生物技术遗传学实验指导

目 录 验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 实验二 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 实验三 人类染色体 G 显带技术 实验四 人类染色体 C 显带技术 实验五 核仁形成区银染技术 实验六 人类染色体 G 显带核型分析 实验七 X 染色质标本的制备 实验八 姐妹染色单体交换 实验九 微核检测技术 实验十 ABO 血型的测定及其基因频率的计算 实验十一 苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算 实验十二 人类皮纹分析 实验十三 遗传咨询 实验十四 人类基因组 DNA 的提取 实验十五 聚合酶链式反应 PCR 实验十六 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 实验十七 PCR RFLP 技术 遗传学 实验须知 一 医学遗传学实验目的和要求 医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容 实验课有助于加深和巩固基础理论 知识 并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能 在培养学生分析问题 综 合问题和解决问题能力方面具有重要作用 为此 要求学生做到以下几点 1 实验课前做好预习 明确实验目的 实验原理 2 复习有关理论内容 3 熟悉实验的主要步骤 4 初步估计和判定实验的可能结果 二 实验操作过程中的注意事项 1 认真操作 仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录 2 如果实验结果与理论结果不一致 须及时进行科学分析 判断结果的可靠性 寻找 出现误差的原因 3 各种实验试剂用后放回原处 瓶盖封严 轻拿轻放 4 使用微量加样器时 一定调整好取用量 按使用要求操作 5 实验室应保持肃静 注意清洁卫生 实验中用过的废弃物品要及时清理 避免堵塞 下水管道 三 实验后的注意事项 1 实验后 整理清洁所用仪器 设备 注意放回原位 以备下次使用 2 如有仪器损坏 要及时填写破损报告 并报告老师 3 离开实验室前 检查并关闭门 窗 水 电 四 实验室的意外处理 实验室如遇着火 烫伤等意外事件发生 必须镇静做紧急处理 并立即报告老师 1 着火 如遇酒精灯推倒或其它原因着火 首先将一切易燃品移至远处 然后用水扑 灭或者切断电源 2 火伤 皮肤被火灼伤 用烫伤软膏涂抹 如伤势较重 立即送医院治疗 3 如有毒药品泼溅到皮肤上 如 EB 同位素等 应用大量清水进行清洗 必要时 去医院处理 4 割伤出血 遇玻璃割伤出血 可用碘酒或红药水消毒后 用纱布包扎 如有玻璃留 在伤口 处理前应先取出 实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 目的要求目的要求 1 初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法 2 初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法 实验原理实验原理 人体外周血淋巴细胞培养 人体末梢血 微量全血短期培养 及其染色体标本制备是国 内外研究显示染色体最常用和效果最好的方法 此方法取材方便 用血量少 操作简便 现已广泛应用于基础医学 临床医学的研究和染色体病的诊断等 人体外周血中的小淋巴细胞 是已分化 处于 G0期的细胞 几乎不具有分裂增殖能力 在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞 因此 需采用刺激细胞增殖的措施 人们发现从云豆 菜豆 中提取的植物血球凝集素 植物血凝素 PHA 可以刺激小淋巴细胞进 行有丝分裂 即在 PHA 作用下 处在 G0期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞 淋巴母细胞 具有分裂能力 重新进入增殖周期进行有丝分裂 在 PHA 作用下体外培养 72 小时左右 多 数淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期 此时 细胞分裂相较多 但都处于分裂的不同时 期 一般来说 制作染色体标本主要是显示细胞分裂中期染色体 因中期染色体形态最为 典型 最为清晰 最易辨认 是研究染色体的最好阶段 为了获得大量可供分析的中期染 色体 需在终止细胞培养前数小时加入适当浓度的有丝分裂阻断剂 秋水仙素 或其衍生 物秋水仙胺 它可特异地抑制纺锤丝的形成 阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期 借此可获得大量中期分裂相细胞 在进行染色体标本制备的过程中 首先要进行低渗处理 使细胞体积胀大 染色体松 散开而便于观察分析 最常用的低渗液为 0 075mol L 的 KCl 也可用水或 1 枸橼酸钠等 低渗后的细胞需用固定液固定 醋酸固定液具有膨胀 固定作用 它和醇类混合固定 有 利于染色体松散 可获得分散好 易于分析的分裂中期染色体标本 现在常用的固定液为 甲醇 冰醋酸 3 1 固定液 实验准备实验准备 1 试剂 RPMI 1640 营养液 小牛血清 0 25 胰蛋白酶 Hanks 液 双抗 青霉素 链霉素 2 碘酒 75 酒精 