临床研究计划书课题名称肝硬化患者脾切除加贲门周围血管离断术后

临床研究计划书课题名称：肝硬化患者脾切除加贲门周围血管离断术后肠道菌群的变化研究一、 选题目的和依据（理论意义及应用价值、国内外研究现状、主要参考文献）国内外研究现状肠道菌群是一个对人体正常新陈代谢非常重要，是机体最庞大、最重要的微生态系统。健康成人的肠道栖息着1014个细菌，有1000种以上，总量达到1-2公斤，是人体细胞总数的10-20倍，其编码的基因数量是人体自身基因的100倍，称为“被遗忘的器官”1。研究发现，人类肠道菌群参与多种机体生理功能的调节，包括促进机体的免疫发育与成熟2，参与中枢神经系统的调节等3。另外，肠道菌群的紊乱与许多病理状态相关，包括肥胖4、自身免疫性疾病5、炎症性肠病6、肝硬化7、结肠癌8等。肝硬化与肠道菌群目前研究发现，肝硬化患者肠道菌群是紊乱的，并且与其他伴随肠道菌群紊乱的疾病存在着自身的特点。李兰娟院士通过宏基因组学最终发现，通过15个具有代表性的细菌基因就可以达到诊断该病的目的，也就是说通过辨认肠道菌群的状态可以诊断肝硬化甚至判断病情的严重程度9。肝硬化患者为什么会发生肠道菌群紊乱目前还不确定，有可能是胆汁代谢紊乱导致口腔中的有害菌大量在小肠及结肠中繁殖10。肝硬化肠道菌群紊乱与肝硬化的发展以及其并发症的发生有关。肝硬化患者肠道细菌过度生长，并且肠屏障功能受损，这会导致菌群移位从而引起一系列后果，包括内毒素血症、机体的慢性炎症状态11、甚至是自发细菌性腹膜炎等严重并发症12，这些变化与肝功能及肝纤维化程度的恶化可能有关。既然肝硬化患者存在肠道菌群紊乱，并且与疾病的严重程度与并发症相关，那么纠正肠道菌群紊乱是否能达到治疗疾病及减少并发症的目的呢?现已证明，通过口服高选择性抗生素途径改变菌群可达到一定的预期目的。肝硬化伴门静脉高压患者口服诺氟沙星4周后，患者的高动力循环状态有所改善13。同样的，服用利福昔明28天后门静脉压力降低，并且伴随的内毒素血症的减轻14。对于我国肝硬化伴门静脉高压患者，疾病发生的早期不易察觉，而一旦发生难以逆转的并发症就需要外科治疗的介入。针对肝硬化门脉高压消化道出血或脾亢患者，目前国内主要采取脾切除加贲门周围血管离断术。动物研究发现，肝硬化鼠脾切除后和未进行脾切除的鼠相比，肝纤维化的程度有所减轻15；对于干细胞治疗肝硬化的小鼠，脾切除可加强其治疗效果16。对于临床实验也有同样发现，腹腔镜脾切除后门静脉压力降低，并且ET-1和NOx等血管活性因子水平下降17。另外有研究发现，术前肝功能B级的患者脾切除一年后肝功能有所改善18。这些实验发现肝硬化患者脾切除后病情改善这一现象，而脾切除后是通过什么机制导致的肝功能及肝纤维化程度的改善，是否与肠道菌群有关，这背后存在的机制值得深入研究。 理论意义及应用价值 肠道菌群紊乱与肝硬化的发展有密切关系，本研究通过前瞻性组内对照实验，比较肝硬化患者经过脾切除及断流术后是否存在着肠道菌群及相关指标的统计学差异。探讨术后肠道菌群是否发生改变以及菌群改变对患者病情演变的影响，探索术后肠道菌群的改变及其对肝硬化病情影响的作用机制，为脾切除加断流手术的临床疗效提供更有利的理论基础，并且为将来以肠道菌群为靶点的精确肝硬化治疗进行前期探索。二、选题的基本内容、构思及初步见解选题的基本内容及构思：本研究对比肝硬化患者经过脾切除及贲门周围血管离断术后肠道菌群与术前的差异，并且同时检测术前术后胃肠动力学、5-HT水平、胰岛素抵抗、胃饥饿素及瘦素等相关指标来研究这些指标是否与肠道菌群改变存在着一定关系，从而探索术后肠道菌群改变的可能机制，并且进一步分析肠道菌群在肝硬化发生发展过程中发挥的具体作用。创新点：目前研究发现，脾切除后肝功能及肝纤维化有所改善，但机制并不明确。