食品毒理学致癌毒性2014

第18章 化学致癌作用的研究,恶性肿瘤严重威胁人类健康的常见病多发病目前肿瘤发病率不断上升 全世界每年新发生肿瘤约900万人，死亡约700万人。我国每年新发生肿瘤约160万人，死亡约130万人。发病年龄年轻化在许多国家已成为仅次于心血管疾病的第二大死亡原因,一、致癌作用的概念,致癌作用是指环境有害因素引起或增进正常细胞发生恶性转化并发展为肿瘤的过程。 化学致癌(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程，具有这种作用的化学物质称为化学致癌物(chemical carcinogen)。,癌症的发生8090由环境因素引起，包括物理因素、生物因素和化学因素。其中主要是化学因素。在环境因素引起的肿瘤中，80以上由化学因素引起。,致癌物可分为三大类：遗传毒性致癌物、无机致癌物和非遗传毒性致癌物。,1、遗传毒性致癌物（1）直接致癌物：不需代谢活化直接与亲核分子共价结合形成加合物。这类化合物为亲电子剂，大多数为合成有机物。亚硝胺、苯并芘、黄曲霉素B1、丙烯酰胺。,（2）前致癌物： 多数有机致癌物本身并不致癌，需代谢活化才具有致癌活性，称为间接致癌物。间接致癌物的原型称为前致癌物。前致癌物经代谢活化形成的中间间代谢产物近致癌物（半致癌物），有一定致癌作用但必须再一次激活终致癌物（前致癌物经代谢活动形成的具有致癌作用的代谢物和不需代谢活化的致癌物）。,2.无机致癌物 放射性元素和重金属。有些可能是亲电子剂，但有些是通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变。铀、镭、氡等可能由于其放射性致癌。镍、铬、钛、锰等金属及其盐类可在一定条件下致癌。,3. 非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens) 非遗传毒性致癌物不与DNA反应，可能间接地影响DNA并改变基因组导致细胞癌变，或者通过促长作用、增强作用导致癌的发展。,（1）促癌剂：本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌。 如苯巴比妥对大鼠肝癌有促进作用；色氨酸和糖精对膀胱癌有促癌作用。（2）细胞毒物：可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展。 如氮川三乙酸使锌进入肾脏，由于锌的毒性，造成细胞死亡，结果引起增生和肾肿瘤。,（3）激素调控剂：主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。（4） 免疫抑制剂：主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。 如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清，均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。,（5） 固态物质：物理状态是关键性因素，可能涉及细胞毒性。如塑料、石棉等。 动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成。石棉在人和动物的胸膜表面可引起胸膜间皮瘤。石棉和其它矿物粉尘，如铀矿或赤铁矿粉尘，可增强吸烟致肺癌的作用。（6）过氧化物酶体增殖剂：过氧化物酶体增殖可导致细胞内氧自由基过量生成。 如降血脂药安妥明、降脂异丙酯、增塑剂邻苯二甲酸酯和有机溶剂1，1，2-三氯乙烯。,（7）助癌物：本身无致癌性，在致癌物之前或同时应用助癌物可显著增加癌症的发生。 助癌作用的机制可涉及增加致癌物的吸收、增加活化的致癌物的比例、耗尽内源性结合反应底物、抑制DNA修复、促进DNA损伤固定为突变等。