其他类型）的育性恢复主要由 2 对基因控制，红莲型和包台型的育性恢复主要由 1 对 基因控制，而各种类型 育性恢复还或多或少地受到微效基因的影响。 型细胞质雄性不育及育性恢复的遗传 在我国三系杂交稻生产应用中，所应用的不育系一直以野败型为主，多年来野败型推广组合及面积在杂交稻中一直居主导地位。而且，近年来育成组合和推广面积呈上升趋势的印水型、冈D 型和矮败型等胞质类型，与野败型不育系具有相似的恢保关系。与此相对应，多年来有关野败型细胞质雄性不育性及恢复性的研究也最多。 野败型细胞质雄性不育为孢子体不育（ 1986；王三良， 1980），其不育性及恢复的遗传 特性在不同研究中表现出较大的差异，多数研究者认为该性状由 2 对独立分离的主效基因控制，但在一些研究中则表现为单主效基因控制、 2 对相互连锁的主效基因控制或多基因控制。 在部分早期研究中，根据自花授粉作物 测交一代群体基因对数的估算公式：k=()（其中 n 为分离群体的总观察数， m 为隐性纯合基因型个体数， k 为基因对数），以不育株数为隐性纯合基因型个体数，计算取整数得出 k 为 2 的结果，表明野败型不育性及其恢复由 2 对基因控制 (雷捷成等， 1984；高明尉， 1981；傅强， 1985)。其 他研究者则根据 不育 :15 可育的分离，以及 测交群体中 1 不育 :3 可育或 1 不育 :1 半不育 :2 可育的分离比，得出 2 对隐性不育基因或 2 对显性恢复基因的结论（周天理等， 1983；黎垣庆， 1985；张桂权和卢永根， 1987；杨仁崔和卢浩然， 1988；梁康迳等， 1990； ， 1991）。 在部分应用不育系 /恢复系杂交组合构建的 体中，可育株和不育株分离比例则符合 3:1的单基因分离比，且未出现半不育 /半可育株或这种中间类型材料极少，表明相应恢复系对不育系的育性恢复由单个主效基因控制，显 示出这种恢复效应的恢复系包括 （章旺根和申宗坦， 1987； 1992； ， 1994；沈毓渭和高明尉， 1996）。 在上述研究中，无论其结论是单基因遗传，还是两对基因遗传，都是采用一般经验标准将群体划分为不同的育性组别，然后根据经典遗传理论和统计分析方法推断控制性状的基因对数、不同基因的相对效应及基因间互作存在与否。实际上，大多数群体的育性分离呈双峰型连续分布；不少研究者认为，在主效基因发挥效应的同时，可能 存在微效基因的修饰作用（张桂权和卢永根，1987；杨仁崔和卢浩然， 1987）。在少数研究中，群体的育性分离呈典型的正态分布或多峰分布，故认为野败型水稻雄性不育性和恢复性是由多基因控制的 (裴新澍， 1980；傅爱军， 1988；黄真生中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 5 等， 1989；杨华德和陈芳远， 1990)。总结多年来大量群体的研究结果，大家一般认为野败型不育系的育性恢复主要受 2 对主效基因控制，同时还受到其它微效基因的影响。 红莲型（ 为籼型细胞质雄性不育系类型，但红莲型和野败型胞质在恢保关系、遗传特点、花粉败育的细胞学特征上明显不 同。研究表明 ,红莲型属于典型的配子体不育类型，不育系的不育性受 1 对隐性核基因和不育胞质共同控制（朱英国和徐树华， 1988；梁世胡和李传国，1998；黄青阳等， 1999）。 型细胞质雄性不育及育性恢复的遗传 生产上应用的粳稻不育系主要为包台型（ 在 包台型 细胞质雄性不育恢复性的遗传分析方面国内外已有不少报道（ 1969；洪德林等， 1989；洪德林等， 1990）。 20 世纪 70年代日本新长城首次研究认为 细胞质雄性不育属配子体不育，育性恢复受一对核恢复基因 制（ 1975）。