HLA HPA血型系统ppt课件.ppt

HLA HPA血型系统的简绍 1 HLA血型系统 人类白细胞抗原系统humanleukocyteantigen HLA 2 HLA基因介绍 位置 第 号染色体的短臂上 6p21 3 HLA是一种免疫源型很强的同种抗原 具有极为复杂的多态型 根据HLA的结构和分布特征 分为HLA I II III三个区域HLAI类classI A B C 经典HLA基因E F G MIC 非经典HLA基因HLAII类classII DR DQ DP经典HLA基因DM DN DO 非经典HLA基因TAP LMP 抗原提呈加工相关蛋白基因HLA III类基因 补体系统 有争议 21 羟化酶 热休克蛋白 肿瘤坏死因子HLA位点目前有A B C E F G DR DQ DP DO DM TAP1 TAP2 MICA MICB 3 具有临床意义的HLA基因有A B C DR DQ DP等位点 Loci 每一个体的每个位点可以是纯合子 也可以是杂合子 如为杂合子 便表达两个抗原如为纯合子 或其中一个等位基因为 空白 blank 该基因的产物尚不清楚或者尚未发现相应的特异性抗血清 无法检定 则只表达1个抗原 例如 HLA A 02xx blank B 13xx 15xx 75 Cw 05xx 07xx DRB1 04xx 03xx 17 与输血 移植急性排异反应有密切关联 4 等位基因 alleles 位于同源染色体对应位置的一对基因 复等位基因 multiplealleles 在群体中位于同一基因位点而具有不同编码特性的基因系列 是群体的基因概念 共显性表达 co dominant 每一对等位基因位点的两个基因均为显性基因 其编码分子可同时表达于细胞膜表面 HLA基因特点 5 HLA基因特点 符合孟德尔遗传法则 分离率 以单倍型为单位自由组合率 连锁与互换 6 命名组织分布和表达功能及其特异性免疫应答作用I类所有有核细胞表面识别和递呈内源性抗原肽 HLA A B C包括血小板表面与其受体CD8分子结合约束CTL效应功能 II类B细胞 APC 激结合和递呈外源性抗原肽HLA DR 活的T细胞与其受体CD4分子结合 DQ DP约束Th细胞的识别功能 异体HLA分子与排异反应有关 I II类抗原结构和分布特点 7 HLA的功能 参与T细胞受体定向分化成熟参与抗原提呈调节NK细胞活性 怀孕 保护胎儿免受母体T NK细胞攻击 8 血型抗原种类及分布 红细胞抗原系统 红细胞 血小板表面白细胞抗原系统 淋巴细胞 血小板等有核细胞表面粒细胞抗原系统 中性粒细胞血小板抗原系统 血小板 9 HLA与临床的关系 10 致敏状态 供者的HLA分子作为免疫原 启动受者的免疫防御机制 产生HLA抗体 并诱导产生针对该分子的CTL 供者的免疫活性细胞在受者体内被诱导增殖分化 产生针对受者的免疫应答 11 免疫下调 1 供者抗原 HLA DR类分子被受者T细胞受体 CD4分子识别 HLA DR类分子与供者部分相同 引起同种异体免疫下调 引起IL 10 通过作用于树突状细胞 引起免疫耐受2 供者血液中的非职业性APC细胞 诱导受者转化成TH2状态 与自身抗体生成有关 参与免疫抑制 免疫耐受3 输入的血内有可溶性HLA分子 FAS L分子等 封闭了T细胞 12 与HLA相关的输血性疾病或反应 输血反应同种异体输血术后感染输血相关急性肺损害输血相关移植物抗宿主病血小板输注无效输血后紫癜慢性良性粒细胞减少症 13 其它不能排除HLA为致病因素的疾病或反应 新生儿同种异体血小板减少症 发病机理与血小板输注无效基本类似只是免疫途径不同 怀孕代替输血 新生儿同种异体粒细胞减少症 