HIV筛选试验的原理

1,HIV筛选试验的原理、方法、应用及其质量保证湖南省临床检验中心 吕岳峰,2,第 四 章HIV筛选试验原理,3,一、献血者HIV筛选,1、最安全的献血者应具备的条件健康 在考虑献血者筛选HIV的特异性筛选检测方法时，应该记住安全供血取决于健康的献血者。 最安全的献血者：固定的、志愿的、无偿的。,4,2、献血者HIV筛选的意义防止HIV的传播防止其它传染病原体的传播节约人力、财力,5,二、试验原理,用于检测HIV抗体基本筛选方法主要有三种： 1、酶联免疫吸附试验(ELISA/EIA) 2、颗粒凝集试验 3、特异性快速试验,6,在选择最恰当的方法使用时，需考虑的一些特性： 试验的原理 复杂性 反应时间 敏感性 特异性 不同情况下的适用性 有效性 费 用,7,这三种试验都基于相同的生物学原理，并包含相同的两大基本步骤： 1、样品中特异性抗原或抗体的存在是通过其与包被的抗体或抗原结合，形成抗原抗体免疫复合物而完成标准的免疫学反应来证明的。 2、免疫复合物形成后由指示系统来检测。,8,术语：,在我们仔细研究检测方法之前，先弄清在表述筛选结果时下列术语的用法： 阳性/阴性 反应/无反应 可疑,9,“阳性”和“阴性”只能用于描述献血的初次试验结果被一次或多次检测进一步确证后的结果。在被确证前，实验结果应被定为“反应”或“无反应”。实际上，对无反应的筛选结果一般不再进行进一步研究，仅对有反应的结果进行确证。 WHO术语中称一个不能被明确地划分阳性或阴性(通常处于Cutoff值周围)的结果为可疑(不确定)。,10,三、酶标免疫技术EIA(ELISA),EIA有多种形式，既可用于检测抗原也可用于检测抗体。一般来讲，最简单常用的检测HIV抗体方法是利用固相抗原捕获样品中特异的HIV抗体。,11,根据固相抗原的不同来源试剂盒分四代：第一代使用的是纯化的或未经纯化的天然病毒或是被病毒感染细胞培养后的细胞溶解产物。第二代使用重组抗原，它通过将病毒核酸片段整合到酵母菌内，经基因工程使该酵母菌大量扩增，再纯化病毒蛋白质等步骤获得。第三代使用通过化学合成法人工合成的病毒多肽。 目前已有第四代试剂盒,它是在第三代试剂盒的基础上增加了P24抗体,故能同时检测HIV抗原和抗体.,12,这里介绍两种反应原理相同，但抗原包被的方法不同的EIA ： 1、包被微孔（聚苯乙烯），即通常所见的96孔板,简称微孔法。 2、包被小珠（聚苯乙烯小珠），小珠直径约4mm：即通常所见的20/60孔Abbott小珠,简称珠法。,13,下面先介绍微孔法：,它可分三种类型： 抗球蛋白型EIA：这是EIA的最简单形式，样品中的病毒抗体与固相病毒抗原结合，然后通过酶标抗人球蛋白抗体被检测。,14,竞争型EIA：这一方法稍微复杂些，标本中可能存在的天然抗体与酶标记的特异抗体竞争固相抗原上的结合位点。 夹心型EIA：这是一种高特异性的EIA法，标本中的病毒抗体与固相抗原结合，然后通过结合的酶标记抗原被检测。,15,第一种：抗球蛋白型EIA方法学(HIV抗体筛选) 1、包被：抗原吸附于微孔板表面形成固相抗原的过程(见图12),图12,16,各孔中加入含抗原的碳酸氢盐缓冲液，放4孵育12-16小时，因制造微孔板的塑料能够结合蛋白质，便完成包被。孵育后，弃去抗原溶液，用蒸馏水或特殊性缓冲液洗涤，并使之迅速干燥。保存在4，放置很长时间也不会有抗原丢失。通常这些板由生产商包被和标化后提供。,17,2、加样和孵育：血清或稀释后血清加入孔中，或者血清加入已包含稀释液的孔中，它们在限定的时间和准确的温度下温育，温育时间可以30分钟至2小时，温度可以18-45。每块板上设一定数量的阳性和阴性对照孔，以及低值阳性对照。在这段时间内，测试血清中存在的特异性抗体与病毒抗原结合。(见图13),18,图13,19,3、洗板：洗去孔内的游离血清(见图14),图14,20,4、加酶标记物和孵育(见图15）,图15,21,图16,5、洗板（见图16),22,6、显色 (见图17),图17,23,7、加稀酸溶液终止反应。 