,化学致癌物的其它分类,有多种分类方法，例如：根据致癌物的来源：内源性和外源性致癌物人工合成或自然产生：人工合成致癌物和自然致癌物致癌作用的靶器官：肝脏致癌物、肾脏致癌物等能否引起人类肿瘤：人类致癌物和动物致癌物,人类致癌物,为了评价化学物质对人类的致癌性，世界卫生组织下属的国际癌症研究所( Intenational Agency for Research on Cancer，IARC ) 定期组织专家对已发表的致癌实验资料和人类流行病学研究结果进行综合分析，提出综合评价，将致癌因素分为四类。,第一类,肯定的人类致癌物（或混合物和接触环境，以下同）： 有足够的流行病学证据支持接触此种化学物质与癌症发生有因果关系。,第二类，分为A、B两组,A组 对人很可能是致癌物： 有一定的流行病学证据表明接触此种化学物质可以致癌，不管动物实验资料如何。B组 对人可能是致癌物： 流行病学资料不够充分或者缺乏，但动物实验结果充分证明此种化学物质具有致癌性。,第三类,对人的致癌性尚不能确定的化学物： 缺乏人类的资料，动物致癌性资料也有限。 第四类对人类很可能不致癌的化学物 对人及动物的致癌性证据不充分，或根本没有资料可以利用。,IARC 1997年确定的74种肯定的人类致癌物中，除11种为生物和物理因素外，其他63种为化学因素。,工业化学物质 （22种）：, 有机物： 4-氨基联苯苯联苯胺N，N-双 ( 2-氯乙基 )-2萘胺双氯甲醚和氯甲甲醚 ( 工业品 )1，4-丁二醇二甲磺酸脂 ( 马利兰 )1，4-二甲磺酰丁烷,工业化学物质 （22种）：, 有机物： 1-(2-氯乙基)-3-(4-甲环乙基)-1-亚硝基脲环氧乙烷芥子气( 硫芥)乙-萘胺氯乙烯2，3，7，8-四氯二苯二恶英Tamoxifen（它莫西芬、三苯氧胺）,工业化学物质（ 22种）：,无机物 砷及其化合物铍及其化合物铬化合物 ( 六价)镍化合物镉及其化合物石棉含石棉状纤维的滑石粉毛沸石,药物（15种）：,环孢霉素环磷酰胺甲氧补骨脂素加长波紫外辐射噻替派苏消胺MOPP及其他包括烷化剂的联合化疗氮芥(M) 、长春新碱(O) 、甲基苄肼(P) 、强的松(P)苯丙氨酸氮芥,药物（15种）：,苯丁酸氮芥硝基咪唑硫嘌呤己烯雌酚雌激素替代疗法非甾族雌激素甾族雌激素复方口服避孕药顺序型口服避孕药,生物毒素（1种）：,黄曲霉毒素B1,混合物（12种）：,酒精饮料含非那西汀的止痛合剂槟榔与烟草一起咬嚼煤焦油沥青煤焦油未处理和略加处理的矿物油,混合物（12种）：,腌鱼(中国式)页岩油煤烟灰无烟的烟草制品卷烟烟气木尘,接触环境（13种）：,铝的生产金胺制造靴鞋制造和修理煤的气化焦炭生产家具和箱橱制造接触氡的地下赤铁矿开采,接触环境（13种）：,铁和钢的铸造异丙醇制造 ( 强酸工艺 )品红制造油漆工 ( 职业接触 )橡胶行业含硫酸的强无机酸酸雾 ( 职业接触 ),第二节 致癌作用的发生过程,人类或动物的正常细胞如何在化学致癌物的作用下，逐步转化成癌细胞。 在体内如何逐步发展成可见肿瘤，并转移到机体其他组织。 肿瘤的发生是一个长期的、多阶段、多基因改变累积的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。,癌细胞的生物学特点：1、持续性增殖，分化不良，体外培养无接触性抑制。永生性。2、浸润性生长：可侵入其他组织，并发生转移3、过分旺盛地合成核酸和氨基酸4、强烈的有氧酵解：在供氧充分时，仍能将葡萄糖转化为乳酸，大量的乳酸使pH下降，影响细胞酶活力，破坏内稳态的维持。5、可将上述特征遗传给子代细胞。,癌细胞大小不等。胞浆着蓝色，边缘有少许细小紫红色颗粒，含空泡。核型不规则，染色质粗点状排列。核仁明显，多少不一，有空泡，此外可见裸核细胞。右上瘤细胞有血小板附着。