粒细胞抗原导致粒细胞抗体产生 14 HLA在特殊输血领域的作用 外周血干细胞移植脐带血干细胞移植骨髓干细胞移植 15 HLA分型的意义 供受者间HLA相配程度越高 GVHD发生率越低 长期存活率越高目前认为供受者必须相配的基因位点 以A B DR为主 但不能忽略 C DQ DP 16 A B DR谁更重要 HLA 类不配合要比HLA 类不配合产生更严重的GVHDHLA I类不配合要比HLA II类不配合容易产生植入不种活 failureofengraft 17 不同移植对HLA配型要求 移植类型骨髓移植 外周血干细胞移植 脐带血移植实体器官移植肝移植角膜移植 HLA配型要求 低无无 除非角膜有新生血管 18 HLA的分型方法和抗体检测 血清学分型技术细胞学分型技术HLA的DNA分型技术 传统的人类白细胞抗原分型方法主要是血清学和细胞学方法 分型准确性较差 随着PCR技术的广泛应用 人类白细胞抗原基因分型方法得到了迅速的发展 序列特异性引物 序列特异性寡核苷酸探针 直接测序 基因芯片等各具特点的人类白细胞抗原分型技术不断出现 使人类白细胞抗原的分型更加准确 精细 简便 实用 为临床推广应用打下了基础 各种人类白细胞抗原基因分型方法各有优势 不能相互替代 这也是由人类自细胞抗原系统的高度多态性和复杂性所决定的 根据不同的用途可选择相应的方法 19 HLA抗体检测 抗体筛选 采用微量淋巴细胞毒试验 用新鲜 冰冻或培养的混合淋巴细胞 T淋巴细胞筛选HLA 类抗体 用B淋巴细胞筛选 类抗体 凡有阳性反应的血清便留下来进一步作抗体特异性鉴定 20 抗体鉴定 鉴定细胞为已知HLA特异性的淋巴细胞 被检血清分别与每份已知HLA特异性的淋巴细胞试验 交叉淋巴细胞毒试验 以受者血清加供者淋巴细胞 供者血清加受者淋巴细胞作微量淋巴细胞毒试验 本试验主要用于骨髓移植或肾移植配型 也用于输注血小板配型 21 血小板血型系统 22 分类 血小板相关抗原 是与其它细胞表面或组织共有的抗原 主要与红细胞的ABO血型系统以及人类白细胞抗原 HLA 有关 如ABH Lewis I P及HLA 类抗原等血小板特异性抗原 是由血小板特有的抗原决定簇组成 表现血小板独特的遗传多态性 23 血小板血型抗原 ABO系统血型抗原 血小板表面存在红细胞ABO系统的A抗原和B抗原 血小板上没有RhD抗原 现已证明ABO型不合的血小板输注 血小板寿命将缩短 因此 应选择ABO同型血小板输血 24 血小板血型抗原 HLA血型抗原 血小板膜上存在HLA A和B位点的抗原 尚未发现有HLA DR DP DQ等位点的抗原 应用氯喹或用酸溶液在0 处理血小板 能够除去血小板表面HLA抗原 这为应用输注酸处理后血小板治疗血小板输注无效性患者提供了重要依据 25 血小板血型抗原 HPA抗原 humanplateletantigen HPA 血小板特异性抗原是通过相应抗体的检出而发现的 26 血小板特异性抗原的命名原则 是以HPA为字头 然后连接数字表示 在由2个对偶抗原组成的遗传系统中 对偶基因分别用英文小写字母a和b表示 如果某血小板抗原的对偶抗原尚未被发现 将给予暂时命名 在等位基因数字后加后缀w表示 只有在2个对偶抗原全被检测出来后 才能被称为系统 27 已发现的血小板抗原一览表 系统国际命名曾用名发现年代糖蛋白CDHPA 1HPA 1aZwa PIA11959GP aCD61HPA 1bZwb PIA21961HPA 2HPA 2aKob1961GP b CD42bHPA 2bKoa Siba1965HPA 3HPA 3aBaka LeKa1980GP bCD41HPA 3bBakb1988HPA 