【毕业学位论文】（Word原稿）TERF1在转基因水稻中的功能分析生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 转基因水稻中的功能分析 I I 摘 要 在长期的进化过程中植物形成多种适应机制以应答不同的生物胁迫和非生物胁迫，其中转录因子激活或者抑制基因的表达是植物适应逆境胁迫的重要方式之一。大量研究表明乙烯反应因子(是植物特有的一类转录因子，它在植物生长发育、逆境胁迫应答等方面具有重要的调控功能。本实验室 以 用酵母单杂交系统从番茄 到 转录因子家族的 一个新 成员 烟草中过表达 明显提高烟草的耐旱性、耐盐性和 敏感性，表明 一种多功能 录因子，深入探讨 控下游功能基因的表达是剖析 控植物非生物胁迫抗性机理的关键。鉴于水稻在我国农业生产和粮食安全中的的重要地位以及其相对清楚的生物信息基础，本实验拟通过建立转 稻，在明确 植物非生物胁迫中的功能的基础上，阐明 能参与的信号调控途径，为分子设计育种提供优良的抗性基因和材料。 首先，通过农杆菌介导 方法获得并鉴定了 11 个 稻转基因株系，同时进行繁殖，用转基因水稻进行非生物胁迫下的生理功能鉴定，即对六日龄幼苗分别进行干旱和 理。实验表明 够提高转基因水稻的抗旱性和渗透胁迫抗性，在 25理 30，野生型水稻 (尖发生明显萎蔫，转 因水稻株系 (生萎蔫的程度较轻，并且转基因株系根部明显比野生型发达 ;在恢复培养 20 天后， 活率为 活率为 活率达到 100。 在干旱处理 下 , 野生型水稻叶片发生明显萎蔫，叶片向心卷曲，转基因株系只有少数叶片萎蔫。研究发现， 在正常生长状态下，转基因水稻的脯氨酸含量、胞质总蛋白等渗透调节物质的含量明显高于野生型，表明 表达可能通过改变水稻体内渗透调节物质提高植物非生物胁迫的抗性。我们进一步从从分子水平剖析了高转基因水稻的非生物胁迫抗性的可能途径。即通过生物信息分析，从已发表的文章中挑选启动子中包含 者 式作用元件的功能基因 ，并以这些基因特异序列部分 设计引物 , 采取 方法检测这些功能基 因的表达。我们的研究表明转基因植株中 渗透胁迫相关基因 因的表达量明显增多 ,并且在氧化胁迫中发挥重要功能的 因的表达量也明显高于野生型，说明 过提高了一些相关基因或者下游基因的大量表达从而提高转基因水稻的非生物胁迫抗性。 关键词 转基因水稻 ， 非生物胁迫 ， a of to in of to be or of of by as of in BA of is a on be to in of of in a is to in to we NA of 2 5EG of is in is in 0 of in 100% in of of in in to to In to of we of RE in in of of to 文缩略表 英文缩写 英文名称 中文名称 脱落酸 BA 落酸应答元件 性亮氨酸拉链 合因子 补 温调控 嘧啶重复序列 旱应答元件 旱应答元件结合蛋白 烯应答元件 烯应答元件结合因子 ET 烯 JA 莉酸 A- 莉酸激发子应答元件 温应答元件 莉酸甲酯 S 盐 酯酰 作蛋白 rd to 旱应答 分钟转速 杨酸应答元件 番茄乙烯应答元件结合因子 1 烟草胁迫诱导基因 1 录 第一章 绪论 . 1 物对逆境胁迫的应答反应 . 1 物激素 . 1 录因子在植物逆境信号转导过程的重要作用 . 3 录因子的研究进展 . 7 录因子的结构特征和分类 . 7 录因子在植物胁迫应答中的作用 . 9 究目的和意义 . 10 第二章 水稻转化 . 12 验材料与方法 . 12 验材料 . 12 验方法 . 15 验结果 . 23 化载体构建结果 . 23 性转基因株系 . 24 基因水稻的繁殖结果 . 26 第三章 过表达 高了转基因水稻的非生物胁迫抗性 . 27 验材料与方法 . 27 验材料 . 27 验方法 . 27 验结果 . 27 表达 高了转基因水稻的抗旱性 . 27 表达 高了转基因水稻的渗透胁迫抗性 . 28 结 . 29 第四章 生理生化指标测定 . 30 质总蛋白含量的测定 . 30 验原理 . 30 验材料与方法 . 30 验结果 . 