,第三节 化学致癌作用机理,一、化学致癌物与DNA形成加合物许多致癌物是亲电子剂，能与细胞内DNA结合形成加合物，造成DNA不可逆的损伤。 DNA加合物的形成在化学致癌过程中起关键性作用。,化学物可与DNA的碱基、戊糖或磷酸发生反应，形成稳定的等价加合物，也可迅速导致碱基脱氨或水合作用以及DNA断裂、碱基丢失、DNA双螺旋扭曲变形，引起移码突变、DNA链内交联等。,二、化学致癌物的代谢活化,许多化学致癌物并不能直接与DNA共价结合，必须在体内代谢活化后才有能力与靶分子起作用。根据是否需代谢活化，可将致癌物分为： 直接致癌物 间接致癌物,直接致癌物 (direct carcinogen) 不需代谢活化即具有亲电子活性，能与DNA 共价结合形成加合物 ( adduct ) 而诱导细胞癌变。如烷化剂和金属致癌物等，大多数是合成的有机物。,间接致癌物 ( indirect carcinogen ) 需在体内代谢活化后才具有致癌活性。活化前的间接致癌物称为前致癌物 ，经过代谢的活性产物称为终致癌物，在活化过程中的中间产物称为近似致癌物。 代谢酶 代谢酶前致癌物 近致癌物 终致癌物,代谢活化分为两相：第一相氧化作用，使致癌物活性增加，由细胞色素P450酶系、还原酶及单胺氧化酶等催化。第二相结合反应，通常转变为弱或无致癌性的极性化合物。少数为活化过程，如N-羟基-2-乙酰氨基芴的结合反应。,化学致癌物代谢的特点：1. 代谢以氧化过程为主。2. 代谢活化以肝脏为主（P450酶系肝脏最多）。 3. 代谢酶的活性存在种属、品系和个体差异，个体间可相差30-100倍。4. 其他代谢途径：例如肾脏、膀胱等含有前列腺素H合成酶，可将2-萘胺激活；可将苯并(a)芘、黄曲霉素B1生成环氧化物。皮肤、肺等含有髓过氧化物酶，可将芳香胺活化。,三、致突变性与致癌性,致突变性与致癌性的关系:一方面绝大多数化学致癌物有致突变性。另一方面在致癌物诱发的肿瘤细胞中存在相关的基因突变。,Ames试验测试175种已知致癌物，结果有157种致突变为阳性，相关率达89.7%。测试125种非致癌物，有109种为致突变阴性，相关率达87.2%。果蝇试验、染色体畸变分析等也有类似结果。,基因突变与肿瘤形成的关系： 在DNA复制、转录和翻译过程中，如果模板受到损害，蛋白质的氨基酸序列可能会发生改变，从而可能影响蛋白质的正常功能，最终使细胞生长分化失控而致癌。,在很多情况下，某个碱基的突变并不改变DNA密码，蛋白质的氨基酸序列并不改变，称无声突变 ( silent mutation )。有些突变可改变氨基酸的序列，但不影响蛋白质的功能；或者可影响蛋白质的功能，但对细胞的生长和分化不起作用，此种突变并不致癌。与细胞生长和分化有关的基因突变在致癌过程中起关键作用。,化学物,DNA损伤,有,致癌,无明显后果,DNA修复失败,可遗传的改变，即突变,有无蛋白表达及功能改变,无,对基因突变的检测可作为检测化学致癌物的一个指标。但是，并非所有的致突变剂都是致癌物；有些致癌物可能通过非遗传机制致癌，因此用致突变试验预测致癌物有一定的局限性。,四、化学致癌的非遗传机制,大多数化学致癌物可与DNA共价结合，引起基因突变或染色体结构和数目的改变，最终导致癌变。由于其作用靶部位是机体的遗传物质，故称为遗传毒性致癌物 ( genotoxic carcinogen )。,部分致癌物用常规的致突变试验不能检出致突变性，但可影响生长调节基因的表达，促进细胞分裂增殖而诱发肿瘤。由于其不直接作用于遗传物质，称为非遗传毒性致癌物(nongenotoxic carcinogen), 如免疫抑制剂、石棉、激素和促癌剂等。,遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物的区分不是绝对的，有些化学物达到一定剂量时，既具有遗传毒性(启动剂) ，同时也具有非遗传毒性 (促癌剂)。