【毕业学位论文】(Word原稿)番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究-生物化学与分子生物学

分 类 号 密级 公开 收藏编号 _ 学号 11校代码 10386 编号 _ 番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株 生防特性的研究 学科专 业 ： 生物化学与分子生物学 研究方 向： 应用微生物 研究生姓 名： 指 导 教 师 、职 称： 研究员 所在学 院： 生物科学与工程学院 答辩委员会主席签名： 二一二 年 四 月 一 遵守学术行为规范承诺 本人已熟知并愿意自觉遵守福州大学研究生和导师学术行为规范暂行规定的所有内容，承诺所提交的毕业和学位论文是终稿，不存在学术不端行为，且论文的纸质版与电子版内容完全一致。 二 独创性声明 本人声明所提交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得福州大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 三 关于论文使用授权的说明 本人完全了解福州大学有关保留使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定） 本学位论文属于（必须在以下相应方框内打“”，否则一律按“非保密论文”处理）： 1、保密论文： 本学位论文属于保密，在 年解密 后适用本授权书。 2、非保密论文： 本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 研究生本人签名： 签字日期： 20 年 月 日 研究生导师签名： 签字日期： 20 年 月 日 I 番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 中文摘要 植物枯萎病是由尖孢镰刀菌（ 起的一类毁灭性的土传病害，该菌能够引起多种作物的枯萎，造成严重的经济损失。本文研 究了无致病力番茄尖孢镰刀菌菌株 寄主范围、定殖特性、生理学特性及其对番茄枯萎病的防治效果等。结果如下： 菌株 寄主范围和定殖特性研究结果表明：该菌对供试的5 个科的作物均不造成危害，且在不同作物中的定殖存在明显差异。在茄科作物中的定殖能力最佳，其次是巴蕉科与葫芦科，而在百合科及禾本科上不能定殖。从侵入时间上看，在番茄植物最易侵入，接种第 5 d 时即可到达茎基部；其次为甜椒、香蕉及甜瓜等植物，第 10 d 时可到达茎基部或假茎部。利用无毒基因的特异性检测引物 析了接种菌株不同植物上的分离培养的分离物，结果均表明所获得的分离物均为所接种的无致病力尖孢镰刀菌菌株。 生理学特性研究表明：无致病力尖孢镰刀菌 生长速度与致病菌相比无明显差异。在以柑桔果胶和羧甲基纤维素钠（ 碳源的培养条件下均能产生多聚半乳糖醛酸酶（ 果胶甲基半乳糖醛酶（ 纤维素酶（ 多聚半乳糖醛酸反式消除酶（ 果胶甲基反式消除酶（ 细胞壁降解酶（ 但以柑桔果胶为碳源时 活力更高。无致病力尖孢镰 刀菌 够提高番茄和香蕉植株体内过氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 无致病力尖孢镰刀菌 番茄枯萎病的防治效果研究表明：该菌株对番茄有明显促长作用，能显著增加株高和叶片数量，对番茄枯萎病盆栽苗的防效可达 76 %。 关键词：无致病力菌株，尖孢镰刀菌，定殖特性，酶活，防治效果 on of to of . of of t by 20 in of by of of 0 as by 12of no by of or of of by of of 3in by of in by 6 %. 录 第一章 绪论 . 1 萎病的发生及危害 . 1 萎病的防治 . 1 业防治 . 1 学防治 . 2 病育种 . 2 物防治 . 3 致病力尖孢镰刀菌的作用模式 . 4 导系统抗性 . 4 争 . 5 养竞争 . 5 入位点竞争 . 6 致病力尖孢镰刀菌的应用现状 . 6 研究的目的及意义 . 7 第二章 无致病力尖孢镰刀菌 毒基因检测及其病理学特性研究 . 8 引言 . 8 料与方法 . 8 验材料 . 8 验方法 . 9 株 作物的安全性评价 . 