31 氨酸含量的测定 . 31 验原理 . 31 验材料与方法 . 32 验结果 . 32 溶性糖含量的测定 . 33 V 验原理 . 33 验材料与方法 . 34 验结果 . 34 结 . 35 第五章 过表达 高了水稻胁迫相关基因的表达 . 36 验材料与方法 . 36 验材料 . 36 验方法 . 36 验结果 . 37 表达 高了 平的表达 . 37 表达 高了 表达 . 37 结 . 38 第六章 结论 . 39 参考文献 . 40 致 谢 . 47 作 者 简 历 . 48 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪论 物对逆境胁迫的应答反应 植物 外界的 生长环境 具有 动态性， 植物对生长环境的依赖性 要求植物迅速应答和有效适应外界环境条件的改变 ， 长期的进化使植物形成一系列的耐受机制 ， 植物的生理生化、分子水平和细胞 水平都会根据植物所处的外界环境作出 相应 的变化。 当植物受到外界环境胁迫如低温、干旱、高盐和病害等 胁迫 后 ，首先，植物感知胁迫信号， 紧接着产生第二信使，第二信使又引起胞内钙离子水平的改变，这种改变经常会引起一个蛋白磷酸化的级联反应，最终引起目的蛋白表达或者由转录因子控制的特定种类的基因表达。这些基因的表达产物有的直接参与保护细胞，还有一些参与了内源信号分子（如植物激素）的产生，这些信号分子又会引起新一轮的信号转导 (et 2002)， 这些信号转导途径最终使植物作出生理的改变（比如气孔关闭）、基 因表达的改变、分子修饰以及细胞程序的改变。在对从信号感知开始到最终的应答反应的信号转导途径的研究发现，植物对逆境胁迫的应答反应是一个复杂的网络调控，不同的胁迫应答途径相互交错，同时不同的胁迫应答途径又具有特异性，从而保证了植物生命活动的高效有序的进行。在这些信号转导过程中植物激素、转录因子、以及转录因子与顺式作用元件的特异性结合发挥了重要的作用。 物激素 植物在受到环境胁迫时会合成一种或几种特异的植物激素，通过这些植物激素调节相关基因的表达，改变植物的代谢方式，甚至调控植物的发育进程以适应外界环 境条件。 例如 在植物受到干旱或者盐胁迫时，脱落酸（ 含量就会明显增加 ( 2002); 用 乙烯处理黑暗中萌发的种子 能够引发典型的“三重反应”。下面将对这两种多功能激素简单介绍一下： 落酸 脱落酸（ 调节植物生长发育和胁迫应答的一种多功能激素。它促进种子休眠、气孔关闭、以及提高植物抗逆性如抗脱水、干旱、高盐、低温及抗病虫害和机械损伤等多方面生理功能 (et 2002; et 1994; et 1994; et 1992)。 另外， 植物的非生物胁迫应答中起着更重要的作用，它通过信号转导诱导特定的转录因子表达，这些转录因子结合 者 式作用元件参与植物的非生物胁迫应答 (et 2003; et 2005; 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 2004)。 烯 科学家们很早就开始了 对 乙烯在植物体内功能的研究，人们发现 用 乙烯处理黑暗中萌发的种子后 ， 植物形态发生显 著的变化 ，表现出顶端弯曲，胚轴和根的生长受到抑制等形态特征，即“ 三重反应（ ”（ 1995） ， 这使人们认识到乙烯可能在植物的生长发育方面行使重要功能。后来 的研究发现 ,乙烯作为植物特有的一种激素影响植物发育的各个阶段，包括种子萌发、花和果实的凋亡、叶片的脱落、果实的成熟、根瘤的形成、细胞的程序性死亡，同时，乙烯在植物生物胁迫和非生物胁迫应答方面起关键性的作用（ et 1998）。为深入研究乙烯信号途径转导的分子机制 ， 人们利用“三重反应”现象，通过对许多 拟南芥的乙烯 应答 突变体 以及乙烯信号转导途径中重要的基因的研究，模式植物拟南芥中乙烯信号转导途径的轮廓已日渐明了， 2004 年就对乙烯信号传导途径的分子机制的研究进展做了很好的总结 : 图 1烯信号转导模式图（ et 2004） of et 2004） 如图 1示， 乙烯信号 的 受体 ，包括 ，是 一组类似细菌和酵母的组氨酸双组分蛋白激酶的跨膜受体蛋白 (et 2001)。 