课题3　分解纤维素的微生物的分离

课题背景 目前 对石油过分依赖 会让国家安全 经济安全及环境安全遭受威胁 因此 科学家正致力于研究 怎样将农业废弃物 木材及生长更为迅速的草本植物 转化为种类繁多的生物燃料 甚至是航空燃油 在这些新一代生物燃料完全替代传统化石能源之前 它们必须具备与60美元 桶的原油竞价的能力 生物燃料可以用植物或植物制品为原材料 目前 第一代生物燃料以可食用作物为原料 主要包括玉米 大豆 美国 甘蔗 巴西 用可食用作物制造生物燃料是最简单可行的 因为把这些可食用作物转化为燃料的技术是现成的 然而 第一代生物燃料并非长久之计 原因很简单 没有足够的耕地能够满足发达国家10 的液态燃油原料需求 这种对粮食作物的额外需求还使2008年家畜饲料价格大幅上升 虽然没有达到去年媒体所预言的 近似歇斯底里的高价 但部分粮食价格还是有一定上涨 一旦将玉米生长 收获及加工期间的所有排放纳入经济成本预算 第一代生物燃料显然并不是我们所期望的 对环境安全具有积极影响的能源形式 课题背景 第二代生物燃料主要以纤维素质材料为原料 如富含纤维素 生长迅速的草本植物 因此将英文汽油 gasoline 单词中前缀 gas 去掉 引入 grass 草 就组成了形象生动的专有名词 草油 grassoline 可转化为草油的原料有很多 从木材废料 锯木屑 木质建筑残片 到农业废弃物 玉米秸秆 小麦茎秆 再到 能源作物 这些原料作物耕作成本低 与每桶石油有等价能效的草油为10到40美元 量大 更关键的是 这些作物的种植生产不会干扰和危及粮食生产 大多数能源作物能够在不能用作农田的边际土地上快速生长 还有一些能够在被废水或者重金属污染的土壤中生长并净化土壤 如生长周期较短的灌木柳树 课题背景 专题2微生物的培养与应用 课题3分解纤维素的微生物的分离 一基础知识 1 纤维素 棉花 木材 作物秸秆等富含纤维素 一 纤维素和纤维素酶 2 纤维素酶 纤维素 C1酶 CX酶 纤维二糖 葡萄糖苷酶 葡萄糖 是一种复合酶 至少包括三种组分 即C1酶 CX酶和葡萄糖苷酶 取二支20mL的试管 各加入一张滤纸条 各加入pH4 8 物质的量浓度为0 1mol L的醋酸 醋酸钠缓冲液11ml和10ml 甲乙 在乙试管中加入1mL纤维素酶 两支试管固定在锥形瓶中 放在140r min的摇床上振荡1h 结果 乙试管的滤纸条消失 讨论 乙试管的滤纸条为什么会消失 甲试管的作用是什么 纤维素酶分解纤维素的实验 二 纤维素分解菌的筛选 1 方法 刚果红染色法 2 原理 刚果红可以与纤维素等多糖物质形成红色复合物 但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应 纤维素 C1酶 CX酶 纤维二糖 葡萄糖苷酶 葡萄糖 纤维素 刚果红 红色复合物 纤维素分解菌 纤维素酶 复合酶 红色消失 出现透明圈 根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌 3 刚果红染色法的操作方法 方法一 先培养微生物 再加入刚果红 方法二 倒平板时加入刚果红 想一想 这两种方法各有哪些优点与不足 你打算选用哪一种方法 优点 这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 缺点 操作繁琐 加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂 优点 操作简便 不存在菌落混杂问题 缺点 由于纤维素和琼脂 土豆汁中都含有淀粉类物质 可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应 有些微生物具有降解色素的能力 它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈 与纤维素分解菌不易区分 二实验设计 土壤取样 选择培养 梯度稀释 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落 思考 本流程与课题2中的实验流程有哪些异同 课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上 直接分离得到菌落 本课题通过选择培养 使纤维素分解菌得到增殖后 再将菌液涂布在选择培养基上 其他步骤基本一致 一 实验流程图 二 实验操作 1 土壤取样 分布环境 富含纤维素的环境中 生物与环境的互相依存关系 在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高 因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境 原因 实例树林中多年落叶形成的腐殖土 多年积累的枯枝败叶等 讨论如果找不到合适的环境 可以将滤纸埋在土壤中 将滤纸埋在土壤中有什么作用 你认为滤纸应该埋在土壤中多深 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中 实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境 一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中 2 选择培养 增加纤维素分解菌的浓度 以确保能够从样品中分离所需要的微生物 目的 制备选择培养基 液体培养基 思考 1 这个培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 又是如何进行选择的 具有选择作用 选择培养基中的碳源几乎全部由纤维素来提供 所以纤维素分解菌能在这样的培养基中增殖 而其他不能利用纤维素的微生物就不能在这样的培养基生存了 2 你能否设计一个对照实验 说明选择培养的作用 利用牛肉膏蛋白胨培养基做对照 在选择培养的条件下 可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制 因此可以起到 浓缩 的作用 3 为什么选择培养能够 浓缩 所需的微生物 操作 将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中 将锥形瓶固定在摇床上 在一定温度下震荡培养1 2天 直至培养液变混浊 也可重复选择培养 按照课题1的稀释操作方法 将选择培养后的培养基进行等比稀释101 107倍 3 梯度稀释 4 将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 1 制备鉴别培养基 2 涂布平板 将稀释度为104 106的菌悬液各取0 1ml涂布到平板培养基上 30 倒置培养 5 刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落 一般即为分解纤维素的菌落 方法一 先 再加入刚果红进行颜色反应 方法二 在时就加入刚果红 培养微生物 倒平板 在产生明显的透明圈的菌落 挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上 在300C 370C培养 可获得纯化培养 6 纯化培养 四成果评价 一 培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格 如果观察到产生透明圈的菌落 则说明可能获得了分解纤维素的微生物 二 分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量 因此最容易分离得到的是细菌 但由