浅析分光度光学仪器使用指南

检测仪器 XC5R分光度光学仪器种类繁多，但其实也不外乎简易型、中档型和高档型三种，而三种仪器挑选使用的规则也是颇多的，下面就此来介绍一下其使用指南。1.波长检测范围，波长选择方式：越高档的仪器波长检测范围越宽，当然价格也较高，用户需要根据自己的需求选择合适的波长范围;对于简单型的仪器，波长选择方式一般是手动查找，这种方式的重复性较差，高档型的仪器中波长可以按照设定模式自动查找或扫描，其次高档型的波长扫描速度的档位也会增加。2.光束：光束类型分为单光束型，双光束型或准双光束型。单光束一般适于在给定波长处测量吸光度，不能作全波段光谱扫描，并且要求光源和检测器具有很高的稳定性;双光束可以自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析;假双光束也就是比例双光束，优点是可以监测光源变化带来的误差，它的原理是由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。但是这种方式并不能消除参比造成的影响。3.光源：可见光区主要用钨灯，卤钨 (3202500nm);紫外区主要用氢灯，氘灯(180375nm);氙灯在紫外和可见光区均可用作光源。4.样品支架：简单的样品支架为推拉式四联池架，一次只能测量一个样品，参比和样品分两次测量;高档型的样品池支架为两个固定式，分别是样品通道和参比通道，可以同时测量参比和样品的吸光值。5.狭缝：简易型的狭缝一般是固定宽度模式，狭缝宽度多数为 2nm,也有 1.5nm 的;高档型的仪器狭缝均为连续可调型，可以适应高分辨率的需要。6.光学性能指标：光学性能的高低直接影响到测量的准确性，其中光栅的技术指标尤为重要。高档型仪器的光栅质量较好，一般最佳的光栅为凹面型，并且大尺寸的凹面光栅对应的刻槽数越多，因此在分辨率和杂散光方面指标要优于简易型仪器。7.检测器：检测器是利用光电效应，将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。简易型仪器一般采用光敏二极管;中档型仪器采用硅光二极管;高档型仪器的检测器使用高灵敏度的光电倍增管和红外检测器。8.显示器：简易型仪器多为机械表头或数码管显示器，没有数据处理器;高档型仪器的显示器为液晶式或连接电脑，数据处理可由仪器自身具有的或外接计算机处理。9.测量模式：简易型仪器多为定点(固定波长)吸光度或透过率测量方式，基本不能进行波长扫描测量;高档型仪器的测量模式较多，可以显示透过率、吸光度、浓度直接读数、单光束，单点及扫描均可。10.测量附件：衡量仪器质量高低的重要方面是看仪器是否具有丰富的附属测量器件，如偏振附件、积分球附件、反射附件、自动进样器附件、色度分析软件、薄膜附件。11.测量样品的状态：可见和紫外的分光光度计一般测量液态样品，红外分光光度计一般能分析各种状态(气、液、固)的试样。酶的专一性在生物进化上演化了上百万年，抗体的专一性的形成只需要几个星期而已。现在我们可以借助物理和合成化学的发展，利用免疫系统巨大的细胞和分子网络产生催化抗体。在 7080 年代，W.P.Jencks 预言，抗某个反应过渡态的抗体具有催化该反应的能力。1975 年前后，抗体酶处于探索的开始阶段，一般采用诱导法、引入法进行尝试，一般效率很低，有的还测定不出活性。1975 年时， G.KohlerC.Milstein 发明了单克隆抗体技术后，就有了后来的抗体酶。1986 年，美国的 Schultz 小组研究对硝基苯酚磷酸胆碱脂(pNPPC)相应的羧酸二酯水解反应的过渡态类似物时，推测用这个过渡态类似物作半抗原。这样的分析，后来的确从中选出了两株有催化活性的单克隆抗体，一株 MOPC167 的水解速度达到了 1.2x103 倍。 