,非遗传毒性致癌物促进细胞分裂增殖而诱发肿瘤，例如许多激素是有丝分裂剂，它们与细胞内相应受体结合，通过第二信使，影响生长调节基因的表达，刺激细胞分裂增殖，如调节甲状腺、肾上腺、胰腺、乳腺、性腺等器官的各种激素。,体内某种激素水平异常升高，会使靶细胞转化成癌细胞的可能性增高。如：卵巢切除术后或绝经后雌激素替代疗法或长期使用激素类避孕药会增加生癌的危险性。碘缺乏者体内促甲状腺生成素水平持续升高，而易患甲状腺肿瘤。,细胞分裂增殖对肿瘤形成的影响： 细胞分裂时，S期细胞DNA解螺旋，富含电子的部位大量暴露，易受致癌物的攻击。 细胞快速增殖，细胞周期缩短， DNA损伤修复时间减少，突变机会增加。 基因突变后细胞必须通过增殖才能表现出其突变或转化表型。 转化细胞通过增殖才能继续演变，发展成自主性增殖的肿瘤。,五、化学致癌的阶段理论,化学致癌过程非常复杂，包括一系列生物学改变，是一个长期的、多因素、多基因参与的多阶段过程，至少有三个阶段：启动阶段 ( initiation )：有基因突变促癌阶段 ( promotion )进展阶段 (progression )：有基因突变,三阶段论的实验模型：（1）给动物启动剂二甲苯并蒽一次，可诱发少数良性皮肤肿瘤。（2）随后接触促癌剂 TPA（12-邻十四烷酰大戟二萜醇-13乙酸酯），良性肿瘤数量增多。单独使用或在给予启动剂之前使用TPA ，都不能诱发肿瘤。（3）促癌之后再次接触启动剂（进展剂）二甲苯并蒽，出现恶性肿瘤，且随着接触次数增加，恶性肿瘤数亦增多。,1. 启动阶段,化学致癌物作用于DNA造成损伤， DNA损伤经细胞分裂增殖 (一到数次) 被固定下来，导致基因突变，使细胞发生了不可逆的遗传性改变。 此刻细胞并不表现出肿瘤细胞的生物学特性。,具有引发作用的化学物称为引发剂。引发剂本身有致癌性，大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量，引发作用是不可逆的并且是累积性的。但并非所有的引发细胞都将构成肿瘤，因其中大多数将经历程序性细胞死亡(凋亡)。引发细胞不具有生长自主性，因此不是肿瘤细胞。,启动细胞并不都能存活下来。启动细胞的其他转归：（1）被机体的免疫系统清除，如被吞噬细胞消灭。（2）通过细胞凋亡而消失。（3）在组织稳态因素控制下，保持休眠状态。,2. 促癌阶段,促癌物作用于启动细胞上的特定受体而影响信息传递，可逆地增加或减弱基因表达，促进已突变的启动细胞迅速分裂增殖，形成良性肿瘤。,促癌物（promoter of carcinoma）本身不具有致癌性，单独作用不会诱发肿瘤，但当它与致癌物共同作用，或在致癌物作用之后，反复作用于细胞，可促进启动细胞分裂增殖而发展成为肿瘤。促癌物通常是非致突变物，不引起DNA结构的改变，通过非遗传机制发生作用，影响引发细胞的增殖，导致局部增殖并引起良性局灶性病理损害，如乳头瘤、结节或息肉。这些病损很多会消退，仅少数细胞发生进一步突变引成恶性肿瘤。,特点： 历时较长，早期有可逆性，晚期为不可逆的； 对生理因素调节的敏感性，衰老、饮食和激素可影响促长作用。,常见的促癌物,（1）12-邻十四烷酰大戟二萜醇-13-乙酸酯 ( 12-O-tetradecanoyl-phorbol- 13-acetate，TPA )： 巴豆油中的脂环化合物，小鼠皮肤癌（2）苯巴比妥： 肝脏肿瘤（3）雄激素和雌激素(内源性促癌物)：靶器官、肝脏肿瘤（4）胆酸：结肠的癌前病变和恶变（5）无铅汽油：大鼠肾小管癌,其他促癌物多肽激素卤代烃类煤焦油中的酚类有机氯杀虫剂多溴联苯,有些物质具有启动和促癌的双重作用，称为完全致癌物(completecarcinogen)。完全致癌物的单独作用即可诱发肿瘤。,3. 