3 8 NaHC03 520U mL 肝素 40 g mL 秋水仙碱 PHA 0 075mol L KCl 低渗液 甲醇 冰醋酸 Giemsa 染液 二甲苯和香柏油等 2 器材 超净工作台 光学显微镜 附照相设备 隔水式恒温培养箱 离心机 冰箱 高压蒸 汽消毒锅 鼓风干燥箱 无菌正压滤器 分析天平 感量 1 10 毫克 架盘天平 链霉素 培养瓶及瓶塞 肝素小瓶及瓶塞 取血用 10mL 吸管 直头小吸管 5mL 刻度离心管 2mL 或 5mL 一次性注射器 量筒 烧杯 搪瓷盆 搪瓷盘 试管架 片盘 片盒 止血带 棉 签 大吸球 小吸头 pH 试纸 废液缸 解剖剪刀 镊子 记号笔 40C 预冷的载玻片 酒精灯 火柴 染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等 实验材料实验材料 人静脉血 实验内容 方法实验内容 方法 一 采血 在采血前 对各种用品进行清洗 无菌处理 配制 分装并冻存培养液 5mL 瓶 用 5mL 注射器抽取肝素 0 1mL 备用 常规消毒肘部皮肤 用抽取肝素的注射器静脉采 2mL 轻轻摇匀 待接种培养 二 接种培养 将事先配制冻存的装有 5mL 培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出 置室 温融化 每瓶滴入约 0 3mL 肝素抗凝血 轻轻摇匀 置 370C 培养箱培养 72 小时 三 积累分裂中期细胞 在终止培养前 2 小时 于培养瓶内加入浓度为 20 g mL 秋水仙素 1 滴 终浓度为 0 1 0 15 g mL 摇匀 置 370C 温箱继续培养 2 小时后收集细胞 制片 四 制片 1 收集细胞 从培养箱中取出培养瓶 用小吸管将培养物吹打均匀 移人 5ml 刻度离 心管内 以 2000r min 离心 10 分钟 吸去上清液 保留底物 2 低渗 每管加入 370C 预温的 0 075mol LKCL 溶液 4ml 用吸管轻轻吹打均匀 置 370C 水浴锅中低渗 30 分钟 以达到红细胞破坏 淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的 3 预固定 低渗处理后 每管加入 1 mL 甲醇 冰醋酸 3 1 固定液 将细胞轻轻吹打 均匀 置离心机 2000r min 离心 10 分钟 4 固定 一 去上清液 加固定液 5mL 吹打均匀 固定 30min 2000r min 离心 10 分钟 5 固定 二 去上清液 再加入 5mL 固定液 吹打均匀 再次固定 30min 2000r min 离心 10 分钟 6 滴片 去上清液 留底物 每管加入少许 约 0 2mL 固定液 将底物吹打均匀 制 成细胞悬液 然后用吸管吸取混匀的细胞悬液 约以 20cm 或更高的距离滴至预冷的载玻片 上 每片约 2 3 滴 随即将玻片在酒精灯火焰上微烤 一过性微烤数次 以助细胞 染色 体分散 使之均匀平铺于玻片上 将制片放人片盘 空气干燥后 收集于片盒中 7 染色和观察 待制片晾干后 放入约 1 10 Giemsa 染液的染色缸中染色 15 分钟左 右 或架在染色用玻璃板上扣染 15 分钟左右 扣染是指染色时 将染色体制片的细胞面朝 下 架在玻璃板上 将染液滴入玻璃板和细胞面之间 自来水轻轻冲洗 晾干后光镜下观 察 先用低倍镜观察后 选择分散好的染色体换为高倍及油镜观察 注意人类核型中近端 亚中和中着丝粒染色体的形态特点 注意事项注意事项 1 有关淋巴细胞培养的注意事项同实验十二 2 PHA 的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键 不同来源或同一厂家的不同批 号 不同的保存时间 PHA 的效价可能会有较大的差异 直接影响培养细胞中分裂细胞的 数量 故每批 PHA 正式使用前 须进行一次预实验 摸索 PHA 的质量和使用量 其使用量 不宜过大 否则会导致红细胞凝集 一般 自己直接从菜豆中提取的 PHA 效果较好 3 接种的血样标本愈新鲜愈好 肝素用以抗凝 用量不宜过多 4 秋水仙素用量和作用时间要适当 该药有强烈的毒性作用 用量过大 作用时间过 长 可使染色体缩短和发生异常分裂现象 甚至染色体破碎 5 低渗是制片好坏的重要环节 低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体 的制片质量 如染色体分散不好 有胞浆背景 或细胞破损 染色体丢失等 要注意低渗 液使用前需 370C 温箱预温 6 低渗后的预固定也很重要 预固定时 固定液量不要多 加入固定液后要立即用吸 管吹打均匀 用力不要过猛 另外两次固定时 固定液也不要过多 吹打时用力也不要过 猛 以免细胞破碎 染色体丢失 固定液要在使用时配制 7 最后的滴片也是染色体制片好坏的很关键的一步 载玻片上有油污或预冷不够 或 滴片时所滴悬液重叠 操作不好 或底物悬液过浓等都直接影响细胞 染色体的分散 底 物悬液过稀或酒精灯上烤片时间太长 都可能造成制片中可供分析用的染色体很少 甚至 找不到染色体 实验报告实验报告 1 血培养中 PHA 所起的作用是什么 秋水仙素的作用是什么 2 简述血培养和外周血淋巴细胞染色体标本制备的过程 实验二 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 目的要求目的要求 1 初步掌握实验动物骨髓细胞染色体标本的一般制备方法 直接法 2 了解小白鼠染色体的形态特征及其数目 实验原理实验原理 骨髓细胞具有旺盛的分裂增殖能力 