引物设计OLIGO图解

在专门的引物设计软件中 Oligo 是最著名的 它的使用并不十分复杂 但初学者容易被其复杂 的图表吓倒 Oligo 5 0 的初始界面是两个图 Tm 图和 G 图 Oligo 6 0 的界面更复杂 出现三 个图 加了个 Frq 图 Oligo 的功能比 Premier 还要单一 就是引物设计 但它的引物分析功能 如此强大以至于能风靡全世界 oligo 的下载和安装我就不多说了 打开 oligo 相信也无需多讲 打 开 oligo 的页面如下 单击 file 菜单再点 open 或点击 打开 快捷图标或者用快捷键 CTrl O 可打开下面的窗口 在打开的 OPEN 窗口内选择 FreqSeq 再点 打开 选择 drosfr 或者其它一个文件点击 打开 出现以下窗口 点击 window 再点击 Tile 出现以下窗口 图中显示的三个指标分别为 Tm G 和 Frq 其中 Frq 是 6 0 版本的新功能 为邻近 6 至 7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率 该频率高则可增加错误 引发的可能性 因为分析要涉及多个指标 起动窗口的 cascade 排列方式不太方便 可从 windows 菜单改为 tile 方式 如果觉得太拥挤 可去掉一个指标 如 Frq 这样界面的结构同于 Oligo 5 0 只是显示更清楚了 G 值反映了序列与模板的结合强度 最好引物的 G 值在 5 端和中间值比较高 而在 3 端相 对低 如图 Tm 值曲线以选取 72 附近为佳 5 到 3 的下降形状也有利于引物引发聚合反应 Frq 曲线为 Oligo 6 新引进的一个指标 揭示了序列片段存在的重复机率大小 选取引物时 宜选 用 3 端 Frq 值相对较低的片段 再点击 Search 再点 Fo r Primers and probes 或使用快捷键 F3 出现以下窗口 点 OK 就 OK 了 当然你也可以点击 Prameters 和 Search Range 选择你要 的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度 出现 Search Status 窗口 点 OK 出现 Primer pairs 窗口 代表引物对的编号 依次为引物对所处的位置 产物的长度 最适 合的退火温度 和 GC 的百分含量 点击任一行出现 PCR 窗口 告知你扩增片断的位置 最合适的退火温度等等信息 关掉 PCR 窗口 和 primer Pairs 窗口 回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置 图中 手型鼠标所指即为引物序列 至此引物设计已经完成 你可以用 Analyse 菜单分析你的引物 有无引物二聚体 发卡结构 等等 当上下游引物全选好以后 需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改 首先检查引物 二聚体尤其是 3 端二聚体形成的可能性 需要注意的是 引物二聚体有可能是上游或下游引物自 身形成 也有可能是在上下游引物之间形成 cross dimer 二聚体形成的能值越高 越不符合 要求 一般的检测 非克隆 性 PCR 对引物位置 产物大小要求较低 因而应尽可能选取不形 成二聚体或其能值较低的引物 第二项检查是发夹结构 hairpin 与二聚体相同 发夹结构的 能值越低越好 一般来说 这两项结构的能值以不超过 4 5 为好 当然 在设计克隆目的的 PCR 引物时 引物两端一般都添加酶切位点 必然存在发夹结构 而且能值不会太低 这种 PCR 需要 通过灵活调控退火温度以达到最好效果 对引物的发夹结构的检测就不应要求太高 第三项检查 为 GC 含量 以 45 55 为宜 有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高 导致引物的 GC 含量不能 被控制在上述范围内 这时应尽量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近 以有利于退火温 度的选择 好了 oligo 使用的简单介绍到此结束 在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能 操作如下 点击 File 菜单中的 New Sequence 命令 在窗口中输入上游引物 如果该引物的首位置不是 1 的话 可以在 Edit 窗口中输入新的 5 端位置数字 如 20 点击 Accept Discard 菜单的 Accept 命令 如果引物序列长度不同于当前的引物的话 可以从 Change 菜单中改变当前的引物长度 选取当前序列为上游引物 点击 upper 按钮 从 Edit 菜单中选取 Lower Primer 命令 在 Edit Lower 窗口中输入下游引物的序列 在 Edit 窗口的上角处 输入相应的 5 位置 选取 Accept and Quit 命令 如果想让程序给出最佳退火温度 在此时的对话框中输入 PCR 产物的长度以及 GC 含量所占百分比 一般哺乳动物的 cDNA 序列中 GC 大约占 44 点击 OK 就可以在 Analyze 菜单中完成各种分析了 关于引物的评价有几点 duplex formation 这是评价引物二聚体形成的 包括自身形成二聚体和引物间二聚体 主要 是看引物 3 端有无配对碱基 最好没有 其中的 current oligo 是当你对引物进行了编辑 如加入酶 切位点 时 对原始引物进行的分析 下同 形成的二聚体要看能值 G 得它不会输入啊 能 值越低越好 最好不要超过 4 5 下同 hairpin formation 这是看引物自身能否形成发夹结构 主要也是看 3 端不要形成发夹结构 还要看形成发夹结构的能值 不超过 4 5 如果引物中加入酶切位点 可能会有发夹结构且能值不 会太低 这就需要灵活控制退火温度了 composition and Tm 分析上下游引物的碱基组成 GC 比和 Tm 值 原则我就不多说了 false priming site 如果模板不是基因组 DNA 而是一个特定模板序列 需要进行错配的分析 看你的引物 尤其 3 端 是否与特定模板的其他位点结合 一般错配的引发效率以不超过 100 为 好 但并不绝对 如果正确结合位点的引发效率为 450 以上 而有一个错配的引发效率是 120 左 右的