位于乙烯受中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 3 体蛋白下游的 是一个类似 的蛋白激酶 烯受体 和 是乙烯信号转导途径的负调控因子 (et 1998; et 2003)。在没有乙烯存在时 ，乙烯 受体激活下游的 过磷酸激酶途径（ 使 下游的 乙烯信号传导途径成员处于 失活 状态 ， 从而 关闭乙烯信号途径； 在有 乙烯存在时 ， 乙烯 通过与乙烯 受体 的 结合， 使 下游 的 去抑制下游传导途径的能力 ，乙烯信号途径 处于激活状态 (et 2003)。 近来的一些发现，一些逆境条件可以以不依赖乙烯受体的方式激活植物的乙烯信号途径， 如 ： 盐 胁迫 、病 害和水杨酸 信号可以通过 径 调控 乙烯信号途径 （ et 2003; et 2003）。 在乙烯信号途径中， 于 下游， 是乙烯信号 途径中的第一个转录因子， 在 调 控 其它下游 转录因子 和 功能基因表达 过程中具有重要作用 (et 1997; et 1998)。 对拟南芥 研究发现， 稳定性受到与 泛素降解 系统相关的 白 控 （ et 2003） ，表明了 泛素降解 系统与乙烯信号传导途径有密切关系 。 过形成同源二聚体结合到 类转录因子 动子中 的顺式元件 而 激活 表达。 录因子调控着植物抗病相关基因 因和调控植物形态发育基因 的 表达 (et 1999; et 2005)。 录因子在植物逆境信号转导过程的重要作用 如图 1示 ,植物通过乙烯信号途径激活 录因子 ,录因子又通过特异性与 合 ,启动胁迫应答基因的表达 (et 2004)。正如这样 ,植物在生长发育过程中感受外界环境刺激后，通过一系列信号转导激发反式作用因子 (转录因子 )，而反式作用因子与顺式作用元 件结合后，又激活 合酶转录复合物，从而启动基因的转录表达，这些基因产物行使不同的功能，最终完成植物对外界信号在生理生化等方面的胁迫应答反应。 在植物的胁迫应答中不同的胁迫信号可以通过多信号途径的相互作用形成一个迅速、有效、协调的信号网络来调节植物的胁迫应答。在这个过程中转录因子与顺式作用元件的识别起到重要的作用 (et 2001； et 2003; et 2003)。 录因子 者寡核苷酸芯片技术为研究植物 非生物胁迫下或 理后植物的基因表达分析提供了非常强有力的工具，近几年来拟南芥非生物胁迫处理下基因表达分析发现，在大量胁迫诱导的基因中有许多转录因子，说明各种转录调控机制在干旱、冷、高盐等胁迫信号转导中发挥重要的作用。 转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的 合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制基因的转录，调节胁迫相关基因的表达。从蛋白质结构分析，转录因子一般由 合区、转录调控区（包括激活区和抑制区）、寡聚化位点以 及核定位信号这 4 个功能区域与中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 启动子顺式作用元件或与其他转录因子的功能区域相互作用来调控基因的转录表达。典型的转录因子一般只有一个 合区，但有的转录因子如拟南芥的 水稻的 含两个 合区。少数转录因子不含 合区或转录调控区，它们通过与含有上述功能域的转录因子相互作用对基因转录进行调控。在植物中存在大量编码转录因子的基因， 对已完成测序的拟南芥和水稻的基因组进行分析后发现，两种模式植物中都有约 1300编码转录因子的基因（ et 2000; et 2002; et 2004）。根据其 以将它们分为几个转录因子家族 ，转录因子家族的名称一般也与其 植物中，与应答环境胁迫相关的转录因子家族主要有 （ et 2002; et 2002; et 2002; et 2003; et 2004; et 2004; et 2005; 2005; et 2005）。 这些转录因子能够单独或者协同调控胁迫诱导基因的表达，形成基因表达调控网络，在植物的抗逆机制中发挥重要的作用。以下简单介绍一下： 族包括 大类转录因子 ,它们分别能够与 G 盒顺式作用元件结合。