在骨髓细胞中 有丝分裂细胞所占的比例比一般 细胞大 为了积累更多的有丝分裂中期细胞 可在收集细胞前进行秋水仙素处理 通过制备的骨髓染色体标本 可以观察毒性物质在体内对细胞染色体的影响 同时 在检测环境致突剂方面 也有其独特的优点 方法简捷 直接 易于掌握 一般实验室均 可进行 因此 此法也是用动物实验检测有害物质对机体遗传物质损伤的实验方法之一 实验准备实验准备 1 试剂 0 04 秋水仙素 0 075mol L KCl 甲醇 冰醋酸 Giemsa 染液 香柏油 二甲苯 等 2 器材 光学显微镜 恒温培养箱 离心机 架盘天平 酒精纱布及其它一般用品 实验材料实验材料 健康小白鼠 体重约 20 克 实验内容 方法实验内容 方法 1 取材和低渗 取材前 3 4 小时 于小鼠腹腔内注入 0 04 秋水仙素 0 1mL 10g 体重 以积累中期 分裂相 断颈髓法处死小鼠 取其股骨 用酒精纱布清除其上粘附的肌肉及结缔组织 并 用剪刀剪去股骨两端少许骨骺及骨皮质 暴露骨髓质 用注射器抽取 0 075mol L KCl 5mL 冲洗骨髓腔 将冲洗后的液体收集到 5mL 离心管中 反复冲洗两次以上 至骨髓腔变 白为止 将冲洗液吹打均匀后置 370C 恒温箱低渗处理 20 分钟 2 预固定 取出低渗后的离心管 加入 2 3 滴预固定液 甲醇 冰醋酸 3 1 立即吹打均匀 平 衡后用离心机 2500r min 离心 5 分钟 去上清液 留底物 3 固定一 加固定液 5mL 于离心管中 吹打均匀 室温固定 10 分钟后 2500r min 离心 5 分钟 去上清液 留底物 4 固定二 再加固定液 5mL 于离心管中 吹打均匀 室温固定 10 分钟后 2500r min 离心 5 分 钟 倾去上清液 加入少许 约 0 5mL 固定液 5 滴片 将沉淀物吹打均匀后 吸于滴管内 滴在预冷的载玻片上 每片 2 3 滴 酒精灯上烘 烤一下 放在片盘上 晾干后装入片盒中 6 染色和观察 1 10 的 Giemsa 染液染色 15 分钟后 自来水冲洗 待制片干燥后置显微镜下观察 小 鼠染色体形态数目与人类染色体不同 小鼠全部为端着丝粒染色体 2n 40 注意事项注意事项 1 在用酒精纱布处理股骨上的软组织时 不要使组织块掉入离心管中 2 可参照实验十四染色体标本制备过程中的注意事项 实验报告实验报告 1 小白鼠腹腔内提前注射秋水仙素的意义是什么 2 叙述小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程 直接法 实验三 人类染色体 G 显带技术 目的要求目的要求 初步掌握染色体 G 显带制备的基本方法 实验原理实验原理 自 20 世纪 60 年代末以来 染色体显带技术得到了很大的发展 人们用物理 化学的 方法处理染色体标本 再用染料对染色体进行分化染色 使其呈现出明暗相间或深浅不同 的带纹 这一技术的应用 可以准确识别 23 对不同类型的染色体 并能识别同一号染色体 上的不同区带 从而提高了染色体核型分析的精确度 为临床上某些疾病的诊断提供了有 效的手段 关于 G 带的形成机理 迄今尚不十分清楚 有人认为 在胰酶的作用下 蛋白质不均 匀丢失是 G 带产生的原因 在染色体上的蛋白质经处理而丢失后 这些区域呈现出浅染 浅 带 染色体上蛋白质和 DNA 结合牢固的区域 由于蛋白质丢失少而呈现深染 深带 还有 人认为 染色体经蛋白酶消化后 染色体的核蛋白破坏 这些区域裸露的 DNA 分子的磷酸 基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色 也有人认为 染 色体上 T A 和 C G 碱基的含量和分布不同 也与染色体上深浅带的形成有关 A T 碱基 对较多的区域 易与吉姆萨染料结合而染成深色区带 而 G C 碱基对较多的区域则相反 染成浅染区带 总之 目前说法较多 但主要概括了三种观点 即显带是由于 DNA 的作 用 蛋白质的作用 DNA 染料和蛋白质三者之间相互作用的结果 这些都有待于进一 步研究探讨 可以肯定 G 显带具有很多优点 如制备方法简便易行 标本可长期保存 带纹清晰 成本低廉 制备周期短 普通光学显微镜即可观察 故已成为当今细胞遗传学 与分子细胞遗传学领域中应用广泛的一种技术 并成为研究分析染色体的主要常规方法之 一 实验准备实验准备 1 试剂 0 85 生理盐水 0 025 胰蛋白酶溶液 吉姆萨染液 3 8 NaHC03 二甲 苯 松柏油等 2 器材 普通光学显微镜 370C 水浴箱 普通冰箱 立式染缸 直头小吸管 橡皮 吸头 pH 试纸 吸水纸 滤纸 扣染玻璃板 擦镜纸 镊子等 人类中期染色体标本制备用试剂和器材同实验十四 实验材料实验材料 常规方法制备的人类中期染色体标本制片 片龄 3 5 天最宜 实验内容 方法实验内容 方法 1 首先将配制好的 0 025 胰酶溶液装入立式染色缸中 调 pH 值至 7 0 7 2 放人 370C 恒温箱中预温 2 取染色体制片一张置胰酶缸中处理 15 秒左右 迅速投入 0 85 生理盐水缸中漂洗 数秒 可准备两缸盐水 做两次漂洗 3 用自来水稀释的吉姆萨染液 自来水 吉姆萨原液 8 1 扣染 20 分钟 4 将标本用流水冲洗 晾干 必要时封片 镜检 镜检时 先在低倍镜下选择分散好 长度适中的分裂相 然后转换油镜观察其显带情况 选择显带好的标本进行 G 显带核型分 析 注意事项注意事项 1 染色体制片胰酶处理前 需 370C 温箱烤片一天左右 如滴片后当天进行 G 显带 可在滴片后置 800C 烤箱烤片两小时 2 胰酶预温时要注意预温温度 