9 株 作物体内定殖能力分析 . 9 株的特异性引物 测 . 9 果与分析 . 10 株 几种主要作物的安全性 . 10 株 作物体内定殖能力分析 . 11 株的特异性引物 测 . 13 论 . 13 第三章 无致病力尖孢镰刀菌 理学特性研究 . 15 引言 . 15 料与方法 . 16 验材料 . 16 验方法 . 16 株 致病菌生长速度的比较 . 16 胞壁降解酶粗酶液的制备 . 17 G、 性的测定 . 17 性的测定 . 17 血清蛋白标准曲线的制作 . 18 马斯亮蓝 测定酶蛋白浓度 . 18 株 致病菌株代谢组学研究 . 18 果与分析 . 19 株 致病菌生长速度的比较 . 19 养条件对菌株 胞壁降解酶的活性影响 . 20 桔果胶为碳源的影响 . 20 甲基纤维素钠为碳源的影响 . 21 柑桔果胶和羧甲基纤维素钠为碳源的影响 . 21 株 致病菌株的代谢组测定 . 22 株 致病菌代谢组学比较 . 26 论 . 28 第四 章 无致病力尖孢镰刀菌 香蕉与番茄上的定殖特性研究 . 30 引言 . 30 料与方法 . 30 验材 料 . 30 验方法 . 31 株 致病菌在植物体内的定殖监测 . 31 液 的制备 . 32 测定 . 32 测定 . 32 活力的计 算 . 33 萄糖标准曲线的制作 . 33 . 33 果与分析 . 34 株 致病菌在植物体内的定殖监测 . 34 株的致病性测定 . 34 株的分离验证 . 36 株 致病菌株 植物体内酶类的影响 . 39 株 致病菌株 过氧化物酶的影响 . 39 V 株 致病菌株 多酚氧化酶的影响 . 41 株 致病菌株 . 43 论 . 45 第五章 无致病力尖孢镰刀菌 番茄枯萎病防效的测定 . 47 引言 . 47 料与方法 . 47 验材料 . 47 验方法 . 47 株 致病菌平板共培养的营养竞争 . 47 株 番茄植株生长特性的影响 . 48 株 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 48 果与分析 . 48 株 致病菌平板共培养的营养竞争 . 48 株 致病菌株 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 49 株 番茄植株生长特性的影响 . 49 株 番茄盆栽苗枯萎病防效的测定 . 51 论 . 53 结论与展望 . 54 结论 . 54 展望 . 55 参考文献 . 56 番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 1 第一章 绪论 萎病的发生及危害 植物枯萎病是由镰刀菌引起的一种世界性真菌土传病害，其主要的致病菌是尖孢镰刀菌（ 。绝大部分的尖孢镰刀菌都是致病的，会引起植物根部腐烂或维管束病变，但它们中有一些菌株能够定殖于植物组织而不引起任何症状 1。致病的尖孢镰刀菌具有很强的寄主特异性，基于寄主植物的种类和品种，可以把它们大约分为 53 个种，117 个专化型，还有 29 个 变种 2。该菌具有较强的腐生性，能存在土壤中活好几年，其厚垣孢子通过牲畜消化道后仍具有很强的活力，所以连作地和施用未充分腐熟有机肥的地发病较为严重 3。 尖孢镰刀菌寄主范围十分广泛，目前已报道的被严重为害的作物有番茄、香蕉、辣椒、西瓜、黄瓜、棉花、香石竹、康乃馨、萝卜、鹰嘴豆、菠菜、草莓、川红花、甘蔗、芝麻、粉蕉、凤梨等多种植物 4。邓坤章对广西北海市香蕉枯萎病进行调查，自 2003 年起到 2009 年，枯萎病发生面积由 加为 30 。张扬等对北京市延庆 县 2002 年至 2006 年期间 甘蓝枯萎病的田间发生和危害进行了追踪调查，结果发现这 5 年来该县甘蓝发病面积提高了 产量损失由 180000 展到 1370000 积年产量损失 4030000 。目前陕西、甘肃、湖南、福建、广西、浙江、四川、海南、北京、贵州、山西等地已相继有此病的报道。近年来植物枯萎病 发展和蔓延迅速 ，对农业 发展 构成了巨大威胁。 萎病的防治 业防治 对枯萎病的防治传统上采用农业措施：（ 1） 轮作， 实行与其它种类蔬菜 水旱 轮作； 发现 只有在轮作时， 西瓜抗性品种才会表现较强的抗病能力，且由于镰刀菌在土壤中的存活时间较长， 而且要求 5 年以上轮作才有较好的防治效果 7。