8、读取微孔中溶液的吸光度（光密度）值（OD值），并判断试验的结果。,24,第二种：竞争型EIA方法学（HIV抗体筛选） 竞争型EIA的基本原理与抗球蛋白型EIA相同：HIV抗体与固相抗原结合，然后检测出标本中存在的抗体。,25,但竞争型EIA与抗人球蛋白型EIA在抗体的检测方法上略有不同，加待测血清到已包被抗原的微孔，同时加入酶结合物，样品和酶结合物同时孵育。酶结合物是酶标HIV抗体，而不是酶标非特异性抗人IgG抗体。酶标HIV抗体与标本中的HIV抗体竞争抗原的结合位点。酶标抗体浓度水平被设定为低于标本中的HIV抗体最小浓度以保证后者优于酶标HIV抗体而与抗原结合。,26,下面是基本的检测步骤： 1、抗原包被于微孔表面上（见下图）。,27,2、加入血清、加入酶结合物，孵育(见图18)。,图18,28,3、孵育结束，洗去游离的血清和酶结合物。(见图19),图19,29,4、各孔中迅速加入底物溶液，在规定的温度(通常18-25)、时间条件下孵育。(见图20),图20,30,5、孵育结束，加入稀酸溶液终止反应。 6、读取孔内溶液OD值，判断实验结果。 不存在HIV抗体的测试样品中，酶标抗体被结合，酶激活底物使之显色。存在HIV抗体的测试样品中，HIV抗体的存在阻止了酶标抗体的结合，这样酶就很少甚至不存在。所以只有很少甚至无底物激活和颜色产生。,31,第三种：夹心型EIA方法学（筛选HIV抗体） 夹心EIA的基本原理与抗球蛋白EIA相同：HIV抗体与固相抗原结合而被检测出。,32,注意在检测抗体的方法上与前两者略有不同，比如酶结合物不同于抗球蛋白型的酶标抗人IgG抗体，也不同于竞争法酶标抗体,而是酶标合成抗原。在孵育过程中，酶结合抗原与已经和固相抗原结合的抗体结合成“夹心”式即抗原抗体抗原复合物。这个方法的主要优点是它的特异性，假阳性反应的数量降低。,33,方法学： 1、抗原包被于微孔表面，如前所述(见下图),34,图21,2、加入血清或稀释的血清，孵育(见图21),35,3、洗板后加入酶结合抗原孵育（见图22）,图22,酶结合抗原,36,4、洗板。 5、加底物溶液见图23.,图23,酶结合抗原,37,6、孵育后，加终止液终止反应。 7、读取OD值，判断实验结果。 存在HIV抗体的样品孔显色。,38,现在介绍珠法： 珠法与微孔法不同是，抗原包被于聚苯乙烯珠子上，加样品和对照品到多孔塑料反应板孔中，再加各种试剂和珠子到含有样品的孔中，然后在孔内洗珠子，并加其他试剂于孔中，反应发生于珠子表面。至于试剂和一般步骤与微孔法相同。,39,珠法优点：珠子可拿出试管外，可减少干扰，珠子表面积大，大于微孔约5倍。 缺点：用珠法测定需要特殊的仪器设备，这仪器被设计成只能适用于珠子和其反应盘工作，但它的工作方式与微孔法的洗涤仪和读数仪相同。珠子表面抛光程度难一致，使其重复性差。,40,大多数商业性测试手段都是微孔板法，目前唯一被广泛采用的商业化的珠法试剂是由Abbott公司生产的。,41,四、HIV抗原筛选,采用夹心法EIA筛选检测HIV抗原（HIV-Ag）。HIV-抗原和HIV抗体筛选试验区别在于HIV-抗原筛选采用抗体抗原抗体夹心，HIV抗体筛选采用抗原抗体抗原（酶结合物）夹心。,42,值得注意的是夹心法的包被抗体通常是单克隆抗体。酶结合物是酶标记的特异性抗体，通常也是单克隆抗体。,43,基本方法如下： 1、抗体包被于微孔表面。 2、血清或稀释血清加入孔中，在规定的时间和适当的温度下孵育。其间，待测标本中存在的的HIV抗原与固相HIV抗体结合(见图24)：,44,图24,45,3、洗去血清。 4、加酶结合物。酶结合物与连接在孔内的HIV抗原结合（见图25）：,46,图25,47,5、孵育结束，洗板，洗去未结合的酶结合物。 6、加底物溶液（见图26）,48,图26,49,7、孵育后，加稀酸终止反应。 8、读取孔内溶液的OD值，判断结果。 待测样品中含有HIV抗原的孔，酶结合物与HIV抗原结合，并激活底物产生颜色。