温度过高时胰酶变性失效 3 胰酶溶液需在使用前配制 染色体在胰酶中的处理时间可因制片质量 片龄而不同 在不同个体的染色体制片中也可有差异 此外 不同厂家生产的胰酶或不同批号的胰酶 在处理时间上都可有差别 故每次进行染色体 G 显带时 最好先试做一张制片 分段并用 不同时间处理 摸索胰酶处理时间 以保证获得最好的染色体 G 显带标本 实验报告实验报告 1 G 显带过程中应注意哪些问题 2 简述染色体 G 显带标本制备的基本方法 实验四 人类染色体 C 显带技术 目的要求目的要求 1 初步掌握染色体 C 显带的制备方法 2 熟悉 1 号 9 号 16 号和 Y 染色体 C 带的带型特征 实验原理实验原理 C 显带技术是一种染色体局部显带技术 染色体经碱 酸 盐处理后 再经 Giemsa 染 色 呈现出特有的着丝粒 次缢痕区及 Y 染色体长臂远侧段等的结构异染色质区深染 称 为 C 带 此区域的 DNA 多为高度重复序列 并仅与组蛋白紧密结合 因而保护了 C 带区的 异染色质免受酸 碱 盐破坏 并易被 Giemsa 深染 如该区域的 DNA 一旦发生变性 在改 变变性条件后 即可快速复性 这是高度重复序列 DNA 所具有的特性 其它部位的 DNA 一 旦被碱破坏变性后 不易发生复性 或复性较慢 因此 不易被 Giemsa 着色 所以 染色 体两臂的常染色质部分仅显示出浅淡的染色体轮廓 优良的 C 带标本 可使结构异染色质 区着色很深 在人类染色体中 染色体的着丝粒区 第 1 9 16 号染色体的次缢痕区和 Y 染色体长臂的远侧段明显深染 因此 利用 C 带 可以准确地识别这些染色体 并可确定 着丝粒的位置和数目 还可配合其它显带技术对染色体某些结构异常 Y 染色体异常及性 别 做出准确的诊断 不同个体 种族 C 带的大小和染色的强度不同 呈现出多态性 故 C 显带技术在多态性研究和鉴别染色体来源等方面具有一定的意义 实验准备实验准备 1 试剂 5 10 饱和 Ba OH 2 0 1mol L HCl 蒸馏水 70 80 95 酒精 和纯酒精 2 SSC 溶液 Giemsa 染液 香柏油或石蜡油 二甲苯等 2 器材 光学显微镜 恒温水浴箱 温度计 立式染缸 镊子 扣染用玻璃板 小吸 管 50mL 量筒 擦镜纸等 实验材料实验材料 常规方法制备的人类中期染色体标本制片 实验内容 方法实验内容 方法 1 将染色体制片投入 580C 饱和 Ba OH 2中 5 分钟 2 取出标本置 0 1mol L HCl 中漂洗 3 蒸馏水漂洗数次 4 酒精脱水 70 酒精 80 酒精 95 酒精 纯酒精 每个浓度 5 分钟 空气干燥 5 置 650C2 SSC 溶液中温育 1 5 2 小时 6 Giemsa 染色 20 分钟 自来水冲洗 空气干燥 显微镜下观察 将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观察 找到分散好的 染色体长度适宜的分裂相 换油镜观察 注意观察各染色体的着丝粒区深染 尤其是第 1 号 9 号 16 号染色体着丝 粒区及次缢痕区深染 两者合在一起形成明显大的 C 带 Y 染色体长臂远侧段约 1 2 2 3 区段深染 C 带明显 第 1 9 16 号染色体和 Y 染色体长臂的 C 带具有多态性 注意事项注意事项 1 片龄不宜过长 否则影响 C 带质量 2 制片从饱和 Ba OH 2中取出时要迅速投入 0 1mol L HCl 中 以免 Ba OH 2的沉淀 物粘贴在玻片上影响 C 带的观察 3 染色浓度及时间不宜过高过长 以免影响 C 带的质量 实验报告实验报告 1 简述染色体 C 显带标本制备的基本方法 2 在 C 显带标本中 你能辨认第 1 9 16 号及 Y 染色体吗 它们的 C 带特点与其它各 号染色体有什么不同 实验五 核仁形成区银染技术 目的要求目的要求 1 初步掌握人类染色体核仁形成区银染标本的制备方法 2 熟悉核仁形成区的所在部位 实验原理实验原理 人类 D 组和 G 组染色体的随机柄部次缢痕区 称为核仁形成区 NOR 与核仁形成有关 硝酸银染色技术 使具有活性的核仁形成区特异地染成黑色 这种银染色阳性的 NOR 称为 Ag NOR 是具有转录活性的 rDNA 部位 现已证明 这里是具有转录活性的 18SrRNA 和 28SrRNA 基因的所在部位 此处常伴有丰富的酸性蛋白质 而这种蛋白含有较多的 SH 基 团和二硫键 易使硝酸银中 Ag 还原为 Ag 颗粒 从而使有转录活性的核仁形成区镀上银颗 粒而呈现出黑色区域 故被银染的不是 rDNA 本身而是酸性蛋白质 没有转录活性的 NOR 则 不着色 对 Ag NOR 出现频率进行计数 可以了解有活性的 rRNA 基因 rDNA 的动态变化 估计 rDNA 的转录活性 人类细胞中的 Ag NOR 数目及其在染色体上的位置都是比较稳定的 如发生改变 说明细胞内 rRNA 基因活性发生变化 现认为 该技术是研究 18SrRNA 和 28SrRNA 基因分布和转录活性的一种简易有效的方法 并已广泛地用于肿瘤细胞遗传学 体细胞遗传学 进化遗传学和临床细胞遗传学等领域 实验准备实验准备 1 试剂 50 硝酸银 明胶 甲酸液 Giemsa 染液 蒸馏水 2 器材 光学显微镜 恒温水浴箱 小吸管 小吸头 盖玻片 擦镜纸 实验材料实验材料 人外周血淋巴细胞染色体标本制片 片龄在一周以内 实验内容 方法实验内容 方法 1 先吸取 50 AgN03两滴滴在染色体标本制片上 然后加入明胶 甲酸液 3 滴 轻轻 来回摇晃混匀 盖上盖玻片 2 将玻片平置于沸水水浴箱的铁板上 1 2 分钟 