4HPA 4aYukb Pena1985GP aCD61HPA 4bYuka Pena1986HPA 5HPA 5aBrb Zavb1998GP aCD49bHPA 5bBra Zava Hca1989HPA 6bwCaa Tua1993GP aCD61HPA 7bwMoa1993GP aCD61HPA 8bwSra1990GP aCD61HPA 9bwMaxa1995GP bCD41HPA 10bwLaa1997GP aCD61HPA 11bwGroa1994GP aCD61HPA 12bwIya1995GP b CD42cHPA 13bwSita1999GP aCD49bHPA 14bwOea2002GP aCD61HPA 15HPA 15aGovb1990CD109CD109HPA 15bGova1995HPA 16bwDuva2002GP aCD61Vaa1992GP b aMoua1998 28 血小板抗原与抗体 自身抗体 同种抗体 抗原 29 血小板抗体 同种异体抗体主要针对HLA抗原 HPA抗原自身抗体HPA抗原 30 抗血小板抗体 产生机理 机体对血小板表面或相关抗原免疫临床分类 血循环里的游离抗体结合于血小板上的抗体 PAIgG 血型学分类 血小板同种抗体 自身抗体见于 血小板输注治疗无效 同种免疫血小板减少症 自身免疫血小板减少症 药物 病毒 细菌引起的血小板减少症 31 血小板抗体发生率 血小板抗体阳性与输血次数成正比 输血次数在10次以上 抗体阳性率高于50 32 血小板输血 血小板输血近十余年来有了长足的发展 输血量显著增加 原因 临床医师对血小板输血适应症 充分认识化学疗法 免疫抑制疗法器官移植技术的发展成份制剂质量 分离法 浓缩法提高 的保证血小板单采 血液成份分离机 术的普遍应用 33 血小板输注利弊 益处 减少微小出血的发病率降低大量出血的发病率 死亡率风险 同种异体免疫反应输血感染过敏反应输血相关的移植物抗宿主病 transfusion associatedgraft versus hostdisease TA GVHD 34 血小板输血适应症 血小板减少机制产生不足破坏亢进抗体消耗脾脏储存量增大血小板功能异常先天性血小板功能异常后天性血小板功能异常 35 血小板输血适应症 白血病再障特发性血小板减少性紫癜症 ITP 弥漫性血管内溶血 DIC 癌症肿瘤病人作化疗放疗法时需要大量输血的血小板减少症脾肿大导致血小板减少症 血小板储存量增加 血小板减少症 外科手术前血小板输血血小板功能异常先天性 血小板无力症 后天性 尿毒症 阿斯匹林服用 36 禁忌症 血栓性血小板减少性紫癜 thromboticthrombocytopenicpurpura TTP 肝素诱导血小板减少症 heparin inducedthrombocytopenia HIT 37 病人因出血而输血小板 衡量输血有效性的最重要的指标是临床效果 38 预防性输注血小板 应当通过测量输血后血小板计数的增加来评估的效果 根据病人的大小和血小板输注的多少 有多个公式可以计算血小板计数的增加值 39 血小板输注无效 40 血小板输注无效的特征 是指多次输血小板均未取得满意效果 有些病人可能有一次输血小板效果不好 而以后几次效果不错 只有在2次及2次以上输血小板效果都不好 才能诊断为血小板输注无效 41 影响血小板输注的因素 非免疫因素血小板的质量发热感染弥漫性血管内凝血 DIC 循环的免疫复合物骨髓移植脾肿大与药物相关的抗体自身抗体 同种免疫因素红细胞相关抗体HLA抗体 占70 80 血小板特异性抗体 HPA抗体 42 非同种免疫因素 