【毕业学位论文】（Word原稿）极细链格孢菌HOG1、PBS2基因克隆及功能初步分析生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 极细 链格孢菌 因克隆及功能 初步 分析 of of I 摘 要 链格孢 菌既是一类重要植物病原真菌，又是具有应用前景的生物资源。从分子水平研究该类菌的功能基因的调控机制，对进一步开发利用该菌具有重要意义。 径参与诱导胁迫反应基因的表达、细胞形态恢复、信息素反应途径的 阻遏及致病性等过程。 白激酶 在细胞壁结构完整性、孢子分化、菌丝形成和浸入生长以及高渗透压甘油形成 过程中起到重要作用。本研究通过运用 基于 噬菌体特异位点重组反应 统 构建极细链格孢菌（ 达文库。通过遗传学手段，我们筛选获得了极细链格孢菌 （ A. 因，并且研究了 因的功能。建立了以 抗性基因作为选择标记的技术体系， 利用 源重组技术， 成功构建了 用于敲除极细链格孢菌（ A. 因的质粒，为进一步研究 因的功能奠定了坚实的基础， 主要研究结果如下： 1、链格孢属 （ 真菌是一类庞大的，难以进行形态鉴定的常见真菌。为了进一步确定 本试验所用菌种的分类地位，本文成功克隆了 因 。 通过序列比对，构建了 7 个相似菌株的系统发育树， 发现该菌株与极细链格孢菌（ A. 应的 度同源 ，因此将链格孢菌 株定名为极细链格孢菌（ A. 2、构建了含有 组位点的重组表达质粒（ 使用 门文库发生特异重组交换 而构建表达文库。经检测，表达文库的平均滴度为 06（ 文库总容量为 07。阳性克性率为 100 %，平均插入片段 大约为 1381 右。通过对阳性克隆 测序结果的分析， 列完整。 3、 从 05 个极 细 链格孢菌 （ A. 达文库酵母转化子中筛选获得了12个能使酵 母 细 链格孢 菌（ A. 达文库质粒的转化子。这些基因 编码的 蛋白质 序列均与酵母 因编码的 355 个氨基酸同源，命名为 编码的 蛋白质 命名为 基因编码的蛋白与稻瘟菌 白、黑粉菌 白、禾谷镰刀菌 白及酿酒酵母白的相似性分别为 96%、 92%、 90% 和 88%。序列比对结果显示，酵母 白的催化结构 域与其同源蛋白具高度保守，而且三个催化位点及赖氨酸残基均位于 合域内，说明 白在丝状真菌中是高度保守的。 4、从 05 个转化子中最终分离而获得了 1 个能使酵母 失突变株在高盐环境下生长的表达文库质粒。该基因全长 2,492 码 683 个氨基酸。与酵母 白具有 的同源性，命名为 编码的氨基酸为 烟曲霉 瘟菌源序列分别具有 相似性。 催化结构域在丝状真菌也是高度保守的。 5、通过对极细链格孢菌（ A. 达文库的筛选，获得能使酿酒酵母 因缺失突变株具有对抗盐胁迫反应的质粒， 通过对 因 在酵母突变菌株中的再次功能验证，发现 因 分别发挥了 路途径的 因的功能 ，即在盐胁迫条件下 体现出与 白相同的功能，使酵母缺 突变株在高盐环境中生长 。 6、基于极细链 格孢菌 （ A. 在含有 100 g/和 潮霉素 （ ）（ 100 g/的 养基上不能生长的药物敏感性实验结果，建立了用 性基因及 潮霉素 （ ） 抗性基因 作为选择标记的技术体系，从而 为研究 极细 链格孢菌（ A. 能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记，并为后续研究打下必要的基础。 7、利用同源重组技术，分别选择以 因上下游同源序列约 500 为同源臂，上游同源 序列 3 端连接 性基因，以保证缺失突变株的检测及鉴定。 成功构建了用于敲除 极细 链格孢菌 （ A. 因的质粒，为在 极细 链格孢菌 （ A. 中敲除 因奠定了坚实的基础，为进一步研究链格孢菌 （ A. 因的功能及作用机理提供了重要的试验材料和工具。 关键词 ：极细链格孢菌 ， 达文库 ， 因 ， 蛋白激酶 ， 蛋白激酶激酶 he in in as of by of In we a on of , In we 418 be as of . we NA a on in as 1, on of in is to . A. A. . In to TS it is a . 2, A . R As a a 06 （ a 07. of 00% of 3, of PD M 2 . 55 in 6%, 92%, 90% 8% in . is in as as in in is in 4, .6 x 105 we of to a ,492 bp in a 83 to . . in of 5, . PD M to to As a we in in 6, . PD 418(100 g/(100 g/in so we 418 be as . 7, We NA 00 bp NA 418 a on of . A. V 目 录 第一章 前 言 . 1 格孢菌研究概况 . 1 格孢菌分类地位 . 1 格孢菌现代分类学研究 . 2 物致病性及危害 . 3 生代谢物毒素 . 4 生物资源利用研究 . 6 物防治有益菌 . 6 解作用 . 6 物源除草剂 . 6 品种选育 . 7 白激发子 . 7 状真菌蛋白激酶的研究现状 . 8 白激酶在细胞信号转导中的作用和意义 . 8 状真菌蛋白激酶的种类及功能 . 9 究目的和意义 . 19 第二章 链格孢菌（ 株 鉴定 . 20 验材料 . 20 验菌株 . 