（ 2）选用不含致病菌的土壤育苗，提倡用新法育苗，减少对根部的伤害 ；在夏季高温季节对重病地块或大棚内覆膜，利用 太阳能高温使 病残体全部腐烂后杀死病原菌，从而控制病害的蔓延。福州大学硕士学位 论文 2 （ 3）嫁接栽培，以抗枯萎病能力较强的作物为砧木从而达到防治目的；嫁接苗不仅可以防治枯萎病，确保苗全、苗壮，而且嫁接苗的根系强大，对水、肥的吸收能力较强。莫云彬等用不同砧木嫁接西瓜，结果表明利用日本强势葫芦作为砧木的效果最佳，不仅抗枯萎病能力最好，而 且综合性状也比其它砧木效果好 8。（ 4）加强水肥管理，严禁大水漫灌，要施用充分腐熟的有机肥，增施消石灰，从根本改善土壤的理化性状 9。 虽然传统的农业措施对枯萎病具有一定的防治效果，但这种方法耗费时间较长，适用范围有限，这些缺陷都限制着农业防治的广泛适用性 10。 学防治 与农业防治相比，化学防治具有起效快、效果好等优点。国内常用的化学方法有：（ 1）采用新土育苗或者将床土消毒后使用，可用多菌灵可湿性粉剂加土拌匀。（ 2）必要时要对种子进行消毒，用适乐时对种子包衣，并进行苗床浇灌或者用一定浓度 的硫酸铜浸种，洗净后催芽播种。（ 3）发病初期要及时拔除病株处理掉，并对发病点进行喷药保护。可选择的药剂有适乐时、多菌灵、甲基托布津可湿性粉剂，在进行灌根时，要根据植株的生长情况选择合适的剂量 11。国外常用化学药剂熏蒸土壤达到消灭病原菌的目的，如用甲基溴熏蒸。 在西瓜播种前 25 d 用聚乙烯塑料薄膜覆盖地面进行杀毒，并用多菌灵在播种后喷洒，可明显降低枯萎病的发生 12。 采用化学防治的方法虽能产生较好的防治效果，但也能够让一些病原菌产生抗药性，从而使防治工作更加困难，最严重的是化学农药对环境的污 染，直接损害人类健康，例如甲基溴被发现是一种潜在的致癌物，在许多国家已禁止使用 10。 病育种 对环境最安全的方法就是使用抗病品种，常规方法一般是用野生植物作为抗枯萎病育种材料，经过几年的抗性培养筛选出那些具有良好抗性的植株。但是这种常规的育种方法选育抗性资源花费的时间长、耗资大。现代分子生物学的发展，为抗病育种研究提供了强有力的工具，分子标记方法和基因工程技术已成为抗病育种的新方法，利用植物的遗传转化可创造出常规方法得不到的基因型，这就大大减轻了育种工作 13。 通过将质 粒 入一株荧光假单胞菌获得融合菌株，这种融合菌株番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 3 能够提高对黄瓜枯萎病的防治效果 14。 抗病育种虽然能够尽快选育出抗病品种，但也面临很多问题。培养一种抗病植物，不仅要知道该植物的优势基因，而且要求这个植物是雌雄同株的。对于康乃馨、仙客来、亚麻这些植物来说，它们的优势基因未知，而对于棕榈树来说，它又是雌雄异株的 15。随着时间的推移，致病菌还会突变为一种新的菌侵入那些抗病植物。总而言之，通过农药以及培养抗病品种来控制枯萎病还存在一定的困难。随着人们对杀菌剂危害环境的认识逐渐提高，对零化学农产 品的兴趣逐渐增加，加上培育抗病品种费时费力，生物防治就成为人们最青睐的办法。 物防治 用来防治植物枯萎病的生防菌已经有很多报道，包括多种细菌、真菌、放线菌，或者将两种或两种以上的菌联合起来使用。这些生防菌之所以能够防治枯萎病，目前公认的机制主要包括营养的竞争、生态位的竞争、重寄生、产生抗菌素或诱导植物产生免疫抗性等 16。 生防细菌目前报道的主要是芽孢杆菌和假单胞菌，芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌（ 地衣芽孢杆菌（ B. 短短芽孢杆菌（ 及假单胞菌中的荧光假单胞菌（ 铜绿假单胞菌（ P. 5 种生防菌对枯萎病防治效果良好。 从鹰嘴豆根际分离得到一株铜绿假单胞菌，该菌能够显著减少鹰嘴豆枯萎病的发生 17。 发现荧光假单胞菌 够有效防治香石竹枯萎病 18。 用来防治枯萎病的真菌主要有木霉、青霉、拟青霉、丛枝菌根、无致病力尖孢镰刀菌等。 发现哈茨木霉（ 够有效防治鹰嘴豆枯萎病 19 。 利用草酸青霉（ 孢子对番茄枯萎病进行防治，防效达 49 %20。王明祖等从根结线虫的卵上分离到一株淡紫拟青霉，该菌能够控制棉花枯萎病的发生、蔓延 21。