经过测定，这个抗体酶符合米氏方程，具有底物专一性、pH 和需要一定的温度等酶的催化特征。结果表明底物类似物的结构与抗体酶有关。另一实验：合成一个含吡啶甲酸的磷酸酯化合物用这个过渡态类似物作半抗原免役小鼠，得到 12 株单抗。结果：3 株有抗体酶活性，其中一株 6D4 能与半抗原分子结合外，还能催化不含吡啶甲酸的相应磷酸酯化合物水解，速度快 103 倍，具有底物专一性和对 pH 的依赖性。用半抗原可以竞争性地抑制这个反应。还发现单抗的结合位点的氨基酸改变，可以影响它的催化活性。抗体酶的特点：在专一性方面超过或相当于我们讲的普通酶。在反应速度方面接近普通酶。更多的为低些的抗体。原因：因为抗体酶没有结构的诱导等动态变化；产物释放困难；底物、产物的交换困难等。1、能催化一些天然酶不能催化的反应q 有许多化学反应还没有已知酶催化进行q 抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性q 抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶的催化反应类型u 转酰基反应u 水解反应uClaisen 重排反应u 酰胺合成反应uDiels-Alder 反应u 转酯反应u 光诱导反应u 氧化还原反应u 脱羧反应u 顺反异构化反应2、有更强的专一性和稳定性q 抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子q 抗体酶催化反应的介质效应半抗原：一类小分子化合物，本身不能诱导免疫应答，只有当它共价结合到具有免疫性的蛋白质后，注射动物才能诱导小分子物质的抗体产生。设计抗体酶的通用模式：设计一个在空间上和电荷上都与反应过渡态结构相似的稳定分子，以此分子做半抗原与一载体蛋白共价结合，免疫、诱导产生能结合该半抗原且能催化与半抗原相应的底物分子转化的抗体克隆，其底物专一性通过对半抗原结构的调整来实现。1、半抗原设计中应考虑：(1)产生的抗体能否具有预期的催化活性。(2)能否刺激机体免疫应答。2、半抗原结构与催化抗体之间的关系：(1)半抗原结构中应含有芳香结构(具较强的免疫原)。(2)催化抗体和半抗原的亲和力。(3)诱导羧酸酯、酰胺水解的催化性抗体，可利用其具有四面体结构的高能过渡态类似物为抗原。(4)半抗原设计应考虑催化反应的环境与反应机制。二、抗体酶如何生产？1、拷贝法：用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫，获得抗酶抗体；再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗体，抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。优点:可以大量生产单克隆抗体酶缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。2.诱导法或者细胞融合法：先用特定的半抗原(过渡态底物决定) 与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)，此偶联的物质作为抗原免疫动物，产生抗体产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。用标准单克隆抗体技术来制备、分离、筛选抗体酶。我们知道过渡态复合物是个不稳的中间态形式，有些只是理论推测，其结构我们还不知道，所以这里第一步是正确的过渡态复合物的设计。如酯水解的过渡态复合物是个带电的四面体结构，想法设计一个带电的磷酸酯为过渡态复合物，其中苯基和苯酚基可以改变，也就可以制造各种结合专一性抗体酶。