其后国内的胡锦国（ 1983）和李泽炳等（ 1988）对四种质源的不育系研究发现，粳型杂交稻（ 和滇一型）的不育系是受一对隐性核基因和不育胞质共同控制的，该结论和以上日本学者研究一致。但是贺和初（ 1988）通过对 和滇一型“三系”以及杂种 不 (保恢 )等世代的育性分析，发现这两种类型不育系的部分杂交组合表现为一对育性核基因和细胞质基因共同控制的遗传，而另一部分杂交组合表现为两对育性核基因和细胞质基因共同控制的遗传，由此认为，粳型杂交稻的育性 基因型因组合不同而不尽相同，同一不育系或恢复系在不同的组合中可能表现不同的育性遗传，同时他还认为这两种类型不育系属于孢子体和配子体基因型共同控制的育性类型。另外，也有学者认为 细胞质雄性不育的恢复是由强弱各 1 对独立的恢复基因控制，并发现 位上至少有 4 个复等位基因（贺和初，1988； 1988） 。 复基因之间的相互关系 同一胞质类型或不同胞质类型的恢复基因是否相同，恢复基因之间的等位性如何？国内外学者为此作了许多经典遗传研究。 野败型雄性不育的育性遗 传基础最复杂，王开锡（ 1980）首先指出不同的野败型恢复系的 2对恢复基因并非都是相同的，并认为有三种恢复基因，它们的恢复效应有差别。其中，强恢复基因 弱恢复基因 显性恢复基因，另外还存在一种隐性恢复基因为 r，只有在纯合基因型状态下才具有恢复能力， r 和 样都是主基因。他还指出，不同恢复系所携带的 2 对恢复基因并不一定总是相同，例如：恢复系 78品种的恢复基因型为 圭 63 和 N 稻的恢复性是由两对强恢复基因控制的，基因型为 内外学者对野 败性恢复基因的等位性也做过专门报道，他们通过不同的恢复系之间的双列杂交来验证恢复基因的等位性差别，所得出的结论与王开锡报道一致，也认为不同的恢复系可能带有不同的恢复基因（ 1988； ， 1995）。 还有研究报道，同一恢复系可能携带控制 2 种以上类型胞质不育恢复基因，这些恢复基因之间可能都是不等位的。腾利生和申宗坦（ 1996）研究了粳稻 恢复系 粳型广亲和 第一章文献综述 6 恢复系 不育系双百 A 和 不育系 02428A 育性恢复的遗传，结果表明，两个恢复系 各携带 1 对显性强恢复基因和 1 对不完全显性而恢复性较弱的基因，其中， 带对 有强恢复性的显性基因 对 有较弱恢复性不完全显性基因 带对 有强恢复性的显性基因 对 有较弱恢复性的不完全显性基因 进一步分析，认为这 4 个恢复基因互不等位，且不存在明显的互作。程朝阳等（ 1998）研究也得出籼稻恢复系明恢 63 不仅对野败型和矮败型不育系有强恢复作用，对 时指出爪哇稻 仅带有 和滇一型 的粳稻强恢复基因，还能对籼稻不育系有部分恢复能力，可见， 明恢 63 均带有两对 恢复基因和一对恢复 和滇一型胞质不育的基因。除了 和 恢复基因属非等位（滕利生和申宗坦，1996；朱英国， 1979）， 和滇一型亦属非等位（严菊强和薛庆中， 1995）。 以上恢复基因的等位性遗传研究结果，多是根据双列杂交经经典遗传分析加上统计推测所得，其结果的准确性有待于进一步研究，但大量研究结果已为恢复基因的多样性提供了强有力的证据。同时，张桂权等（ 1987）研究也指出，在相同胞质类型的不育系中 ，不育基因也可能存在多样性现象。他们（ 1986）用野败型不育系珍汕 97A 和二九矮 4A 分别与恢复系 交，其的育性恢复度相差很大，前者为 者为 样用栽培稻胞质类型的不育系八四早8A 和二九矮 7A 与 交，其不育基因产生的遗传效应差异也很大。由此可见，不同来源的不育基因和不同来源的恢复基因都可能存在遗传效应的差异，同时不育基因的多样性和恢复基因的多样性也可能是基因协同进化的结果。 