本实验首次研究肝硬化患者脾切除加断流术后肠道菌群的变化情况，并探讨这种改变与肝功能及肝纤维化的改善是否有关。二、 实验方法及技术路线：（拟采取的主要方法、技术路线、实验方案及可行性分析，可能遇到的问题及解决的办法）实验的主要方法1、ELISA实验检测血清、血浆及血小板中5-HT的含量2、己糖激酶检测血糖、放射免疫法检测血胰岛素3、ELISA实验检测血液中瘦素及胃饥饿素水平4、放射性核素现象法检测胃肠动力学5、16s-rRNA测序研究肠道菌群的多样性、丰度等6、多普勒超声门脉系统血流动力学检查技术路线：拟纳入病例数量： 20例纳入标准：(1)年龄18岁，70岁；性别不限； (2)临床诊断为乙肝肝硬化门静脉高压症，出现上消化道大出血，首次外科治疗； (3)胃镜下证实食道静脉重度曲张； (4) Child-Pugh分级为A或B级，评分9分； (5) 血小板50109/L； (6)自愿签署知情同意书。排除标准：(1)难治性腹水；(2)肝性脑病-级、肝肾综合征；(3)肝癌；(4)胃肠道手术史；(5)高血压、糖尿病、其他肝疾病、严重心肺功能障碍；(6)精神疾病；(7)术前3周内应用抗生素、术后标本采集前3周内使用抗生素；(8)甲状腺功能紊乱；(9)炎症性肠病；(10)胃粘膜萎缩；(11)7日内使用过抑酸类药物；(12) 3日内服用过影响胃肠蠕动的药物；(13)其他可以解释的胃肠道症状观察时间点：术前、术后1、3、6个月实验流程：具体实验步骤第一天：采血：1. 5-HT（空腹）： 2份（1份抗凝管1份非抗凝管）2. 胰岛素及血糖：5份（空腹、餐后30、60、90、120分钟）3. 胃饥饿素及瘦素：各5份（空腹、餐后30、60、90、120分钟）4. 采血量计算：0min30min60min90min120min全血15ml5ml5ml5ml5ml粪便收集：严格按着上海美吉生物提供的粪便采集的步骤进行采集病人的粪便时，为了避免尿液的污染，嘱病人排尽尿液，用无菌勺子取粪便内部，避免粪便表面与空气接触产生变化，不采集表面样品，一式三份，每份3g以上，取完后将样品存于专用的EP管，取样之后存于-80，干冰运输送检胃肠动力学检测（液相胃排空及小肠排空）：方法见第三天实验方法：1. 血浆5-HT（ng/mL）：用抗凝管收集全血，放在冰上30分钟，首次离心1000xg 4 10分钟，取上清液，再次离心，10000xg 4 10分钟（目的是去除残余的血小板），取上清液储存于-802. 血清5-HT:（血小板中5-HT=血清5-HT含量-血浆5-HT）非抗凝管收集，于室温下沉淀30分钟，1000xg 室温 10分钟，取上清液储存于-803. 5-HT、瘦素（pg/mL）、胃总饥饿素（pg/ml）定量检测都使用ELISA试剂盒，检测方法按试剂盒说明书进行4. 空腹血糖（mmol/L）、空腹胰岛素(mU/L)检测可于我院内分泌实验室常规检测5. 胰岛素稳态模式评估：应用HOMA2-RIA软件6. 肠道细菌16S-rRNA：（该部分实验与上海美吉生物合作完成）粪便样本量：3g测序平台：Hiseq平台测序区段：V3 V4测序量：20000-30000bp 试验流程：基因组DNA提取设计并合成引物接头PCR扩增和产物纯化PCR产物定量和均一化Hiseq PE文库制备Hiseq高通量测序 结果分析： 物种注释与评估物种组成分析样本比较分析物种差异分析第二天：多普勒超声门静脉血流动力学检查：取仰卧位，用双重超声波装置3.75-MHz探头 提供脉冲多普勒和彩色血流图。检查时嘱患者屏住呼吸。门静脉血流（ml/min）估算方法为门静脉流速（cm/s）和门静脉横截面积（cm2）。门静脉横截面积估算使用公式：横截面积= (R2/4)（R为门静脉直径）。门静脉栓塞指数（cm*s）估算公式为：栓塞指数=横截面积/门静脉流速。