血小板的质量发热感染发热感染血小板输注疗效比预期减少20 40 感染期 血小板暴露隐抗原 吸附IgG抗体 败血症或感染病人 血小板表面抗体上升弥漫性血管内凝血 DIC 凝血功能异常被激活 血小板消耗大量上升 感染 败血症 恶性肿瘤 循环的免疫复合物 感染和免疫介导疾病的病人 循环的免疫复合物数量上升 血小板数量下降 可能的原因 循环的免疫复合物吸附于血小板的Fc II受体 通过网状内皮系统清除 骨髓移植 自体或异体移植可能导致血小板破坏增加 移植造血细胞恢复期 可发生类似免疫个体发生自身 非自身免疫识别的暂时紊乱 这种免疫失衡导致血小板自身抗体上升 急慢性GVHD和巨细胞病毒感染增加PAIgG 放疗 化疗药物 生长因子 免疫调节药物治疗GVHD可助长血小板消耗的血管病 脾肿大 15 20 与药物相关的抗体 某些抗菌素和抗真菌药物 青霉素 两性霉素B 万古霉素药物抗体实验阳性 提示可能药物抗体实验阴性 不能确诊自身抗体 白血病 骨髓移植 巨细胞病毒 43 免疫因素 1 HLA同种免疫反应 占免疫因素造成的80 以上 特别在有妊娠史的女性中常见 其发生率因下列情况而异 输注血液成份的类型 病人的基本情况 妊娠史 输血史 44 免疫因素 2 HPA 人类血小板抗原 同种免疫反应 3 ABO血型不合 红细胞的A和B抗原在血小板上也表达 4 血小板自身抗体 5 药物相关的血小板抗体 45 区别异体免疫输入的血小板很快破坏 输注后1小时和24小时均不见计数增高其它输注后1小时血小板计数增高 但24小时计数不增高或受影响 46 血小板输注无效的调查 如果发生血小板输注无效 应当对临床因素做评估 这些因素可能与非免疫性血小板损耗有关 如果没有发现明显的临床原因 就要怀疑可能是免疫机制起作用 并做血小板抗体 HLA HPA等抗体 分析 但在ABO不同的造血干细胞移植病人中 还要考虑ABO血型的影响因素 47 判断指标 输注后血小板回收百分率 Percentplateletrecovery PPR 血小板纠正计数增加指数 Correctedcountincrement CCI 48 血小板输注无效的处理 49 HLA抗体 选择HLA匹配的供者 要建立血小板 HLA 供者库 HLA相合分级HLA配合级别解释AA B位点四个抗原完全一致BA B位点2 3个抗原一致 余为空白位点CA B位点2 3个抗原一致 余为交叉反应性位点DA B位点1个抗原一致EA B位点4个抗原完全不一致研究表明 HLA相合C级以上 CDC试验为阴性 血小板输注效果显著提高 Schitler等报道 在一个2470人的供者库中 平均每一患者可在其中找到3个A级 9个B级 40个C级配合的供者 50 鉴别HLA特异性抗体 选择抗原匹配的单采供者 51 进行血小板交叉配型试验选择匹配的血小板 所有这些方法对于选择匹配的供者同样有效 遗憾的是 即便使用这些方法选择供者 也会有20 30 的被选择者提供的血小板 在输注后无效 这部分无效反应可能与下列因素相关 在免疫因素中可能同时存在非免疫因素 药物或自身抗体影响 由于检测系统本身原因使得有关抗体检测错误 即使是连续的血小板输注 患者自身抗体也会随着时间推移而丧失 因此 周期性的评估抗体情况可能会改善部分患者血小板输注的疗效 52 HPA抗体 选择HPA匹配的供者 要建立血小板 HPA 供者库 鉴别HPA特异性抗体 选择抗原匹配的单采供者 进行血小板交叉配型试验选择匹配的血小板 53 HLA HPA抗体 选择HLA HPA匹配的供者 要建立血小板 HLA HPA 供者库 鉴别HLA HPA特异性抗体 选择抗原匹配的单采供者 进行血小板交叉配型试验选择匹配的血小板 