第八章 免疫标记技术

1,第八章 免疫标记技术,中国药科大学微生物与免疫学教研室王 慧,2,3,免疫标记技术,免疫标记技术是指用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应; 三大标记技术: 同位素标记技术 免疫荧光技术 酶免疫测定,4,标记免疫技术,1.免疫荧光法（immunofluorescence，IF）2.酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）3.放射免疫测定法（radio immunoassay，RIA）4.化学发光免疫分析 （chemiluminescence immunoassay，CLIA） 5 免疫印迹法 （immunoblotting, Western blot),5,第一节 放射免疫测定法（radioimmunoassay, RIA）,6,放射性同位素(131I, 或125I)标记Ag或Ab测定Ab或Ag,通过测定放射活性判断结果。该法常用于测定微量物质: 如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及lgE等。,7,Veterans Administration Hospital Bronx, NY, USA,8,与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功； 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。,9,优点： 特异性强，即抗原抗体的特异性反应； 灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g； 操作流程简单易行，测量和数据处理自动化； 样品用量少、无需复杂的提纯步骤； 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点： 需要昂贵的检测仪器；同位素污染。,10,原 理,是建立在标记抗原（或配体）和待测抗原（或配体）对有限量的特异性抗体（或受体）的竞争性抑制反应基础上的，最终形成的放射性标记复合物与被测配体（或抗原）呈负相关，因而亦称竞争性放射免疫技术。,11,Ag* + Ab Ag*-Ab （F） （B） + Ag Ag-Ab,12,RIA测定原理的定量示意图,Ag* Ag Ab AgAb 游离Ag B/F B/T,6/2 6/8,3/5 3/8,2/6 2/8,4/4 4/8,13,返回,14,第二节 免疫荧光法(immuno fluorescence technique ),15,原 理,免疫荧光技术又称荧光抗体法。将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪（荧光显微镜或用流式细胞仪）测定或定位被检抗原或抗体。 异硫氰酸荧光素(FITC) 呈黄绿色荧光; 巯基化藻红蛋白(PE) 呈橙红色荧光。,16,17,激发光和发射光,18,抗原抗体反应的高度特异性 荧光的敏感可测性 显微技术的高度精确性 准确、特异、灵敏、快速地检测和定位微量物质。,19,优点： 特异性强，速度快，敏感性高，能准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内的定位分布。缺点： 非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足。,返回,20,建立技术的必备条件,1 荧光素 2 荧光素与蛋白质结合物的制备 3 荧光检测仪,返回,21,荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质。,22,荧光的种类自发荧光 二次荧光,23,常用的荧光素,返回,24,荧光检测仪,（1） 荧光显微镜 （2） 荧光分光光度计（3） 流式细胞仪（4） 荧光偏振光分析仪,25,荧光显微镜,26,荧光显微镜的构造,27,分类： （1）直接荧光法: （2）间接荧光法: （3）流式细胞术(flow cytometry): 样品(细胞)经各种荧光素标记的不同抗体染色后可同时分析细胞表达的多种分子。,28,(1)免疫荧光法 ：直接法: 简单、快速、特异; 敏感性差。,将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。,29,返回,30, 间接法: 可检测多种不同的抗原抗体复合物，具一定通用性；敏感性高; 但操作流程长、干扰因素多。,将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。,31,32,补体荧光染色法：,将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高；但操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。,33,34,35,特殊染色法, 双标记免疫荧光技术 双色免疫荧光技术 反衬染色法,返回,36,双标记免疫荧光技术,在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行免疫荧光染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同类型的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）和RB200或TRITC9（桔红色荧光）。,37,双色免疫荧光技术,如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（碘化丙锭）。,38,双重染色标本的单色和双色观察,WU,WIB,DUAL BAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,39,多重染色标本的多色观察,（FITC+Texas Red+DAPI）,返回,40,41,反衬染色法,是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如：用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。