,50,五、EIA吸光度(OD)与结果判断,EIA的最终结果是一系列数据 OD值，它必须被转换成阴性和阳性结果。下图中是对献血者血清标本进行HIV抗体检测所得的结果（A列）。,51,52,为了能使用OD值，它们必须与已有的标准结果进行比较。这些结果是从与标本同时进行检测的质控品得出的。数值计算方法有许多种，但至少有三种计算在EIA是必不可少的。它们是：阳性与阴性对照的平均OD值计算，为了结果的有效性，该值必须落在厂商提供设定的范围内。最后，为了确定一个结果是反应性或无反应性，必须计算出Cut-off值。,53,在I型(抗球蛋白型)与型(夹心型)EIA中，高OD值，产生颜色，表明是有反应的结果，低OD值无颜色，表明是无反应的结果。因此高于Cut-off值为有反应的结果，低于Cut-off值为无反应的结果。,54,在II型EIA(竞争型)中，高OD值，产生颜色，表明是无反应的结果，低OD值，几乎无色，表明是有反应的结果。因此，Cut-off 以下的值为有反应的结果，Cut-off 以上的值为无反应的结果。,55,选定适当的Cut-off值在建立EIA时极为重要。 Cut-off 值的计算通常基于阴性对照OD值，首先计算出多个阴性对照的OD值的平均值，代入一个简单的公式，即可得出Cut-off值。经典公式是： Cut-off值=Ncm+0.2(Ncm：阴性对照均值),56,标准比率：是另外一种简单的计算。是为了直接比较不同板用同一方法、或一批标本用不同方法测试的结果，这种标准比率被称为测定值/Cut-off比率，即以每个标本的OD值除以Cut-off值。数值小于1为无反应结果，数值大于或等于1 为有反应结果。在竞争型EIA中，这种比率的计算是Cut-off/标本OD值(Cut-off除以标本OD值)。,57,下图是根据上图所作的，Cut-off点已标明，阴性和阳性的分布结果可一目了然。,图28,58,六、颗粒凝集试验,原理：颗粒凝集试验是通过包被了HIV抗原的颗粒的凝集来检测HIV抗体的存在。测HIV抗原不能用此方法。颗粒凝集从血凝法发展而来，后来又用明胶或胶乳制成的颗粒载体替代红细胞载体，两者测定原理相同。测定一般在微孔中进行，象珠法EIA一样，孔内不包被，仅作为试管之用。,59,优点：不需要昂贵的仪器,没有太多不同的步骤,不需要洗涤仪，并且能肉眼观察结果。,60,方法学： 1、HIV抗原在颗粒上固相化。 2、加入用样品稀释液稀释的待测样品和质控品。在微孔中进行稀释，最终稀释好的适当体积的样品被转移到新的、没有用过的微孔中，进行真正的试验。,61,3、加入致敏(固相)颗粒，孵育。 4、孵育结束后，肉眼观察结果。有反应的结果在孔的底部散布粗糙的凝集颗粒。无反应的结果在孔的周围出现点状或环状的非凝集性颗粒（见图29）,62,图29,63,快速旋转法另一种颗粒凝集法，通常称为快速旋转法。 步骤：与颗粒凝集步骤1-3相似，仅稍作改动。该方法颗粒的浓度减少了十倍，孵育时间明显缩短，微孔板在特制的微孔板离心机上进行中速离心，颗粒经过离心增强了与抗体的凝聚力，缩短了反应时间，然后将平板置于大于70的斜面上，10-15分钟之后，即可观察结果。,64,有反应的结果在孔的中央出现点状凝集，无反应的结果表现为非凝集颗粒沿斜面分布（见图30），这个方法不是生产商提供的标准方法，但其快速、灵敏和价格廉价的方法，适应血站的大批量筛选应用。,65,图30,66,七、特异性快速法,特异快速法，它既简单又迅速，其将颗粒凝集法的简便性与EIA技术相结合。用于检测HIV抗体,检测HIV抗原的相应方法尚未问世。,67,类型：特异性快速法有许多不同的类型。如金标记法、EIA法，基本类型是将HIV抗原包被于渗透性或半渗透性的膜或板条上，并且以测试单份标本的方式提供给样品和其他反应试剂。大多数特异性快速法都有相应试剂盒。盒内装有所检测试剂。,68,方法学 1、加入稀释样品，如果标本中存在HIV抗体，就能与包被的HIV抗原结合。 2、孵育其时间较短，通常仅5-10分钟，因为抗原包被于渗透膜上，