54 ABO血型不合 最好输注ABO血型配合的血小板 Rh血型的选择 对D阴性的患者 最好要避免用D阳性献血者的浓缩血小板 55 ABO不同的造血干细胞移植后输血选择 第I期 从病人 受者 准备接受异体造血前躯细胞移植开始第II期 从骨髓摧毁性治疗开始 直到对于输红细胞 直接抗球蛋白试验阴性且对供者的红细胞抗体消失 对于输血浆 受者红细胞消失 即红细胞ABO细胞分型与供者一致 第III期 病人的ABO红细胞分型及血浆分型与供者一致 56 57 非免疫的血小板无效输注 仅有2个因素提高血小板的反应 脾切除和给予ABO匹配的血小板 相反 降低血小板反应的因素由重到轻依次为 患者体内产生淋巴细胞毒素抗体的男性患者和有2次及以上妊娠史的女性患者 巨脾 接受肝素治疗 出血 发热 弥漫性血管内凝血 DIC 由于已知血小板数量和血小板存活率之间的关系 因此这些减少血小板增量的因素通常也降低血小板存活率 同时这些不利的因素也导致血小板无效输注 对于接受造血干细胞移植的患者 影响血小板输注效果的不利因素还包括 血管闭塞件疾病 VOD 移植物抗宿主病 GVHD 高胆红素水平 全身照射 TBI 血清中高浓度的他克莫司或环胞霉素 58 持续无效患者 无论造成无效的原因是免疫性的或非免疫性的 总是会有一部分患者在最大限度的消除了免疫和非免疫因素影响后仍然是无效输注 对这部分患者如果存在致命性大出血 以下几种方法可能会有帮助 给予小量 多次血小板输注 如每隔4 8h输3 4个血小板浓缩物 这些输注虽然不能提高输注后患者血小板数量 但是可能有助于维持血管壁的完整性 静脉注射免疫球蛋白可能会短时间内提高输血后血小板增量 纤溶酶原抑制物可能有助于稳定正在形成中的凝血块 重组的凝血因子 a或许能控制部分患者的出血 59 血小板输注无效的诊治对策 60 预防及对策 应该输注ABO相合的血小板 以防止因ABO抗体而引起的输注无效 对于一些因血小板消耗增加而致的输注无效 缩短输注时间比增加输注量更重要 对于脾肿大 则应以增加输注量为主 如果存在自身抗体 用激素 免疫抑制剂或IVIg治疗 有时可有效 61 原因不明的PTR 往往应考虑药物性抗体 停用某种药物或换药是首选 对存在HLA抗体和血小板特异性抗体的患者 应进行HLA配型或血小板交叉配型 临床试验表明 输注ABO和血小板交叉配型相合的血小板可减少PTR 通过血小板交叉配型选用相合或同型的血小板可使大多数含HLA抗体或HPA抗体者临床疗效显著 62 有研究报导给血小板输注无效患者输注解离HLA抗原的血小板 即用氯喹或枸橼酸洗脱血小板膜上的HLA抗原 但本方法在处理过程中血小板的功能会受损 另外 HLA解离血小板的临床效果尚需进一步观察 因血小板制剂中含有大量白细胞是导致免疫性血小板输注无效的主要原因 因此去除血小板制剂中的白细胞 使之降至 5 106 可有效地预防或减少输注无效的发生 63 通过血浆置换去除或降低病人血浆中的同种抗体或免疫复合物有一定效果 利用放射性同位素产生的r射线照射血小板 破坏其有免疫活性的淋巴细胞和其他抗原呈递细胞 APCs 通过控制射线剂量抑制细胞抗原性而不影响血小板功能 从而大大降低同种免疫和输血相关移植物抗宿主病 TA GVHD 若将白细胞过滤和射线结合起来 可预防绝大多数因血小板输注而引起的同种免疫 64 综上所述 1 临床医生要严格掌握好血小板输注的指征 2 在输注前 要详细了解病人的临床表现和免疫史 3 在发现问题时 最好是了解清楚是否存在免疫因素或非免疫因素 还是两者同时存在 4 在发现免疫因素时 最好首先鉴定抗体种类和其特异性 从而选择相匹配的供者提供条件 65 输血后紫癜 输血后紫癜 