李敏等在田间和盆栽条件下，用丛枝菌根接种西瓜苗，可以有效防治西瓜枯萎病，并能够促进西瓜生长，提高产量和品质 22。陈延熙从健康棉花体内分离到了无致病力尖孢镰刀菌，并发现该菌能够防治棉花枯萎病 23。 福州大学硕士学位 论文 4 致病力尖孢镰刀菌的作用模式 关于无致病力尖孢镰刀 菌的作用模式目前公认的有 2 种：诱导系统抗性（ 竞争。竞争又可以进一步分为腐生性竞争和寄生性竞争，前者为在土壤和植物根际中竞争营养，后者为在植物根部竞争侵入位点，了解这些机制能够使菌株在应用时发挥最好的效果。 导系统抗性 早给诱导系统抗性（ 个明确的定义，即植物在遭受一些生物或非生物的压力时所做出的系统性防御反应 24。 1989 年 现几株无致病力尖孢镰刀菌能够防治西瓜枯萎病，这个概念首次被用在无致病力尖孢镰刀菌上 25。 首次研究发现无 致病力尖孢镰刀菌侵入豌豆根部后能够引起细胞学变化，无致病力菌株在植物的组织中形成大量半球形的围墙，同时有一种非导电物质在致病菌株的菌丝周围大量沉淀 26。因此推测通过这种防御反应的快速刺激，寄主根部就会得到信号，植物就会做出反应抵抗致病菌。但也有人认为这是物理上的阻碍。 过研究棉花枯萎病的诱导抗性，认为是无致病力尖孢镰刀菌阻塞了植物的维管束，就会限制了致病菌株在维管束组织中的活动范围和数量 27。 除了细胞学的变化，无致病力尖孢镰刀菌入侵植物后还会产生一系列化学物质的变化。 察 到一种交叉保护现象，即先用一种非该植物专化型的致病菌接种，随后再接种专化型的致病菌，通过这种方式该植物的枯萎病症状要比直接接种专化型致病菌的缓和很多 28。 发现种植在拮抗性土壤里的番茄植株体内的致病性相关蛋白，如一些水解酶类，它们的含量会比一般高，并且发现种植在无菌土壤里的植物，如果人为地接入无致病力尖孢镰刀菌，这些植物体内水解酶的活性也会提高 29。发现接入无致病力尖孢镰刀菌 番茄体内抗性蛋白（ 几丁质酶均有增加 30。 从拮抗性土壤中分 离出来的无致病力尖孢镰刀菌对番茄、西瓜和甜瓜的枯萎病都具有防治效果，说明无致病力尖孢镰刀菌的确存在 应 31。 无致病力尖孢镰刀菌在入侵植物时还会分泌一些水解酶类，比如果胶酶、纤维素酶，这些酶能够破坏寄主的细胞壁，以便进入寄主根部组织。在研究中发现无致病力尖孢镰刀菌可以定殖在番茄根部细胞番茄尖孢镰刀菌无致病力菌株生防特性的研究 5 内外而不引起细胞的损伤，这种情况通常在一些寄主与寄主专化型菌株之间存在，并发现在无致病力菌株定殖于番茄根部的过程中，果胶的水解是主要的作用机制之一，细胞间存在大量的无致病力菌株就可以证明这一点32。 从细胞化学角度来分析几丁质的分布模式，发现无致病力镰刀菌所含的几丁质明显大幅度降低，尤其是那些菌丝与寄主细胞壁紧贴的位置，这些结果都表明植物的根部在受到刺激后产生了几丁质酶，而这些几丁质酶很可能是在细胞外进行累积的 33。 另外， 发现在木豆幼苗中接入无致病力尖孢镰刀菌后对潮湿镰孢菌也有抵抗作用，这就表明诱导抗性还会产生一些抗真菌物质34。 研究发现通过接种无致病力尖孢镰刀菌，三色牵牛花产生了一种不耐热的化学物质，这种物质能够使三色牵牛花抵抗枯萎 病 35。 尽管以上这些结果都表明诱导抗性是无致病力尖孢镰刀菌的作用模式之一，但是仍然需要更多的研究来说明诱导抗性的分子机理。当单独接种无致病力菌株这种情况对病害的防治效果比将两种菌一起接入土壤中的效果弱一些，这就表明还存在其它的作用机制，特别是致病菌株与无致病力菌株间的竞争。 争 养竞争 已经可以证实无致病力尖孢镰刀菌和致病尖孢镰刀菌之间存在碳源的竞争。 发现在对枯萎病有拮抗作用的土壤中生物总量和酶活性都比非拮抗土壤中的高，并且尖孢镰刀菌在两种土壤中利用 葡萄糖的能力也是不同的 36。 发现随着土壤中葡萄糖浓度逐渐增大， 3 株无致病力尖孢镰刀菌（ 致病尖孢镰刀菌抑制能力也逐渐增大 37。还有大量的事实证明无致病力菌株和致病菌株之间还存在其它营养条件的竞争。 发现无致病力尖孢镰刀菌 离体条件下也能抑制尖孢镰刀菌香石竹专化型菌株 就表明碳源的竞争只是营养竞争机制中的一种 38。 发现不同的无致病力尖孢镰刀菌菌株在富含葡萄糖的土壤中生长能力不同，与致病性菌株 竞争定殖在土壤中的能力也不同 39。 发现无致病力尖孢镰刀菌在土壤中的生长情况与其对亚麻枯萎病的防治效果有密切相关性 40。还有一些其它的无致病力尖孢镰刀菌也被证实存在营养竞争，1。