,42,43,流式细胞术(Flow Cytometry, FCM) 是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。,44,45,FACS组成示意图,Fluorescence-activated cell sorter (FACS),47,流式细胞仪实验原理,48,49,表达量检测,50,细胞凋亡研究,PI染色,51,AV-PI双染色,52,血液学应用：包括DNA倍体分析及细胞周期分析，淋巴细胞亚群测定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，红细胞疾病诊断，血小板功能分析和血小板病诊断，微小残留白血病检测，白细胞吞噬功能测定，NK和LAK细胞活性测定，造血干/祖细胞测定等,53,胞内细胞因子的检测,54,T细胞亚群分析,55,第三节免疫酶技术（enzyme immunoassay technique）,1971年Engrail和Penlmann 以及Vanweemen和Schuurs两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（enzyme immunoassay，EIA）。,56,第三节 酶免疫测定法(enzyme immunoassay，EIA),酶免疫技术是通过适当的酶促化学反应和免疫反应，使抗体（或抗原）与酶蛋白分子结合，形成酶标抗体（或抗原）, 该结合物保留免疫学活性的酶活性, 因而既有抗原抗体反应特异性, 又有酶促反应的特异性。酶分解底物后的显色深浅可反映标本中抗原或抗体的含量。常用酶：辣根过氧物酶、碱性磷酸酶。常用方法: 酶联免疫吸附试验ELISA,57,一、原理,E：酶；S:底物；P:有色产物；D1：供氢体；D2：D1的氧化型有色化合物,将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。,58,优点：灵敏度高，特异性强；可定性、定量检测可溶性抗原和抗体；试剂稳定，保存时长，无同位素污染；可肉眼半定量，也可仪器（低廉）定量检测；操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。,缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。,59,建立技术的条件,1标记酶2免疫酶结合物的制备3酶标检测仪,60,常用的标记酶, 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP） 葡萄糖氧化酶 （glucooxidase，Glu） -D-半乳糖苷 （-D-galactosidase，-D-Gal）,61,62,63,二、基本类型,均相酶免疫测定法 酶增强免疫技术；酶减弱免疫技术；辅基标记技术2. 非均相酶免疫测定法 ELISA (直接法、间接法、夹心法、竞争法、抗酶抗体法）,1971年建立，称为酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay , ELISA ）,64,直接ELISA,间接ELISA,（用于检测Ab）,65,direct ELISA（for Ag）,66,direct ELISA（for Ab）,返回,67,68,69,返回,70,（3）夹心法 （sandwich assay）,71,夹心法,72,双夹心法,返回,73,74,75,ELISA,双抗体夹心法(测Ag) 间接法(测Ab),加Ab,清洗,加Ag形成复合物，洗涤,加该Ag的另一Ab（酶标），洗涤,加底物，读数,加Ag，清洗,加Ab形成复合物，洗涤,加酶标二抗,加底物，读数,聚苯乙烯微量反应板,76,77,抗酶抗体法（PAP）,78,血清IgE的检测,实验材料酶标板（聚苯乙烯微量板）马抗人抗体（购自北京中山公司）辣根过氧化物酶（）标记的马抗人抗体待检血清包被缓冲液：碳酸钠碳酸氢钠洗涤液封闭液：溶液反应终止液：,79,实验方法包被酶标反应板：加马抗人抗体（），孔 孵育小时后洗涤次，分钟次，孔，过夜孔孵育后，洗涤同上酶标记抗体：加入适当稀释度的酶标抗体，孔孵育后， 洗涤同上底物：加入（邻苯二胺）溶液，孔室温分钟终止液：加入，孔内，用酶标仪测定各孔值，测定波长实验结果 用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值（） 表示，当大于某一数值时（如）判断为阳性，数值的大小依具体检测要求而定。,80,（4）竞争法,a固相抗体竞争法b固相抗原竞争法,81,a固相抗体竞争法,82,b固相抗原竞争法,返回,83,夹心ELISA,竞争ELISA,（用于检测大分子Ag）,（用于检测小分子Ag）,84,返回,（5） 抗体桥联法 （immunobridge）,85,（6）抗酶抗体法（peroxidase-antiperoxidase，PAP）,86,PO抗PO法,返回,87,酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot, ELISPOT),在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。,88,89,ELISPOT&ELISA,ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。,90,原 理,细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。,91,Direct and Indirect ElISPOT,可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞（直接法），或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞，然后放入已包被的孔中（间接法）。