待玻片变金黄色 立即用自来水冲 洗 以冲掉盖玻片 3 以 5 Giemsa 染液复染 10 分钟 自来水冲洗 空气干燥 显微镜下观察 Ag NOR 计数 选择分散好 数目全的中期分裂相染色体 计数 D 组 6 个和 G 组 4 个 近端着丝粒染色体 Ag NOR 的数目 凡有银染点的近端着丝粒染色体 不论单侧或双侧的 都计数为一个银染的染色体 注意事项注意事项 1 硝酸银溶液应在临用前配制 配制及使用时 注意不要溅到四周 以免形成很难除 掉的黑色污点 2 掌握好银染温度 温度越高 反应速度越快 实验报告实验报告 1 仔细观察 Ag NOR 形态 数目及其在染色体上的位置 2 了解 NOR 银染的原理 实验六 人类染色体 G 显带核型分析 目的要求目的要求 1 通过 G 显带核型分析 掌握 G 显带核型分析方法并初步掌握各号染色体的带型特征 2 与非显带核型分析进行比较 认识 G 显带核型分析 能准确的识别每一条染色体 实验原理实验原理 染色体标本用适当浓度的胰蛋白酶溶液处理 再用 Giemsa 染液染色 在染色体上显出 深浅交替的横纹 为 G 带 通过显示 G 带 不仅可以准确区分每一条染色体 还可检测出 染色体的微小结构异常 人类 G 显带染色体核型分析是染色体研究中最重要和最常用的方 法 它可根据染色体的数目 结构进行核型分析 而对染色体病患者做出准确的诊断 可 在显微镜下直接进行分析 也可进行显微照相 经冲洗 放大后 根据照片进行分析 根 据丹佛 Denver 及伦敦 London 会议提出的标准 按照每条染色体的特异带型 将照片上 的染色体按其轮廓剪下 进行配对 分组 排列 并贴在报告纸上 人体细胞含有 46 条染 色体 即 23 对 其中 22 对为常染色体 男 女相同 编为 1 22 号 另一对为性染色体 男 女有别 男性为 XY 女性为 XX X 染色体编入 C 组 Y 染色体编入 G 组 在剪接粘贴 时 性染色体可单独排列 核型分析后 将其分析结果按国际标准进行描述 实验准备实验准备 剪刀 镊子 核型分析纸 直尺 胶水 铅笔和橡皮 实验材料实验材料 正常人外周血淋巴细胞 G 显带中期分裂相照片 实验内容 方法实验内容 方法 一 正常人类染色体 G 带带型识别的主要特征 A 组染色体 包括第 1 3 号染色体 其长度最长 1 号和 3 号染色体的着丝粒均在 1 2 处 2 号染 色体的着丝粒约在 3 8 处 1 号染色体 短臂 在分裂中期显示的 320 条带左右的分裂相上 近侧段有二条深带 第 2 条深带 稍宽 在处理较好的标本上 远侧段可显示 3 4 条淡染的深带 此臂分为三个区 近侧的 第 1 条深带为 2 区 1 带 第 2 条深带为 3 区 1 带 长臂 副缢痕紧贴着丝粒 着色深度大小不一 其远侧为一宽的浅带 近中段与远侧 段各有两条深带 中段两条深带稍靠近 其中第 2 条深带染色较浓 此臂分为 4 个区 副 缢痕远侧的浅带为 2 区 1 带 中段第 2 条深带为 3 区 1 带 远侧段第 1 深带为 4 区 1 带 2 号染色体 短臂 可见 4 条深带 中段的两条深带稍靠近 此臂分为 2 个区 中段两条带之间的 浅带为 2 区 1 带 长臂 有 4 7 条深带 第 3 和第 4 深带有时融合 此臂分为 3 个区 第 2 和第 3 深带 之间的浅带为 2 区 1 带 第 4 和第 5 深带之间的浅带为 3 区 1 带 3 号染色体 着丝粒染色较浓 在长臂和短臂的近中段各具有一条明显而宽的深带 短臂 一般在近侧段可见一条较宽的深带 远侧段可见两条深带 其中一条较窄 且 着色淡 这是区别 3 号染色体短臂的显著特征 在处理较好的标本上 近侧段的深带可分 为两条深带 此臂分为 2 个区 中段浅带为 2 区 1 带 长臂 一般在近侧和远侧各有一条较宽的深带 在显带较好的标本上 近侧段的深带 可分为两条深带 远侧段的深带可分为三条深带 此臂分为 2 个区 中段浅带为 2 区 1 带 B 组染色体 包括第 4 5 号染色体 长度次于 A 组 着丝粒均在 1 4 处 4 号染色体 短臂 可见两条深带 近侧深带染色较浅 短臂只有一个区 长臂 可见四条均匀分布的深带 在显带较好的标本上 远侧段的二条深带可各自分 为二条较宽的深带 此臂分为 3 个区 近侧段的第 1 和第 2 深带之间的浅带为 2 区 1 带 远侧段二深带之间的浅带为 3 区 1 带 5 号染色体 短臂 可见两条深带 其远侧的深带宽而浓染 此臂只有一个区 长臂 近侧段有二条深带 染色较淡 有时不明显 中段可见三条深带 染色较浓 有时融合成一条宽阔的深带 远侧段可见二条深带 近末端的一条着色较浓 此臂分为 3 个区 中段第 2 深带为 2 区 1 带 中段深带与远侧段之间的宽阔的浅带为 3 区 1 带 C 组染色体 包括第 6 12 号和 X 染色体 中等长度 11 号和 X 染色体的着丝粒在 3 8 处 其它各 号染色体的着丝粒约在 1 4 处 6 号染色体 短臂 中段有一条明显而宽阔的浅带 近侧段和远侧段各有一条深带 近侧深带紧贴 着丝粒 在显带较好的标本上 远侧段的深带可分为二条深带 此臂分为 2 个区 中段的 明显而宽阔的浅带为 2 区 1 带 长臂 可见五条深带 近侧的一条紧贴着丝粒 远侧段的末端一条深带着色较浅 此 臂分为 2 个区 第 2 和第 3 深带之间的浅带为 2 区 1 带 7 号染色体 着丝粒着色浓 短臂 有三条深带 中段深带着色较淡 有时不明显 远侧深带着色浓 状如 瓶盖 此臂分为 2 个区 远侧段的浅带为 2 区 1 带 长臂 有三条明显的深带 远侧近末端一条着色较淡 第 2 