所有数据测量三次取平均，所有参数的变异系数小于百分之5。第三天： 胃肠动力学实验：1. 标记物：99mTc-DTPA 2. 实验要求及准备：病人准备：（1）术前询问患者是否对鸡蛋、面粉和其他规定食物过敏（2）禁食一夜或最少8小时（3）最少2-3天内禁止使用任何影响胃肠道动力药物，包括含阿片类镇静止痛类药物，抗胆碱类药物，减慢或促进动力的药物（胃复安，多潘立酮，红霉素）体 位：45倾斜卧位食 物：固体食物： 120g蛋清，2片白面包 30g草莓酱 120ml水，这顿饭包括255K卡能量，24%蛋白，2%脂肪，72%碳水化合物，2%纤维）液体食物：含99mTc -DTPA（1.0mCi）+500ml水照射部位：全腹，从胃底到骨盆，前后位都要照射照射角度：与腹部平面垂直照射计划：第一天：服用标记性液体后，立即照射，随后三十分钟每分钟照射一次（评价液相胃排空），随后服用未标记的固体食物，于1,2,3,4,5,6小时全腹照射（评价小肠转运），结束后恢复正常饮食及活动24小时后：全腹前后4分钟（帮助确定感兴趣区域）第三天：将99mTc DTPA（0.5-1.0 mCi）标记物混匀在蛋清中，嘱患者10min内吃完，于0,1,2,3,4小时照射胃部（评价固相胃排空）3. 结果分析与评价：(1) 固相胃排空：2小时和4小时胃残余内容物放射量百分比(2) 液相胃排空：15min和30min胃残余内容物放射量百分比(3) 小肠排空分析：末端回肠充盈百分比（6小时时观察末端回肠+盲肠+升结肠，在图像人为中圈定某一解剖部位）(4) 小肠转运百分比=末端回肠和结肠总计数/平均全腹计数（餐后2-5小时）正常值40%(5) 衰减矫正可行性分析：本人针对肠道菌群与肝硬化方面的研究查阅大量相关文献，已进行深入总结，对该领域国内外的最新状况得以掌握本课题病例来源于哈医大一院肿瘤、腔镜外科，肝硬化患者数量充足，完全可满足该课题需要已经制定好收集粪便、血液样本的程序，并准备出充足的储存样本空，课题所需要的实验技术已经熟练掌握本课题依托于中俄研究中心血液病研究所，拥有基本的实验仪器及大型仪器，设备充足，本研究所正在积极荷兰格罗宁根大学以及哈佛大学医学院建立科研联系与合作关系本研究与上海美吉生物公司合作，对方提供一系列技术支持可能遇到的问题及解决办法：1、本课题对于放射性核素显影胃肠动力学研究经验不丰富，并且目前针对小肠转运及结肠转运研究尚未有统一的指南来指导。通过查阅大量文献总结国内外该实验的研究方法及数据分析方法，借鉴国外针对该实验的经验，并且与我院核医学科合作完成这部分实验。2、细菌16s-rRNA测序3、粪菌采集过程中造成污染或样本破坏 严格按着上海美吉生物提供的粪便采集的步骤进行，采集病人的粪便时，为了避免尿液的污染，嘱病人排尽尿液，用无菌勺子取粪便内部，避免粪便表面与空气接触产生变化，不采集表面样品，一式三份，每份5g以上取完后将样品存于专用的粪盒，取样之后存于-80，干冰运输送检 4、粪便提取DNA的质量问题 为了避免破壁不完全导致结果偏向性，使用机械破壁法，机械处理可以更全面地裂解细胞。运用自动化工作者替代人手工提取，提高效率，减少操作失误，避免DNA提取过程中发生降解。5.、16s-rRNA测序及生物信息学分析与上海美吉生物公司合作，对方提供illumina miseq平台测序服务，及后期的数据统计分析四、研究条件：（包括相关课题研究的工作积累，已具备的实验条件、经费来源及预算，尚欠缺的实验条件和拟解决的途径）相关课题研究的工作积累： 指导教师在国外留学期间对于Wnt通路及TRALL通路对于肿瘤的发生发展及抑制有较深入的研究，并发表高水平论文。本人在日本交流学习期间，接受了规范及严格的实验培训，对于DNA提取、PCR、细胞传代培养及动物养殖等基础实验操作有扎实的基本功及经验。