post transfusionpurpura PTP 是多次输血后产生的血小板同种抗体对随后输入的血小板产生免疫反应而导致的一种血小板减少症 主要表现为血小板减少及相应的出血症状 症状多出现在输血后一周 中年妇女多见 患者既往有多次输血史或妊娠史 66 病因 特异性血小板同种抗体 形成血小板抗原抗体复合物 破坏血小板症状 全身紫癜 黏膜出血 发热反应 血小板计数下降 重症患者可出现颅内出血及大出血而休克死亡 死亡率达10 67 诊断 PTP患者一般有妊娠史或输血史 血小板计数常低于10 109 L 血小板生成良好 血小板功能异常 在患者血清中可检测到抗HPA 1a抗体以及其他血小板特异性抗体 此外还可检测到HLA抗体或淋巴细胞毒抗体 68 治疗 PTP多为自限性疾病 由此而引起血小板减少的出血持续2 35天 大多在2周后开始恢复 2个月内血小板数恢复正常 但当PTP患者出血症状比较严重时 可采取以下治疗措施 血浆置换静脉注射丙种球蛋白糖皮质激素血小板输注 69 新生儿同种免疫血小板减少性紫癜 新生儿同种免疫血小板减少性紫癜 newbornalloimmunethrombocytopenicpurpura NAITP 母婴之间的HPA不合可导致母体发生免疫反应 最终破坏胎儿或新生儿的血小板 产生不同程度的临床并发症 最严重的并发症是颅内出血 可造成不可逆神经损伤甚至死亡 70 发病机制 HPA阳性的胎儿血小板通过胎盘进入HPA阴性的母体并刺激母体的免疫系统 导致母体产生抗胎儿HPA抗体 IgG型抗体通过胎盘进入血液循环并与血小板结合 经内皮吞噬系统破坏血小板致使其数量减少 产生临床并发症或后遗症 新生儿同种免疫血小板减少性紫癜大多由于血小板特异性抗原HPA 1a PLA1 引起 在白种人群中更突出 71 症状 内脏和中枢神经系统出血 脑水肿 婴儿出生时 12 24小时 有严重广泛的紫斑 有时出生2 3天后才出现血小板减少症状诊断 母体血小板抗体检测 抗原检定 患儿血小板抗体 表面 游离 治疗 输血小板 与母体中同种抗体无反应的血小板 换血治疗血浆置换预后 死亡率13 72 特发性血小板减少性紫癜 特发性血小板减少性紫癜 idiopathicthrombocytopenicpurpura ITP 是一种由于血小板自身免疫作用导致血小板抗体增多 使血小板破坏加速而引起的出血性疾病 故也称免疫性血小板减少性紫癜 immunologicthrombocytopenicpurpura ITP 73 这种抗血小板自身抗体可与血小板上的相关抗原结合 成为血小板相关免疫球蛋白 PAIgG 也可游离于血清中 多数患者中PAIgG升高的水平与血小板减少的程度有关 74 治疗 1 血小板输注 常无效 且可导致输血后紫癜等输血反应 2 皮质激素等免疫抑制剂 脾切除术 主要治疗方法 3 血浆置换 4 大剂量静脉注射免疫球蛋白 75 实验方法简介 76 抗原 基因分型技术 1 多聚酶链反应 序列特异性引物方法 PCR SSP 2 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性分析方法 PCR RFLP 3 等位基因特异性寡核甘酸点杂交方法 PCR ASO 4 聚合酶链反应 单链构象多态性方法 PCR SSCP 5 基因芯片技术 77 血小板血型抗体 分类一类主要是针对人类组织相容性抗原 HLA 类抗原的抗体 即血小板表面相关抗体 PAIgG 一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体 PBIgG 78 阳性反应 阴性反应 洗涤 静置4小时或离心 