例子：用一个环化的磷酸酯做过渡态类似物免疫兔子，得到催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯；不但速度快，而且产物中一种对映体含量高 94%，就因为有了抗体酶的加入。3引入法(辅助因子) ：是用选择性的化学修饰、基因工程或者蛋白质工程方法，将催化基团和辅助因子引入抗体的抗原结合部位。Schultz 等人在 IgAMOP315 抗体结合部位选择性引入巯基，然后用亲和色谱纯化。结果：它水解香豆酯的速度比对照高 6103 倍。酶的活性中心很多有金属离子。Lerner 等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺 Co3+盐作为金属离子辅因子，半抗原分子带有一肽键，通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连，再共价连接在载体蛋白上，免疫动物后产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键，其转化数达 6104。4.用生物工程的方法产生抗体Scripps 研究院的研究人员开创了一项技术-在体外制造抗体片断即Fab 片断，然后组成催化剂。抗体酶有这样的片断就行，无须完整的抗体分子。用抗原免疫小鼠，分离经诱导产生抗体的重链基因 上海義森生物科技有限公司 抗體酶 抗體與酶的異同： 相同點：都是蛋白質，都有特異性。 不同點： 1)抗體無催化活力，酶有催化活力。 2)本質差別：酶是能與反應過渡態選擇結合的催化物質，抗體是和基態緊密結合的物質。 3)酶的活性和合成受到代謝調節，種類有限。抗體隻有在抗原存在時才產生，種類無限。 抗體酶(abzyme、catalyticantibody) 抗體酶首先是抗體，具有高度選擇性，同時又具有酶提高化學反應速度。所以 抗體酶賦予抗體分子和酶兩個不同的屬性。 一、抗體酶研究背景 1948 年 LinusPauling 提出瞭酶的過渡態催化理論，被認為酶和底物結合不是在 基態上，因為酶與基態底物的結合十分困難，需要克服很大的能障。過渡態結構十 分容易與酶結合，因為酶結構經過底物誘導等，親和力最強。十分容易越過能障， 加速催化速度。所以，酶具有催化速度快和高選擇性。 而抗體的特征是多樣性和專一性，被認為一種抗原產生 108 種不同的抗體，抗體 和抗原的專一結合超過瞭酶的專一性，抗體酶專一性更高。 酶的專一性在生物進化上演化瞭上百萬年，抗體的專一性的形成隻需要幾個星 期而已。 現在我們可以借助物理和合成化學的發展，利用免疫系統巨大的細胞和分子網 絡產生催化抗體。 在 7080 年代，W.P.Jencks 預言，抗某個反應過渡態的抗體具有催化該反應的 能力。 1975 年前後，抗體酶處於探索的開始階段，一般采用誘導法、引入法進行嘗試， 一般效率很低，有的還測定不出活性。 1975 年時， G.KohlerC.Milstein 發明瞭單克隆抗體技術後，就有瞭後來的抗 體酶。 1986 年，美國的 Schultz 小組研究對硝基苯酚磷酸膽堿脂(pNPPC)相應的羧酸二酯水解反應的過渡態類似物時，推測用這個過渡態類似物作半抗原。 這樣的分析，後來的確從中選出瞭兩株有催化活性的單克隆抗體，一株 MOPC167 的水解速度達到瞭 1.2x103 倍。 經過測定，這個抗體酶符合米氏方程，具有底物專一性、pH 和需要一定的溫度等酶的催化特征。 結果表明底物類似物的結構與抗體酶有關。 另一實驗：合成一個含吡啶甲酸的磷酸酯化合物用這個過渡態類似物作半抗原免役小鼠，得到 12 株單抗。 結果：3 株有抗體酶活性，其中一株 6D4 能與半抗原分子結合外，還能催化不含吡啶甲酸的相應磷酸酯化合物水解，速度快 103 倍，具有底物專一性和對 pH 的依賴性。 用半抗原可以競爭性地抑制這個反應。還發現單抗的結合位點的氨基酸改變，可以影響它的催化活性。 