药敏试验及药敏试验结果分析

药敏试验及药敏试验结果分析,一、药敏试验,MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是1824小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。对倍稀释的优点：操作容易敏感株的MIC呈正态分布区分异常(R)与敏感(S)的菌群,药敏试验折点的建立,1. MIC的分布2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点3. 临床疗效和细菌清除率4. 抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率),MIC的分布,药代动力学和药效学,药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄药效学：药物对机体的作用时间依赖型（TMIC：内酰胺类，大环内酯类浓度依赖型（AUC/MIC比率：AGS, FQ这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案,MIC与抑菌圈直径的线性关系,耐药 中介 敏感,R,I,S,Log2. MIC,D 1 d2 抑菌圈直径（mm),v,抑菌圈直径与MIC的关系,不同国家的判定折点可能不同,原因：用药剂量不同，服药的间隔不同评价敏感时较保守更强调检测出耐药株（即特定的耐药群）技术因素：接种、培养基,敏感性分类(NCCLS的定义),敏感（Susceptible）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药（Resistance）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度,敏感性分类（2）,中介 (Intermediate)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效 (尿FQ)加大用药剂量可能有效缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误,药敏试验的方法学,半定量纸片扩散法 (抑菌圈直径)MIC法：稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法 (Etest )流式细胞仪,药敏试验方法的选择,纸片法有独特之处选药灵活、便宜、易懂MIC法：商品肉汤法 (自动化法)可用于厌氧菌、苛氧菌计算机管理快速，但可能有错误（如诱导型菌）新药的评价,药敏试验方法1（纸片扩散法,材料：浸有一定Abs的干燥的园滤纸片步骤：制备菌悬液涂平板贴纸片孵育卡尺测量抑菌圈直径判定R、I、S优点：选药灵活、便宜、一个平皿可测多个药缺点：影响因素多适用于快生长菌、部分苛养菌,纸片扩散法影响因素,MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量、扩散性平皿厚度温度，预孵育时间,纸片扩散法标准化,NCCLS：美国实验室标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测,NCCLS的法规,规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控规定常规测试报告的抗生素不同的药判定标准不同不同的菌判定标准也不同,常规测试并报告的药物分组(1),肠杆菌科绿脓和非肠杆菌科一 级 氨苄头孢他啶 唑林，庆大庆大，替卡，哌拉二级 阿米卡星阿米卡星 氨苄/舒，阿莫/克吡肟，哌酮，氨曲南 头孢肤肟，头霉环丙，亚胺培南，替卡/克 噻肟，曲松，环丙妥布，磺胺 亚胺培南，替卡，哌拉三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松 卡那，奈替，妥布氯霉素，奈替 四环素，氯霉素,常规测试并报告的药物分组(2),葡萄球菌肠球菌一级 苯唑，青霉素青霉素，氨苄二级 红霉素类万古霉素 克林，万古三级 氯霉素庆大,常规测试并报告的药物分组(3),流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级 氨苄，青霉素青霉素，红霉素 TMP/SMZ TMP/SMZ二级 头孢肤肟，噻肟氧氟，四环素 他啶，氯霉素 万古霉素三级 阿奇，头孢克罗氯霉素，利福平 环丙，亚胺培南利福平，四环素,预报用药(一),测试药菌名推测其它药物的敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有内酰胺类 四环素所有（除葡多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌红霉素G球菌罗红，克拉，阿奇克林霉素所有林可霉素,预报用药(二),测试药菌名推测其它药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄，美洛，替卡头孢噻吩肠杆菌科拉定，头孢氨苄，克罗奈啶酸s肠杆菌科所有FQs万古霉素s所有替考拉宁s,纸片扩散法操作规程(一),培养基：MH (重复性好，低抑制剂，营养好)厚度：4mmPH：7.27.4pH低时，氨基糖甙,大环内酯 pH高时，青霉素类的活性 离子浓度 (Ca 2+ , Mg 2+ )影响 氨基糖甙类、四环素对Pae活性高时，抑菌圈；,纸片扩散法操作规程(二),接种：纯的新鲜菌落，0.5号麦氏比浊管菌悬液在15分钟内种入平皿内纸片中心的间距=24mm孵育：CO2影响Ags, Tet, Macrolides质控: ATCC25922, 35218 ATCC27853, ATCC25923,纸片扩散法结果的判定,1. 先看菌名（鉴定到种2. 不同的药物使用不同的折点药名菌名RS菌株1菌株2Pip/Taz绿脓171816R30SCAZ绿脓 141816I19S3. 