20 要试剂、酶及载体 . 20 要实验仪器及耗材 . 20 验方法 . 20 验菌株的活化与培养 . 20 格孢菌（ 株 大量产孢 . 21 格孢菌基因组 取 . 21 果与讨论 . 26 果 . 26 论 . 34 第三章 极细链格孢菌 达文库的构建 . 37 验材料 . 37 要试剂、酶及载体 . 37 要实验仪器及耗材 . 37 验方法 . 37 断的亚克隆 . 39 达文库的构建 . 41 果与讨论 . 45 果 . 45 论 . 48 第四章 极细 链格孢菌 因 克隆及功能验证 . 51 验材料 . 51 要试剂、酶 及载体 . 51 要实验仪器及耗材 . 51 验方法 . 51 要培养基的制备 . 51 细 链格孢菌 达文库质粒中量提取 . 52 细 链格孢菌 达文库质粒转化酵 母菌 . 52 因及 因的克隆 . 53 果与讨论 . 57 果 . 57 论 . 69 第五章 极细 链格孢菌 因敲除质粒构建及鉴定 . 72 验材料 . 72 验菌株 . 72 要试剂、酶及载体 . 72 要实验仪器及耗材 . 72 验方法 . 72 格孢菌药物 敏感性试验 . 72 因敲除质粒构建 . 73 果与讨论 . 76 果 . 76 讨论 . 79 第六章 全文结论 . 82 株的鉴定 . 82 达文库构建 . 82 达文库质粒载体 . 82 达文库的构建及质量评价 . 82 因克隆及功能分析 . 83 因敲除质粒构建 . 84 选标记 . 84 除质粒的构建 . 84 参考文献 . 86 致谢 . 101 作者简历 . 102 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 基对 六烷基三乙基溴化铵 摩 2O 双蒸水 脱氧核糖核苷酸 乙二胺四乙酸 丙基硫代半乳糖 B 培养基 主专化性毒素 密度值 寄主专化性毒素 合酶链式反 应 糖体 分钟转数 乙二醇 链 乳糖苷 转录 间隔 区 因内间隔区 裂原活化蛋白激酶 裂原活化蛋白激酶 激酶 甘油渗透压 落形成单位 N,牛血清白蛋白 氨基酸酵母氮原 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前 言 格孢菌研究概况 格孢菌分类地位 链格孢菌 （ 在生物界中属于菌物界，真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丝抱目，暗色菌科 ， 链格孢 属 。 1816 年 A. 模式种描述了 ，而后在 1817 年的文字描述也未赋予链格孢充分的鉴别特征 （ 王洪凯等， 2001） 。 1821 年引证了链格孢的署名（ 又在 1832 年把 A. 为色串孢（ 异名，以 M. M. . ，造成链格孢属和黑霉属（ 态学分类的混乱长达 100 年之久（张天宇等， 2003）。由于 原始种 A. 模糊描述，以及误的归为 T. ， 1912 年综合了 A. T. 的特征概念，把 A. 名为 正了链格孢属及匐柄霉（ 的特征，明确指出了链格孢及其相似属匐柄霉（ 区别，并且提出废弃 用 意见，得到广泛认同 （ 王洪凯 等， 2001） 。由于已普遍采用 个属名，并且形成了明确的现代概念， 为 名称予以了保留。经过多位学者的潜心研究，明确了 真菌的产孢方式为内壁芽生孔生式（ 产孢梗（细胞）延伸方式为合轴式，从而使属的概念更加明确，与相似属 伟群， 1997；张天宇， 2003； 1992）。最终，解决了围绕这类真菌分类的历史争论问题。 20 世纪 60 年代初开 始致力于链格属真菌的分类研究，在丰富属的现代概念、属的模式种的证定与特证全面描述，链格孢及其相似属的有性态无性态的联系，链格孢属与其相似属真菌之间的区别，分类研究方法及属、种级分类标准的选取等方面作出了突出的贡献。截止到 2003 年 12 月，经他订正和描述的链格孢及其相近属种级分类单位达 335 个之多，其中包括 90 个新种和 25 个新组合 （ 孙霞， 2006） 。 报道中国链格孢的中国学者是章祖纯（ A. 在以后相当长的时期内一直进展缓慢。我国菌物学先驱戴芳澜和邓叔群的早期著作奠定了链 格孢多样性研究的基础。随着研究的不断深入，越来越多的学者从不同角度对链格孢菌进行了探讨，尤其是植物病原链格孢菌。 20世纪 50 年代迄今，许多学者发表了大量涉及链格孢 菌 的论文，全国很多省发表了地区性的经济植物和农作物病害方而的论著或名录，大都含有关于链格孢 菌 的集中报道。其中报道中国链格孢新纪录种最多的是戚佩坤、白金凯和朱挂香 （ 张天宇， 2003） 。戴芳澜在其中国真菌总汇中，收录 1972 年以前中外学者发表的中国链格孢 42 种 （ 变种、专化型 ） ，显示了 80 年代以前我国链格孢分类方面取得的成就， 80 年代以后这 方面的研究以前所未有的速度发展起来。自 20 世纪80 年代以来，张天宇致力于链格孢属的系统分类研究，共发表新种、新组合和种级分类单位 47个，并出版了专著中国真菌志一链格孢属 （ 2003） ，其中描述了寄生在 57 科 144 属 228 种植中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 前言 2 物上的链格孢种与变种 123 个，以及 2 个专化型，充分反映了我国链格孢菌的丰富程度。 至今，全世界已