和第 3 深带稍靠近 此臂 分为 3 个区 近侧第 1 条深带为 2 区 1 带 中段的第 2 深带为 3 区 1 带 8 号染色体 短臂 有两条深带 中段有一较明显的浅带 这是与 10 号染色体鉴别的主要特征 此 臂分为 2 个区 中段的浅带为 2 区 1 带 长臂 可见三条分界极不明显的深带 有时不明显 远侧的深带着色较浓 此臂分为 2 个区 中段的深带为 2 区 1 带 9 号染色体 着丝粒着色浓 短臂 近侧段和中段各有一条深带 在显带较好的标本上 中段可见二条窄的深带 此臂分为 2 个区 中段深带为 2 区 1 带 长臂 可见明显的二条深带 副缢痕一般不着色 在有些标本上呈现出特有的狭长颈 部区 此臂分为 3 个区 近侧的一条深带为 2 区 1 带 远侧的一条深带为 3 区 1 带 10 号染色体 着丝粒着色浓 短臂 近侧段和中段各有一条深带 在有些标本上 近中段可见二条深带 但与 8 号 染色体短臂比较 其深带的分界欠清晰 此臂只有 1 个区 长臂 可见明显的三条深带 远侧段的二条深带稍靠近 近侧的一条深带着色最深 这是与 8 号染色体相鉴别的主要特征 此臂分为 2 个区 近侧段的一条深带为 2 区 1 带 11 号染色体 短臂 近中段可见一条深带 在显带较好的标本上 这条深带可分为二条较窄的深带 此臂只有一个区 长臂 近侧有一条深带 紧贴着丝粒 远侧段可见一条明显的较宽的深带 这条深带 与近侧的深带之间是一条宽阔的浅带 这是与 12 号染色体相鉴别的一个明显特征 在显带 较好的标本上 远侧段的这条较宽的深带 可分成两条较窄的深带 两深带之间有一条很 窄的浅带 一般较难辨认 但它是分区的一个界标 在有些标本上 近末端处可见一条窄 的浅色深带 此臂分为两个区 上述两条深带之间很窄的浅带为 2 区 1 带 12 号染色体 短臂 中段可见一条深带 此臂只有一个区 长臂 近侧有一条深带 紧贴着丝粒 中段有一条宽的深带 这条深带与近侧深带之 间有一条明显的浅带 但与 11 号染色体相比 这条浅带较窄 这是鉴别 11 号与 12 号染色 体的主要特征 在显带较好的标本上 中段这条较宽的深带可分为三条深带 其正中的一 条着色较浓 在有些标本上 远侧段的近端还可见 1 2 条染色较深的深带 此臂分为 2 个 区 中段正中的深带为 2 区 1 带 X 染色体 其长度介于 7 号和 8 号染色体之间 短臂 中段有一明显的深带 如竹节状 在有些标本上 远侧段还可见到一条窄的 着色淡的深带 此臂分为二个区 中段的深带为 2 区 1 带 长臂 可见 4 5 条深带 近中段的一条最明显 此臂分为 2 个区 近侧端的深带为 2 区 1 带 D 组染色体 包括 13 15 号染色体 具有近端着丝粒和随体 13 号染色体 着丝粒区深染 长臂 可见 4 条深带 第 1 和第 4 深带较窄 染色较淡 第 2 和第 3 深带较宽 染色 较浓 此臂分为 3 个区 第 2 深带为 2 区 1 带 第 3 深带为 3 区 1 带 14 号染色体 着丝粒区深染 长臂 近侧和远侧各有一条较明显的深带 在处理较好的标本上 中段尚可见一条着 色较浅的深带 此臂分为 3 个区 近侧深带为 2 区 1 带 远侧深带为 3 区 1 带 15 号染色体 着丝粒区深染 长臂 中段有一条明显的深带 染色较浓 有的标本上 近侧段可见有 1 2 条染色浅 的深带 此臂分为 2 个区 中段深带为 2 区 1 带 E 组染色体 包括第 16 18 号染色体 16 号染色体为中央着丝粒染色体 17 和 18 号染色体为亚中 央着丝粒染色体 着丝粒约在 1 4 处 16 号染色体 短臂 中段有一条深带 显带较好的标本上可见二条深带 此臂只有一个区 长臂 中段和远侧各有一条深带 有时远侧的一条不明显 副缢痕着色浓 此臂分为 两个区 中段深带为 2 区 1 带 17 号染色体 短臂 有一条深带 紧贴着丝粒 此臂只有一个区 长臂 远侧段可见一条深带 这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带 此臂分为 2 个区 这条明显而宽的浅带为 2 区 1 带 18 号染色体 短臂 有一条窄的深带 此臂只有一个区 长臂 近侧和远侧各有一条明显的深带 此臂分为 2 个区 两深带之间的浅带为 2 区 1 带 F 组染色体 包括 19 20 号染色体 均为中央着丝粒染色体 19 号染色体 着丝粒及其周围为深带 其余均为浅带 短臂与长臂均只有 1 个区 20 号染色体 着丝粒区深染 短臂 有一条明显的深带 此臂只有一个区 长臂 在中段和远侧段可见 1 2 条染色较淡的深带 有时全为浅带 此臂只有一个区 G 组染色体 包括第 21 22 染色体和 Y 染色体 是染色体中最小的 具近端着丝粒的染色体 21 22 号染色体可具有随体 21 号染色体 着丝粒区着色淡 与 22 号染色体比较 其长度比 22 号短 其长臂近侧有一明显而宽的深带 此臂分为 2 个区 其深带为 2 区 1 带 22 号染色体 着丝粒区着色浓 与 21 号染色体相比 其长度比 21 号长 在长臂上可见二条深带 近侧的一条着色较 浓 而且紧贴着丝粒 近中段一条着色淡 在有的标本上不显现 此臂只有一个区 Y 染色体 长度变化较大 有时整个长臂被染成深带 在显带较好的标本上可见二条深带 此臂 只有一个区 二 正常人 G 显带核型分析 1 每位同学发两张正常人外周血淋巴细胞 G 显带中期分裂相照片 其中一张将染色体 按其轮廓逐个剪下 根据其大小 带型特点和着丝粒位置 依次分组 配对 排放在核型 分析纸上 摆放时短臂向上 长臂向下 