进展阶段,在促癌阶段中或之后，细胞在化学致癌物作用下出现复杂的基因改变(染色体的结构变异、大段丢失、易位或嵌入)，细胞形态和行为发生变化, 如生长加速、高度的侵犯性、转移能力、对激素的反应性改变以及生化、免疫性能改变等，从而获得了恶性肿瘤细胞的特性。,在进展阶段起作用的化学物质称为进展剂(progressor) 。进展剂可引起染色体畸变，但不一定具有引发活性。,分化程度高低,在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤抑制基因的突变； 在促长阶段主要是遗传外机制； 在进展阶段主要是核型不稳定性。正常细胞经过遗传学改变的积累才能转变为癌细胞。,综上所述，化学致癌过程是多阶段、多因素、多基因参与的长期累积过程。,第三节 药物致癌作用危险性评价,长期动物致癌试验是检测化学致癌物的经典的方法，但耗费人力、物力较大，时间较长。目前的策略： 致突变试验 初筛 短期致癌试验 必要时 长期致癌试验 最后根据结果，推测对人类致癌的危险性。,现有策略存在的问题： 致突变试验的敏感度 ( 真阳性) 和特异度 ( 真阴性) 都只有50 60左右。 长期动物喂饲试验费时费力，实验结果阳性率太高(多于50)。可能与测试所用的高剂量、最大耐受剂量有关。 由于种属差异，且实验动物数与人群数目相比毕竟很少，要将动物实验结果推导到人群也是十分困难的。,一、筛检致癌物的致突变试验,假阳性假阴性比率较高(5060) (1) 细菌回复突变试验（如Ames试验）(2) 哺乳动物细胞正向突变试验(3) 果蝇伴性隐性致死试验(4) 小鼠特异基因试验(5) 染色体畸变试验(6) 微核试验,一、筛检致癌物的致突变试验,(7) 姐妹染色单体互换 ( SCE ) 试验(8) 显性致死试验(9) 小鼠可遗传易位试验(10) 细菌DNA修复试验(11) 程序外DNA合成试验(12) 精子畸形试验,二、短期致癌试验,(一) 哺乳动物培养细胞恶性转化试验（二）动物短期致癌试验,细胞转化试验细胞转化是指受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程。 细胞转化试验的目的是了解体外培养细胞接触受试物后，细胞生长是否发生癌变，其观察内容包括生长自控能力、细胞形态、细胞生长能力、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等。,有三类细胞可应用于细胞转化试验： 原代细胞，如叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE细胞）、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等； 细胞系，常用细胞系BALBA/C-3T3，C3H10T1/2和BHK-21； 病毒感染细胞，如RLV/RE细胞（劳舍尔白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞）和SA7/SHE细胞（猿猴腺病毒感染的SHE细胞）。,(一) 哺乳动物培养细胞恶性转化试验,受试药物在加S9与不加S9的平行条件下，与哺乳动物培养细胞接触一段时间（如24时）。哺乳动物培养细胞：如叙利亚地鼠胚胎细胞、人成纤维细胞、小鼠或大鼠支气管上皮细胞等,观察:细胞的形态生长能力生化表型移植于动物体内能形成肿瘤的能力 判断正常细胞是否发生了因核型改变所致的恶性转化。,恶性转化细胞的特征：,（1）细胞形态的变化恶性转化细胞偏大且大小不等。核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚、核仁增生而肥大。核仁和胞浆均由于RNA增多而偏酸性，故呈嗜碱性染色而偏蓝。核分裂多见。,恶性转化细胞的特征：,（2）细胞生长自控能力丧失生长自控能力：表现为接触抑制接触抑制：在液体培养基中的细胞贴壁后，正常克隆为单层细胞且细胞排列有序；而转化克隆为多层细胞且排列紊乱。