本实验前期通过大量阅读文献，基本掌握本领域研究的最新进展及实验成果，为实验进行做好充分准备。本课题在指导教师的悉心指导下，设计合理，较为新颖。本课题托于中俄研究中心血液病研究所，拥有基本的实验仪器大型仪器设备充足，能够满足实验所需要。本研究所正在积极荷兰格罗宁根大学以及哈佛大学医学院建立科研联系与合作关系。本研究与上海美吉生物公司合作，对方提供一系列技术支持尚欠缺的实验条件和拟解决的途径：1、16s-rRNA测序及生物信息学分析与上海美吉生物公司合作，对方提供illumina miseq平台测序服务，及后期的数据统计分析2、放射性核素显影胃肠动力学研究过查阅大量文献总结国内外该实验的研究方法及数据分析方法，借鉴国外针对该实验的经验，并且与我院核医学科合作完成这部分实验。五、研究计划2015年8月-2016年1月 完成20例患者数前标本收集及胃肠动力学检查2015年12月-2016年1月 开始进行术后标本收集及胃肠动力学检查2016年2月-2016年4月 完成最终术后6个月的标本收集2016年5月-2016年6月 进行血液化验指标的统计学分析2016年7月-2016年8月 进行16s-rRNA测序结果生物信息学分析2016年8月-2016年12月 数据分析并撰写论文六、预期研究成果研究期间及研究完成时拟发表SCI论文2篇主要参考文献：1.Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf KS, Manichanh C, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencingJ. Nature. 2010,464(7285):59-65.2.Kabouridis PS, Pachnis V. Emerging roles of gut microbiota and the immune system in the development of the enteric nervous systemJ. The Journal of clinical investigation. 2015,125(3):956-64.3.Rhee SH, Pothoulakis C, Mayer EA. Principles and clinical implications of the brain-gut-enteric microbiota axisJ. Nature reviews Gastroenterology & hepatology. 2009,6(5):306-14.4.Zhang H, DiBaise JK, Zuccolo A, Kudrna D, Braidotti M, Yu Y, et al. Human gut microbiota in obesity and after gastric bypassJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009,106(7):2365-70.5.McLean MH, Dieguez D, Jr., Miller LM, Young HA. Does the microbiota play a role in the pathogenesis of autoimmune diseases?J. Gut. 2015,64(2):332-41.6.West CE, Renz H, Jenmalm MC, Kozyrskyj AL, Allen KJ, Vuillermin P, et al. 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