着丝粒位于铅笔画的横线上 多次调整检查无误 后 方可进行粘贴 2 将另一张照片适当剪小 粘贴在核型分析纸上方正中间 3 写出分析结果 注意事项注意事项 1 实验操作时 不宜面对剪下的染色体大声说话 咳嗽和打喷嚏 以免染色体吹跑遗 失 2 剪贴时应注意一对染色体要排列紧密 不要有间隔 而每对之间要有间隔 着丝粒 都要排列在横线上 上下线染色体要求对齐排列 3 X 染色体排列在 C 组旁 Y 染色体排列在 G 组旁 4 按染色体轮廓剪成长方形 以便排列 配对和粘贴 实验报告实验报告 1 每人剪贴分析一张正常人体细胞 G 显带中期分裂相染色体照片 2 简单说出 G 显带各号染色体带型的特点 3 进行性别诊断并写出核型 实验七 X 染色质标本的制备 目的要求目的要求 1 初步掌握 X 染色质标本的制备方法 2 观察熟悉人类间期细胞 X 染色质的形态特征 数目及所在部位 3 了解性染色质检查的临床意义 实验原理实验原理 X 染色质检查的重要临床意义在于性别的鉴定 在正常女性间期细胞核膜边缘常常可 以观察到一个被碱性染料浓染的 直径 1 微米左右的小体 这一小体 是由女性一条 失 活 的 X 染色体形成的 是不具有转录活性并呈异固缩状态的 X 染色质 也称 X 小体或巴 氏小体 女性另一条 X 染色体与其它染色体一样呈解螺旋状态 并具有转录活性 X 小体 的数目在女性中是性染色体数目减 1 正常女性细胞中有两条 X 染色体 所以仅有一个 X 小体 而具有三条 X 染色体的不正常女性 则有两个 X 小体 男性个体因只有一条 X 染色 体 而不发生异固缩 因而没有 X 小体 但先天性睾丸发育不全症患者 核型 47 XXY 在细胞核中也可见到 X 染色质 因此 可以通过 X 染色质数目的检查 鉴定胎儿的性别和 性别畸形 X 染色质大多位于核膜内侧缘 1 微米左右 深染 形状不一 有球状 扁凸状 三角 形和半圆形等 正常女性间期细胞中 X 染色质阳性检出率为 20 70 大多为 30 50 高时可达 70 以上 男性细胞中则平均低于 1 可采用口腔粘膜细胞 绒 毛细胞 羊水细胞等进行检查 实验准备实验准备 1 试剂 0 85 生理盐水 甲醇 冰醋酸 95 乙醇 硫堇染液 香柏油 二甲苯 加拿大树胶 2 器材 光学显微镜 离心机 小吸管 载玻片 烧杯 50mL 量筒 50mL 小吸头 牙签 片盘 镊子 擦镜纸 实验材料实验材料 人口腔粘膜细胞 实验内容 方法实验内容 方法 1 取 5mL 离心管 加入 5mL0 85 生理盐水 2 受试者嗽口后 用牙签刮取口腔颊部粘膜 置离心管中生理盐水中涮洗 弃掉牙签 用吸管轻轻吹打涮洗下来的细胞 以 1500r min 离心 10 分钟 3 弃上清液 加入新鲜配制的固定液 甲醇 冰醋酸 3 1 5mL 轻轻吹打均匀 室温固 定 10 分钟 4 1500r min 离心 10 分钟 弃上清液 留底物 加固定液 0 3 0 5mL 加入量视底 物量而定 轻轻吹匀后 将细胞悬液滴在清洁的载玻片上 每片约 2 滴 空气干燥 5 硫堇染色法 1 将空气干燥后的制片放入蒸馏水中漂洗数分钟 2 用 5mol L HCl 水解 10 分钟 3 蒸馏水中漂洗数分钟 中间可更换一次蒸馏水 充分洗掉 HCl 4 将制片置人硫堇染液中浸染 30 分钟 5 蒸馏水漂洗 晾干 6 加 50 酒精漂洗一次 7 70 酒精分色半分钟 8 95 100 酒精脱水各 1 2 分钟 9 二甲苯透明两次 1 2 分钟 加拿大树胶封片 6 镜检 100 个细胞 统计含有 X 染色质细胞所占的百分率 正常值 男性为 10 以 下或没有 女性为 40 以上 注意事项注意事项 1 口腔颊部刮片时 用力要适当 均匀 以求刮下的细胞可以观察到 X 染色质 2 掌握好盐酸水解的时间和温度 实验报告实验报告 1 绘出一个所观察的含有 X 染色质的口腔粘膜上皮细胞 2 镜检 100 个细胞 统计含有 X 染色质细胞的百分比 实验八 姐妹染色单体交换 目的要求目的要求 1 初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体姐妹染色单体分化染色技术 2 初步掌握 SCE 的观察及分析方法 3 了解 SCE 频率变化的意义 实验原理实验原理 姐妹染色单体分化染色技术可使中期染色体的两条染色单体着色深浅不同 能借以观 察姐妹染色单体交换 SCE 现象 姐妹染色单体交换 是指在染色体复制过程中 同一条染 色体上的两条姐妹染色单体在相同位置上发生的等位对称的片段交换 即两条姐妹染色单 体在 DNA 合成中核苷酸序列发生互相交换的现象 当细胞在含有 BrdU 5 溴脱氧尿嘧啶核苷 的营养液中增殖分裂时 由于 BrdU 是与脱 氧胸腺嘧啶核苷相类似的核苷 所以在 DNA 复制过程中 BrdU 可取代胸腺嘧啶核苷而参入到 新复制的 DNA 子链中 根据 DAN 半保留复制的规律 细胞在含有 BrdU 的营养液中进行第一 次 DNA 复制时 每个 DNA 双链中的一条单链为 BrdU 参入链 TB 型链 当第二次复制时 DNA 双链又经过一次半保留复制 其中一个 DNA 双链仍为 TB 型链 而另一个 DNA 分子的双链都 含有 BrdU 称 BB 型链 因此 第二周期中的每条染色体的两条姐妹染色单体中 DNA 分子 一个为 TB 型 DNA 分子 一个为 BB 型 DNA 分子 由于双链都含有 BrdU 的 DNA 双链螺旋化程 度较低而降低了与某些染色剂的亲和力 所以经 Giemsa 染色后含有 BB 型 DNA 分子的染色 单体比含有 TB 型 DNA 分子的染色单体染色浅而出现色差 