人们已经发现 式作用元件存在于谷胱甘肽 S转移酶的启动子区以及花椰菜病毒的 35S 启动子区，而且与水杨酸和茉莉素信号途径有关。如拟南芥中的 一些 族成员能够与 互作用，而后者是水杨酸信号途径的重要调节蛋白（ et 002） 。 主要通过与邻近的作用元件协同作用以控制不同功能基因（包括抗病相关基因）的表达。 白是新近发现的一类植物转录因子家族 ， 白包含一个或者两个N 端包含七肽 60 个氨基酸的调控子和 白能够特异性结合顺式作用元件 心序列为 (C/T)） ，进一步 研究表明， 能特异性结合糖应答元件 在拟南芥和水稻中分别有 74 和90 个 员（ et 2004） ， 参与植物病原体 侵害应答和 机械伤害信号应答（ et 2000）。 在许多植物中都已说明 白参与了植物抗病机制 ， 例如，在拟南芥中 ， 够被 酶级联活化，并且 表达能够减轻细菌和真菌侵染症状； 白能够激活 答基因和抑制 答基因，说明了白可能是 的交织点 。此外 ， 白还可被多种非生物胁迫诱导表达（ et 2000），因此它很可能还参与各种非生物胁迫应答。 2, 族也是新近发现的一类植物转录因子家族，在拟南芥中有一百多个成员（ et 2000）。这些转录因子参与调节营养器官、花和胚的发育，侧根的形成和生长素信号途径，以及生物和非生物胁迫应答等（ et 2005） ，对白家族进行表达分析 ， 实验结果表明 族也可能参与光应答 反应、细胞程序性死亡 ， 以及植物衰老。 族是最近发现的一个非常小的转录因子家族，在拟南芥中仅发现有三个成员（ et 2005）。它的一个显著特点是优先结合单链的顺式作用元件，目前的研究结果仅显示它与应答生物胁迫有关（ et 2000;et 2001）。 录因子将在下文详细介绍。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 5 式作用元件 胁迫应答和耐受基因可以根据它们产物的功能分 为两大类：一类是 编码 直接参与胁迫耐受的功能蛋白，如分子伴侣（ 蛋白，与渗透调节物合成相关的各种酶以及具有解毒作用的酶等；另一类是 编码 参与胁迫信号转导的各种蛋白，如蛋白激酶，转录因子以及参与磷脂代谢的酶等。对这些基因的启动子区进行比较分析，最终分离和鉴定出了很多胁迫相关的顺式作用元件 (et 2005)。顺式作用元件指与靶基因处于同一条染色体起调控作用的 列，通常不编码蛋白，位于基因的旁侧序列或内含子中。转录因子特异性识别顺式作用元件 ,这种特异性识别在植物的胁迫应答中发挥重要的作用，现在已经确定了不少介导胁迫应答基因表达的应答组件，如： 杨酸应答组件）， 莉酸、激发子应答组件）， 守序列为： 等，其中， 曾称之为 先被确定为大量烟草碱性 因（ 程相关基因）启动子中的乙烯应答元件（ et 1995）。表 1 中归纳总结了与冷和渗透胁迫应答基因的顺式作用元件，例如， 旱应答组件 /胞嘧啶重复序列）普遍存在于非生物胁迫相关基因的启动子中； 落酸应答组件）多参与干旱和 应答反应 ( et 2005)； 在低温诱导的甘蓝型油菜的 因启动子中发现了一种低温诱导元件 件（ et 1996）。虽然这些顺式作用元件的 组成各不相同，但它们具有一些共同特征：（ 1）在位于转录起始点上游 300，对基因表达起重要作用。（ 2）多个顺式作用元件以组合形式协同性地激活或抑制转录。（ 3）与邻近不同的顺式作用元件协调作用，产生不同的效应。（ 4）不同的顺式作用元件之间的偶联，产生不同的效应，最终导致基因表达的多样性（刘强 等， 2000）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 6 表 1 渗透和冷胁迫应答基因的顺式作用元件 in 顺式作用元件 序列 结合顺式作用元件的转录因子 基因 胁迫 旱 ,明 旱 ,旱 ,旱 ,旱 ,冷 旱 报道 旱 明 明 不同的 转录因子与基因启动子序列的顺式作用元件结合，在转录起始位点上游的 形成转录起始复合物，转录起始复合物进一步激活 合酶从而启动胁迫应答基因的转录，在这一过程中，不同的转录因子与顺式作用元件的相互作用在决定转录起始事件中起着关键性作用，同时也对植