,恶性转化细胞的特征：,（3）生化表型的改变对植物凝集素反应异常糖酵解方式改变形成新的特异抗原（4）恶性转化后的细胞移植于动物体内有形成肿瘤的能力,（二）动物短期致癌试验,1. 小鼠肺肿瘤诱发试验2. 大鼠肝脏转变灶诱发试验3. 小鼠皮肤肿瘤诱发试验4. 雌性大鼠乳腺癌诱发试验,小鼠肺肿瘤诱发试验,动物： 推荐使用A系小鼠68周龄体重1520克雌雄各半每组至少50只,小鼠肺肿瘤诱发试验,剂量及分组： 一般设高、中、低三个剂量组。最高剂量：每周给药三次，连续 8周的最大耐受剂量。 另设阴性对照组。给药途径： 一般采用腹腔注射（药物）或灌胃（食品）的途径。观察时间： 3035周或更短些。,小鼠肺肿瘤诱发试验,大体解剖检查：试验结束时，处死动物，取出肺脏，在解剖镜下观察肺表面。肿瘤为灰白色半透明、边缘整齐的圆形突起，0.10.3mm大小，大多为肺腺瘤或乳头状腺瘤，一部分可能发展为癌。必要时做病理组织学检查。,结果判断：,符合下列情况可判为阳性：（1）实验组肺肿瘤的均数比对照组显著增加（2）有剂量效应关系（3）阴性对照组肺肿瘤的平均数与文献报道的同龄未染毒小鼠肺肿瘤发生率大体相符,大鼠肝转化灶诱发试验 对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在814周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。,小鼠皮肤肿瘤诱发试验 于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。 典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为TPA（12-邻十四烷酰大戟二萜醇-13乙酸酯）。,雌性大鼠乳腺癌诱发试验 一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。多环烃芳香胺、氯烷、亚硝基脲等能在9个月以内诱发乳腺癌。 此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。,三、动物长期致癌试验,短期筛检试验阳性的受试物，若有重要使用价值，应进行哺乳动物长期致癌试验。 大多数已知的人类致癌物都能诱发动物肿瘤， 因此，通过动物长期致癌试验可以对化学物的致癌性作出充分估计。,三、动物长期致癌试验,肿瘤的发病过程缓慢，距初次接触化学致癌物至最终形成恶性肿瘤，有530年的潜伏期。 用啮齿类动物进行12年的诱癌试验，相当于人类大半生时间，故又称哺乳动物终生致癌试验，是鉴定动物致癌物的经典方法，结果比较可靠。,三、动物长期致癌试验,1试验动物的选择（）种属： 选用两种啮齿类动物，可选大鼠、小鼠、金黄地鼠等。啮齿类动物的优点： 对致癌物敏感性高，寿命相对较短、对其生理和病理特征了解较多，“自发肿瘤率”资料较全，饲养费用较低等。,1试验动物的选择,（）品系：同一种属不同品系的动物对化学致癌物的反应也相当不同。要选择敏感、自发肿瘤率低，生活力强的品系。,（）品系：,纯系动物的优点：自然寿命和自发肿瘤率较恒定，免疫性状相同，试验容易重复，便于结果比较。杂交系动物的优点： 抗感染力较强，遗传特性比纯系动物复杂而更具有代表性。杂交一代动物，可兼具二者的优点。,、动物年龄,选用刚断奶的幼年动物，不迟于出生后79周。幼年动物肝药酶和免疫系统的发育还不完善，对受试物较敏感。使致癌性较弱，潜伏期较长的致癌物有充分发挥作用的时间。,、动物数量,每组至少雌雄各50只动物。动物数量应足够体现阳性反应，以免样本太小而不能全面反映总体情况。每组动物数在试验结束时，应能满足统计分析的需要。,、动物性别,同等数量的雌、雄两性动物，以接近人类实际情况。,、给药途径,口服：喂饲法或灌胃。 