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分子克隆报告人 1 克隆载体 DNA操作酶 Contents 2 分子克隆 分子克隆 基因克隆 DNA重组技术 通过体外重组技术 将一段目的DNA经切割 连接插入适当载体 并导入受体细胞 扩增形成大量子代分子的过程 分子克隆的核心是 体外重组即人工将一段目的DNA插入一个载体的过程 3 载体DNA vector 目的DNA targetfragment 重组DNA recombinantDNA 宿主 host 筛选 扩增 克隆 clone 分子克隆的路线 DNA重组 转化 4 载体的特性 分子较小 可携带比较大的DNA片段 载体的特性 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 并且尽可能是高效的表达 要有尽可能多种限制酶的切割位点 但每一种限制酶又要最少的切割位点 从安全角度考虑 要求载体不能随便转移 仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制 有适合的标记 易于选择 5 1 2 3 4 质粒载体 噬菌体载体 酵母菌质粒载体 动植物病毒载体 克隆载体 6 质粒载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA 一般大小约为数千碱基对 可自身复制和表达 有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因 所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体 7 噬菌体载体 一种典型的头 尾结构 双链线状DNA分子 全长50kb 含66个基因 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链 是天然的粘性末端 被称为COS位点 噬菌体 一种典型的纤维状结构 其DNA分子相比 噬菌体要小的多 长度仅6407个核苷酸 通常为环状双链DNA M13噬菌体 8 噬菌体结构 它本身是一种核蛋白 核心是一段DNA 结构上有一个蛋白质外壳和尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内 9 cos位点的作用 cos位点在 噬菌体侵染周期中起着两种截然不同的作用 当前噬菌体被从宿主细胞中切除后 此时其作为一个限制性内切核酸酶的识别序列 10 噬菌体的侵染模式 11 M13噬菌体的侵染过程 M13以纤毛吸附大肠杆菌 并向其注入自身DNA单链DNA注入宿主细胞后 合成第二条链 双链复制模式RF RFDNA拷贝数达到100 200个后 通过滚环复制机制产生线状单链DNA包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出 12 PCR的基本反应步骤 变性95 C 延伸70 75 C 退火Tm 5 C 13 第一次循环 第二次循环 72 94 94 14 PCR技术最关键的两步 引物的设计引物必须相应于模板分子相邻的序列 引物序列于对应的模板连应该是互补而不是相同的 这样杂交才会发生且杂交后的引物的3 末端应该对着另一条引物的3 末端 最重要的是引物的长度 因为引物的长度影响其杂交到模板DNA上去的效率 引物越长杂交所需的时间越长 引物太短可能与目标位点以外的位点相杂交 而扩增出我们并不需要的产物 15 退火温度温度太高 不会有杂交发生引物与模板仍然相互分离 温度太低 又会有稳定的错误配对发生 退火温度有引物 模板杂交结构的解链温度 Tm 决定 Tm是指正确的碱基配对杂交结构相互分开的温度Tm 4 G C 2 A T C 16 DNA操作酶 是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶 简称限制酶或切割酶 根据限制酶作用特性 一般分为 和 型 其中常用的是 型限制酶 催化双链DNA中一条链的3 OH与另一条链的5 PO3H2形成磷酸二酯键 从而构成完整的DNA长链 逆转录酶是一个多功能性酶 至少具有以下3种酶活性 以单链RNA为模板 催化合成cDNA单链 具有RNaseH活性 能水解RNA DNA杂交链中的RNA 以DNA为模板 催化合成cDNA双链 TaqDNA聚合酶是一种依赖DNA的单亚基耐热DNA聚合酶 主要用于聚合酶链式反应中 能以DNA为模板 从结合在模板上的引物出发 以dNTP为原料 按碱基配对方式 从5 3 方向合成新的DNA链 TaqDNA聚合酶在70 75 时具有最佳的生物活性 17 DNA重组技术 分 获取目的基因和载体 接 目的基因与载体的连接 筛 重组DNA的筛选与鉴定 转 重组DNA导入宿主细胞 18 目的基因的来源 Contents Contents 聚合酶链反应 制备基因组DNA 制备cDNA 人工合成基因 目的基因来源 19 目的基因与载体的连接 粘性末端连接 平头末端连接 人工接头法 同源多聚尾连接法 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切 产生相同粘性末端 再通过DNA连接酶作用将两者连接起来 构成重组DNA分子 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端 此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连起来 合成连接子 与DNA平头末端连接 限制酶切割 产生粘性末端 连接 构建重组DNA 要求DNA分子内部必须完整 即两个DNA链间不存在缺口 否则末端脱氧核苷酸转移酶也会在3 OH上加入多聚尾巴 破坏了DNA分子活性 20 重组DNA导入宿主细胞的类型 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 类型 21 感受态细胞受体细胞经过一些特殊方法 如CaCl RuCl等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生变化 成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 22 重组DNA的筛选与鉴定 平板筛选 插入失活 蓝白筛选 限制酶切图谱筛选 PCR筛选重组体 原位杂交技术 4 1 2 3 重组DNA的筛选与鉴定方法 23 平板筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法 具有抗药性标记的载体转化宿主细胞后 能在含抗生素 Amp或Tet 的培养平板上生长 未转化的则不能生长 24 平板筛选的种类 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内 使该基因失活 转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上 插入失活 利用蓝色化合物的形成作为指示剂 筛选带重组质粒的细菌 蓝白筛选 25 26 载体宿主 编码 半乳糖苷酶N端序列