子标记在水稻恢复基因定位研究中的应用 用的分子标记类型及其原理 分子标 记或称 记（ 质上是指能反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的 段，也即基因型在 平上的表现形式。 子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官，甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制。近年来， 随着基因组研究的不断深入，分子标记的研究和应用也得到迅猛的发展。分子标记大致可分为三类：第一类是以分子杂交技术为基础的标记，如限制性片段长度多态性（ 称 of 变数目串联重复位点） 等。第二类是基于聚合酶链式反应（ 简称 应）基础上发展起来的标记，包括随机扩增多态性 称 简单序列重复标记（ 称 列特性扩增区域）、 序列标签位点（ 称 。第三类是基于限制性酶切和 术的分子标记，包括扩增片段长度多态性标记（ 称 酶切扩增序列多态性（ 称 。 （ 1） 基于分子杂交的 记 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 7 最初发现并应用于图谱构建和基因定位的分子标记， 在第一张植物 谱（ ， 1986）报道后两年，发表了第一张水稻分子图谱（ ， 1988），是美国康乃尔大学以 记为基础构建的。 1994 年，同一研究组又发表了应用一个新群体构建的第二张水稻分子图谱（ ， 1994）。在这张图谱中，已在第一张图谱中定位的探针的线性排列得到了证实。新图谱共含 722 个标记，其中 620 个为 记。同一年，日本的水稻基因组计划（ 发表了他们构建的分子图谱（ ， 1994），含 1383 个标记，其中 1148 个为 记，该图谱至 1998 年标记总数已达 2275 个（ ， 1998），新增加的标记仍主要为 记。 2000 年，日本学者构建了一张更为饱和的水稻分子图谱，其中涵盖了 3267个 记（ ），如此高密度的 均可为各国研究者共享，为开展基因定位研究提供了极大便利。 记的基本原理是利用限制性内切酶识别并切割基因组 特定位点，由于生物个体种群间酶切位点的差异， 得到长短、数目不同的限制性片段，这些片段经凝胶电泳分离后，呈现不同的带状分布，通过与克隆的 针进行 交和自显影后，即可产生和获得反映生物个体或群体特异的 谱。 由于基因组 碱基对的突变引起限制性内切酶识别位点的增减，或是识别位点间发生碱基的互换、突变、插入、重排或缺失等变化导致限制性片段数目和长度的变异。由于 碱基对的突变和重排很普遍，所以 数量很大（洪国藩， 1999）。常用的 记探针主要来源于随机的基因组克隆（ 称 隆）和 隆。 需的 较大， 操作繁琐， 又需要昂贵的生化试剂，花费大，但由于其 重复性好，检测多态性高且相当可靠，又为共显性标记，所以它一直是分子图谱构建和基因定位等研究中的基础性标记。 （ 2） 基于 记 核心是 段的变性 延伸循环反应： 变性：以微量的 模板，在高温变性条件下，双链解成单链。 复性：在复性温度下，寡核苷酸引物与单链 的互补碱基结合。 延伸：在延伸温度下，经聚合酶的作用，以引物为起始合成互补的 。 经过多次循环，当一对引物结合部位间的距离在一定范围内时，能扩增出若干以引物序列为两端的段。由于不同生物个体基因组 基变异，导致寡核苷酸引物结合部位的序列改变，或者一对引物相邻两个结合部位之间发生插入、缺失或其它重新排列，则同一对引物扩增产物的长度发生变异，因此， 以作为分子标记的基础。 整个扩增过程已实现自动化，且仅需微量 而较好地解决了 主要局限性。 记 : 第一种广泛应用于生物遗传