抗體酶的特點： 在專一性方面超過或相當於我們講的普通酶。 在反應速度方面接近普通酶。更多的為低些的抗體。 原因：因為抗體酶沒有結構的誘導等動態變化；產物釋放困難；底物、產物的 交換困難等。 1、能催化一些天然酶不能催化的反應 q 有許多化學反應還沒有已知酶催化進行 q 抗體的多樣性決定瞭抗體酶催化反應類型多樣性 q 抗體酶可以根據需要人工裁制 抗體酶的催化反應類型 u 轉酰基反應 u 水解反應 uClaisen 重排反應 u 酰胺合成反應 uDiels-Alder 反應 u 轉酯反應 u 光誘導反應 u 氧化還原反應 u 脫羧反應 u 順反異構化反應 2、有更強的專一性和穩定性 q 抗體的精細識別使其能結合幾乎任何天然的或合成的分子 q 抗體酶催化反應的介質效應 半抗原：一類小分子化合物，本身不能誘導免疫應答，隻有當它共價結合到具 有免疫性的蛋白質後，註射動物才能誘導小分子物質的抗體產生。 設計抗體酶的通用模式： 設計一個在空間上和電荷上都與反應過渡態結構相似的穩定分子，以此分子做 半抗原與一載體蛋白共價結合，免疫、誘導產生能結合該半抗原且能催化與半抗原 相應的底物分子轉化的抗體克隆，其底物專一性通過對半抗原結構的調整來實現。 1、半抗原設計中應考慮： (1)產生的抗體能否具有預期的催化活性。 (2)能否刺激機體免疫應答。 2、半抗原結構與催化抗體之間的關系： (1)半抗原結構中應含有芳香結構(具較強的免疫原)。 (2)催化抗體和半抗原的親和力。 (3)誘導羧酸酯、酰胺水解的催化性抗體，可利用其具有四面體結構的高能過 渡態類似物為抗原。 (4)半抗原設計應考慮催化反應的環境與反應機制。 二、抗體酶如何生產？ 1、拷貝法：用已知的酶作為抗原對動物進行第一次免疫，獲得抗酶抗體；再 用抗酶抗體作為抗原進行第二次免疫獲得抗抗體，抗抗體實際上就是具有原來酶活 性的抗體酶。 優點:可以大量生產單克隆抗體酶 缺點:有相當大的盲目性和偶然性，並不能產生新酶。 2.誘導法或者細胞融合法： 先用特定的半抗原(過渡態底物決定) 與載體蛋白相連(如牛血清白蛋白等)，此 偶聯的物質作為抗原免疫動物，產生抗體產生抗體的脾臟細 胞與骨髓融合，然後在體外培養，雜交體克隆化，然後繁殖成單一細胞或菌落單一 細胞或菌落產生抗體。用標準單克隆抗體技術來制備、分離、篩選抗體酶。 我們知道過渡態復合物是個不穩的中間態形式，有些隻是理論推測，其結構我 們還不知道，所以這裡第一步是正確的過渡態復合物的設計。 如酯水解的過渡態復合物是個帶電的四面體結構，想法設計一個帶電的磷酸酯 為過渡態復合物，其中苯基和苯酚基可以改變，也就可以制造各種結合專一性抗 體酶。 分光度光學儀器種類繁多，但其實也不外乎簡易型、中檔型和高檔型三種，而三種儀器挑選使用的規則也是頗多的，下面就此來介紹一下其使用指南。1.波長檢測范圍，波長選擇方式：越高檔的儀器波長檢測范圍越寬，當然價格也較高，用戶需要根據自己的需求選擇合適的波長范圍;對於簡單型的儀器，波長選擇方式一般是手動查找，這種方式的重復性較差，高檔型的儀器中波長可以按照設定模式自動查找或掃描，其次高檔型的波長掃描速度的檔位也會增加。2.光束：光束類型分為單光束型，雙光束型或準雙光束型。單光束一般適於在給定波長處測量吸光度，不能作全波段光譜掃描，並且要求光源和檢測器具有很高的穩定性;雙光束可以自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合於結構分析;假雙光束也就是比例雙光束，優點是可以監測光源變化帶來的誤差，它的原理是由同一單色器發出的光被分成兩束，一束直接到達檢測器，另一束通過樣品後到達另一個檢測器。但是這種方式並不能消除參比造成的影響。3.光源：可見光區主要用鎢燈，鹵鎢 (3202500nm);紫外區主要用氫燈，氘燈(180375nm);氙燈在紫外和可見光區均可用作