抗体 抗原 SEPSA 79 80 抗体 血小板抗体检测方法 1 简易致敏红细胞血小板血清学实验 SEPSA 2 酶联免疫吸附竞争法 3 血小板抗原单克隆抗体特异性固相化 MAIPA 4 免疫细胞化学法 SABC 5 微柱凝胶法 81 评价在上述5种方法中 SEPSA 酶联免疫吸附竞争法 微柱凝胶法检测的是血小板相关抗体 包括血小板特异性抗体和HLA抗体 而MAIPA SABC法能准确判定是否为血小板特异性抗体及其针对的HPA 82 血小板抗体检测方法 1 简易致敏红细胞血小板血清学实验 SEPSA 2 酶联免疫吸附竞争法 3 血小板抗原单克隆抗体特异性固相化 MAIPA 4 免疫细胞化学法 SABC 5 微柱凝胶法 6 酶联检测方法 MACE 7 微量淋巴细胞毒方法 CDC 83 评价 在上述几种方法中 SEPSA 酶联免疫吸附竞争法 微柱凝胶法检测 MACE的是血小板相关抗体 包括血小板特异性抗体和HLA抗体 而MAIPA SABC法能准确判定是否为血小板特异性抗体及其针对的HPA 84 血小板交叉配型 85 血小板交叉配型方法 1 检测HLA抗体 2 检测HPA抗体 3 检测HLA HPA抗体 86 补体依赖性淋巴细胞毒试验 检测受者体内是否存在针对供者的特异性HLA抗体 用于识别受者可接受的HLA基因 原理 HLA抗原为有核细胞膜抗原 在补体的作用下 受者的HLA抗体能够特异性地结合到供者相应抗原活淋巴细胞膜上 使淋巴细胞损伤或死亡 细胞膜失去屏障作用 染料进入细胞内并着色 目前我们实验室使用的生物染料是荧光液 FluoroquenchAE 染色后在倒置相差显微镜下 活细胞呈绿色 死细胞呈红色 根据死亡细胞占全部细胞的百分比 判读结果 87 补体依赖性淋巴细胞毒试验 仪器和试剂 Tersaki板 72孔 60孔板 微量移液枪 倒置相差荧光显微镜 兔补体 生物染料 88 样品 供者的T淋巴细胞病人血清 89 操作步骤 1 淋巴细胞的提取 用淋巴细胞分离液或免疫磁珠分离出供者外周血的淋巴细胞 分离出的淋巴细胞以1 PBS调节细胞数至1 2 106 ml备用 NIH CDC为微量试验 所有反应均在72孔TerasakiTray中进行 2 淋巴细胞1ul 受者血清1ul 兔补体5ul3 37 60分钟孵育4 生物染料5ul5 微镜下观察结果 90 结果分析 结果观察死细胞 大体积 着色细胞 伊红染色 黑色 荧光染色 红色 活细胞 体积小 有折光性细胞 伊红染色 无色 荧光染色 绿色 91 记分标准 92 注意事项 严格淋巴细胞的数量和活力质量标准 细胞数太少 1 106 L易假阳性 细胞数太多 5 106 L易假阴性 分离过程中 pH 温度以及离心力等均可能使细胞膜受损 使淋巴细胞活力下降 易发生假阳性 某些疾病 如白血病 可使HLA抗原一过性减弱甚至缺失 将造成错误 最适宜的孵育温度25 补体 20 可保存3个月 80 可保存1年 一经融解 用剩必须废弃 应使用有效生物染料 伊红染色时间过长将致活细胞死亡而着色 加样操作时应注意抗原抗体及补体有否混合在一起 应避免将上一孔的血清带到下一孔中而造成抗体污染 93 淋巴细胞的提取 淋巴细胞分离液提取淋巴细胞免疫磁珠分离T淋巴细胞 94 淋巴细胞分离液提取淋巴细胞 原理 淋巴细胞与血液中的其他成分存在比重差异 利用密度在1 076 0 001g ml之间而且近于等渗的淋巴细胞分离液 作密度梯度离心时 血液中的红细胞和淋巴细胞按相应密度梯度分布 根据此原理将全血标本或白膜层细胞悬浮液缓慢地加于分离液上层 经离心沉淀 红细胞 颗粒细胞 多核细胞沉于管底 淋巴细胞和单个核细胞则悬浮于血浆与分离液的