喂饲法：将化合物混合在饲料或饮水中。挥发性或化学性质不稳定的化合物不宜采用。灌胃：准确控制剂量。,、剂量选择和分组,为了观察剂量反应关系，至少设高、中、低3个剂量组。高剂量大，可以缩短出现肿瘤的潜伏期，消除动物易感性的个体差异。剂量亦不能过大，以免出现慢性毒性，使动物寿命缩短，以致大部分动物在肿瘤潜伏期之前死亡。,、剂量选择和分组,设立高剂量的原则： 最大耐受量(与对照组相比，动物体重增长抑制不超过10，无中毒死亡动物，一般状况变化不大。)一般先进行短期预试验，同时参考长期毒性试验结果确定高剂量。,、剂量选择和分组,低剂量：临床拟用剂量的倍。中间剂量：与高低剂量成等比级数关系。 另设空白对照组和溶媒或赋形剂对照组。,、剂量选择和分组,阳性对照组： 必要时可设。选用与受试物结构相近的已知致癌物作阳性对照物。意义： 检测动物的敏感性，以及试验设计、设备和操作过程的合理性，以便评价试验结果的可靠性和比较受试物致癌性的相对强度。,、试验期限,动物正常寿命的大部分时间或终生大鼠：两年以上（平均寿命22.5年）小鼠：一年半以上（平均寿命1.52年）。 当给药组与阴性对照组之间肿瘤发生率已有明显差别时，可提早结束试验。,有观点认为：为减少中途非肿瘤死亡，应在9-12月后停止给药支持：使得动物由中毒或亚中毒状态恢复，存活时间较长和存活动物较多；反对：虽对完全致癌物无较大影响，对于促癌剂可能出现可逆反应，导致肿瘤发生率下降,8、动物饲养,恒温、恒湿大、小鼠：23.31.1、405%饲料中不能含有亚硝胺、黄曲霉素和杀虫剂等可能的致癌物质自然存在于动物饲料中的各种酶的诱导剂和抑制剂可能影响动物肿瘤的发生或其他一些参数的变化,9、观察与检查,（1）一般观察： 每天观察动物12次，外表、活动、摄食状况等。定期称量体重。 全身浅表部位有无肿块，以及肿块出现的时间、部位、大小、数目、质地、发展速度及动物死亡时间等。,（1）一般观察：,疑为白血病时，作血液检查。 试验中途死亡或濒死的动物，应及时解剖检查，防止组织自溶。对全身各组织器官逐一取样，特别是有肿块或有病变的部位，留待病理组织学检查。,（2）解剖和病理组织学检察,试验结束时，处死动物。大体解剖，肉眼观察各组织器官，逐一取样留作标本，特别是已出现肿块或怀疑有病变的部位。病理组织学检查（光镜及电镜）。,尸检中需要检查和固定的器官和组织,11、统计分析,统计各种肿瘤的数量（包括良性和恶性肿瘤）及任何少见的肿瘤、患肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期 肿瘤发生率：一组动物中发生肿瘤的动物数与该组有效动物数（最早出现肿瘤时该组存活动物数）之比。内脏肿瘤不易早期发现，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间，定为发生时间。 潜伏期： 从动物接触药物开始，到出现第一个肿瘤的天数。肿瘤多发性：一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。,结果报告：应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；应报告剂量-反应关系及统计学分析结果。如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。,12、结果判断：,致癌试验阳性的判定标准为WHO提出的标准。（1）给药组肿瘤发生率显著高于对照组自发肿瘤率。（2）给药组肿瘤发生的潜伏期显著短于对照组。（3）给药组肿瘤发生的部位多于对照组。,12、结果判断：,（4）给药组肿瘤的类型与对照组不同（对照组应有历史对照资料）。 符合上述情况之一，并有统计学意义时可判为阳性，如有明显的剂量反应关系，结果更为可靠。,13、试验结果的意义,一种动物试验结果为