方法选择基于：1）检测细胞的类型；2）希望得到的细胞量。若只需少量的细胞因子生成细胞，使用直接法；反之，最好使用间接法。其它步骤一致。,92,ElISPOT操作过程,93,94,95,96,操作过程,1. 用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。2. 倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。3. 将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 盖上板盖，4过夜。4.倒去液体，100ul PBS洗涤一次。5.每孔加入100ul 2%脱脂乳PBS（见试剂准备），盖上板盖，室温下孵育2小时。6.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。7.用100ul PBS洗涤一次。8.每孔加入100ul细胞悬浮液（含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂）。细胞可预先在体外接受刺激（间接Eli-spot）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37 CO2孵育箱中孵育一定的时间（15-20小时）。这期间不要晃动或移动孔板。9.在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。10.每孔加100ul洗涤缓冲液，4孵育10分钟。,97,11.用100ul洗涤缓冲液洗孔3次12.于10ml PBS-1%BSA中稀释100ul检测抗体，此为一板的量。每孔加100ul此液体，盖上板盖，37下孵育1小时30分。13.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。14.每板以10ml PBS-1%BSA稀释10ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100ul此液体，盖上板盖，37孵育1小时。15.倒去液体，用100ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。16.每孔加入100ul BCIP/NBT。17.室温下反应5-15分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。18.用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。4下放置一夜，点会比较明显。,98,99,100,101,返回,102,103,四、通用与放大技术,1 SPA通用系统2ABC放大系统,返回,104,（1）SPA的发现,1940年Verwey发现金黄色葡萄球菌的某些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩散试验中出现沉淀线。1958年Jensen用离子交换树脂分析证明，该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A，SPA),105,Forsgren等证明SPA与IgG分子的Fc段结合，为非特异免疫反应。 生产SPA的国际标准菌株: Cowan 株（NcTc8530 和ATCC12598） 不生产SPA的标准株: Wood46,返回,106,（2）颗粒SPA的应用,协同凝集试验SPA吸收IgG试验应用IgG-SPA制备抗IgG的抗体,返回,107,（3）SPA的标记和应用,荧光素标记SPA及应用酶标记SPA及应用,108,酶标SPA法,返回,109,ABC放大系统,生物素-亲合素系统 （biotin-avidin system） 高度特异性 高度灵敏性 简单快速安全稳定,110,（1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性,生物素（biotin，B）又称维生素H、辅酶R（羧基转化酶的辅酶） MW 244.31， pI 3.5 分子式为C10H16O3N2S,111,112,Biotin,113,亲合素（avidin，A） 又称卵白蛋白、抗生物素。 MW 68,000，pI 1010.5，为碱性蛋白，含糖量高达10%； 1个亲合素可与4个生物素结合； Ka = 1015 mol/L,114,链霉亲合素（streptavidin，SA）： 是Streptomyces avidin 菌分泌的一种蛋白质。 MW 65000，pI 6.0，为略偏酸性的蛋白，不含任何糖基 1个链霉亲合素可与4个生物素结合 Ka = 1015 mol/L SA比A在实际应用中灵敏度要高、非特异性反应要少。,返回,115,（2）生物素的标记技术,生物素的活化活化生物素结合物的制备 活化生物素可结合或偶联抗体、酶、蛋白质、多肽、激素、凝集素、糖类及DNA 、RNA等,116,（4）生物素-亲合素系统的应用,117,返回,118,四、ELISA方法的发展1. 酶联免疫荧光测定法,119,2. IgM型抗体捕捉酶联免疫吸附试验 （IgM antibody capture ELISA,MAC-ELISA),120,3. 斑点酶联免疫吸附试验（dot- ELISA),121,122,三、免疫金溶胶技术,123,胶体金试纸条诊断是采用斑点免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。,（4）斑点免疫层析试验 （ dot immunochromatographic assay, DICA),124,胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。,125,质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，