在普通光学显微镜下即可观察到 第二周期中一条中期染色体的两条染色单体 显示出深浅不同的颜色 如果在某些因素的 作用下两条染色单体间发生了等位片段的交换 则可以很容易观察到 这种交换的多少即 为交换率 现已证明 许多诱变剂 致癌剂和致畸剂可诱发染色体畸变和 SCE 频率增高 但 SCE 频率的改变比染色体畸变灵敏得多 而且有害物质毒性越强 SCE 频率就越高 表 现出很好的剂量 效应关系 因此 SCE 技术已成为检测致突变物和致癌物的一种常用手 段 SCE 分析可作为 DNA 损伤修复研究中一项有意义的指标 实验准备实验准备 1 试剂 2 SSC 溶液 Giemsa 染液 香柏油 二甲苯 BrdU 500 g mL 2 器材 光学显微镜 恒温水浴锅 黑光灯 20W 饭盒盖 擦镜纸 小吸管 小吸 头 黑布和扣染用玻璃板等 实验材料实验材料 加 BrdU 营养液培养的外周血淋巴细胞染色体标本制片 实验内容 方法实验内容 方法 一 血培养和染色体标本制备 在进行外周血淋巴细胞培养时 5mL 培养液中加入 BrdU 500 g mL 0 1mL 使培养液 中 BrdU 的最终浓度为 10 g mL 加入抗凝血后用黑布包裹 避光培养 72 小时 按常规 进行染色体的标本制备 二 姐妹染色单体差别染色 一 方法一 1 常规方法制片后 空气干燥 将标本制片置 370C 温箱中烤 24 小时 2 将染色体制片放在培养皿内牙签上 细胞面朝下 盖一张擦镜纸 滴加适量 2 SSC 溶液 以浸透擦镜纸 充分覆盖细胞面 3 将培养皿置于 55 恒温水浴锅的水面上 4 用 30 瓦紫外灯垂直照射标本 30 分钟 照射距离 10cm 5 照射完毕 用自来水冲洗标本 空气干燥 6 用 10 的 Giemsa 染液扣染 10 分钟 7 自来水冲片 空气干燥 镜下观察 二 方法二 1 将新制片置 370C 温箱中三天 2 依次浸入 0 4M NaCl 溶液 0 004M KCl 溶液和 0 01M PBS 溶液中各 5 分钟 3 用 Hoechst 33258 荧光染液染色 20 分钟 然后用 0 01M PBS 液冲洗 2 次 4 见方法一之 2 3 5 用黑光灯照射 30 40 分钟 6 见方法一之 5 8 三 SCE 的观察与计数 在显微镜下 选择染色体分散良好 数目完整 染色体长度适宜的分裂相观察 首先 应区别第一 二 三周期中期分裂相染色体 Giemsa 染色的特点 第一周期两条染色单体全 部深染 第二周期 一条染色单体浅染 另一条染色单体深染 第三周期 可出现两条染 色单体均为浅染的分裂相 只要有一条染色体的两条染色单体相同位置都浅染 就可判定 为第三周期 SCE 计数 凡在染色体端部出现的交换 记为一个 SCE 在染色体的长臂或短臂中间出 现交换 记为两个 SCE 在着丝粒部位发生交换 排除着丝粒部扭转 记为一个 SCE 观察 记数 20 个中期分裂相 计算出每个细胞的 SCE 平均值 即为该个体的 SCE 交换频率 由于 BrdU 本身可致畸 如浓度过高可引起自身 SCE 频率本底的增高 因此应设正常对照组 实验报告实验报告 1 在自己的制片中找到三个不同周期的中期分裂相 2 简述姐妹染色单体差别染色的原理 3 观察计数 20 个分裂相 并计算出每个细胞 SCE 的平均值 实验九 微核检测技术 目的要求目的要求 1 掌握人体外周血淋巴细胞微核检测技术 有丝分裂阻断法微核检测技术 2 熟悉微核的形态特征 3 了解微核检测的实际意义和应用范围 实验原理实验原理 微核是游离于细胞质中的核物质小体 其大小一般是主核的 1 3 1 4 微核是染色体 畸变的一种特殊表现形式 是由细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在子代细胞 分裂间期的细胞质中形成的游离团块物 由于染色体受化学诱变剂和辐射损伤而断裂成一 些无着丝粒的染色体断片或受到纺锤体的毒物作用 纺锤体受到损伤 当细胞进入分裂后 期时 不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近 在末期以后 单独形成一个或几个规则的次 核 包含在子细胞的胞质内 由于比主核小得多 故称微核 微核同主核一样 是由 DNA 物质所组成 现已证实 微核率同外界作用因子的剂量呈线性正比关系 因此 微核检测 技术已广泛应用在辐射防护 损伤 化学诱变剂研究和新药 保健食品的毒理实验中 微核的形成需要经过一次细胞分裂 有丝分裂阻断法微核检测技术是利用一定浓度的 细胞松弛素 B 阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂 故在淋巴细胞培养过程 中加入细胞松弛素 B 使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核 选择这部分细胞进行微核计数 而提高了实验的敏感性 同时也成为检测致突变 致癌 致畸物质对机体遗传效应的一种 重要手段 实验准备实验准备 1 试剂 已配好的营养液 20 小牛血清 80 RPMI 1640 PHA 100 g mL 浓度的 细胞松弛素 B 0 075moL L KCl 甲醇 冰醋酸固定液 3 1 Gierma 染液 香柏油 二 甲苯 2 器材 超净工作台 光学显微镜 附照相设备 隔水式恒温培养箱 离心机 冰箱 高压蒸汽消毒锅 鼓风干燥箱 无菌正压滤器 分析天平 感量 1 10 毫克 架盘天平 链霉素培养瓶及瓶塞 肝素小瓶及瓶塞 取血用 10mL 吸管 直头小吸管 5mL 刻度离心 管 2mL