同是S时，偏离敏感折点越高的药, MIC越低，活性也越高,抑菌圈的分布,抑菌圈的分布,非NCCLS系统的扩散试验,方法国家学会培养基评论比较法UKBSACIso-Sensitest不校正MICsStokesUKBSACIso-Sensitest不校正MICsSFM法国SFMMH与NCCLS相近DIN德国DINMH与NCCLS相近SIR瑞典SMSPDMASMMIC相关值低Neo-sensitabs丹麦、比利时MH药片，易保存双歧澳大利亚Sensitest无中介,药敏试验的错误来源(一),每个系统特有的局限性 （快生长菌培养基（成分、厚度、pH、离子浓度）各种材料的正确保存 (纸片20)操作步骤纯菌、35、1628h葡萄球菌、肠球菌 24h,药敏试验的错误来源(二),体内、体外试验的不一致性某些菌测某些药，结果有误头孢菌素、氨基糖甙类：沙门菌、志贺菌头孢菌素：李斯特菌属头孢菌素、氨基糖、克林、TMP/SMZ：肠球菌Beta内酰胺类：MRS即使敏感，也应报告耐药,问题菌和耐药机制,有些菌无标准化的药敏试验棒杆菌、芽胞杆菌、气单胞菌、巴斯德菌某些耐药机制需要多种检测方法诱导型：VanB, Bush I型酶MRS的异质型表达ESBL药敏可能无法检出新出现的耐药，VISA,药敏试验方法2肉汤稀释法,4 816 32 64 128 256 ug/ml,混,混 清,抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml ， 孵育35，16-20h，判读,药敏试验方法2肉汤稀释法,调节离子浓度的MH肉汤宏量肉汤法（2ml, 13x100mm ）微量肉汤法 （ 0.1ml, 微量板） 自动化仪优点：准确，可靠，可用于研究缺点：劳动强度大细菌生长情况不可查,药敏试验方法3琼脂稀释法,浓度 16 32 64 128 256 ug/ml,制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每个点，孵育，判读结果,药敏试验方法3琼脂稀释法,优点：金标准 精确可靠可同时测定多株菌（40株）细菌生长情况可查缺点： 测多个药时劳动强度大制备平皿费时费力,药敏试验方法4E test 法,细菌生长区,E test 塑料条,椭圆形细菌生长抑制区,256128 8016,判读抑菌浓度（MIC ug/ml),药敏试验方法4E test 法,优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌， 分枝杆菌,评价药物体外抗菌活性的指标,MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，SMIC50/ MIC90：MIC从小到排列，位于第50 / 90百分位菌株的MIC值单纯比较MIC50，MIC90是片面的，还要同时看平均MIC及MIC范围同时结合R，I，S，（不同药物血浓度不同，安全范围不同,抗生素,细 菌,人 体,RESISTANCE,PHARMACODYNAMICS,INFECTION,IMMUNITY,SIDE EFFECTS,PHARMACOKINETICS,抗生素、细菌、人体,Slide no,40,Time above MICCorrelation of serum pharmacokinetics with MIC (susceptibility)of an organism,Time above MIC,Time,Antibiotic concentration (ug/ml),2,Drug A,Drug B,A,B,Drug A present at concentration of 2 ug/ml for 50% of dosing intervalDrug B present at concentration of 2 ug/ml for 30% of dosing interval,4,6,8,0,Relationship between Time above MIC and efficacy in animal infection models,0,20,40,60,80,100,0,20,40,60,80,100,Time above MIC (%),Penicillins,Cephalosporins,Mortality after 4 days of therapy (%),Craig. Diagn Microbiol Infect Dis 1996; 25:213217,Slide no,42,Antibiotic concentration,MIC,Time,Area under the curve over MIC,24-hr AUC/MIC is correlated with outcome of infection, the magnitude required for success and MIC at which this occurs becomes the PD breakpoint,24-hr AUC/MICCorrelation of serum pharmacokinetics with MIC (susceptibility)of an organism,Slide no,43,The relationship between time above MIC90and bacteriological cure in S. pneumoniae (red) andH. influenzae (blue) in otitis media and sinusitis,Otitis mediaSinusitis,Time Above MIC (% of dosing interval),Bacteriological cure (%),0,20,40,60,80,100,0,20,40,60,80,100,Craig, ECCMID 2000, Stockholm, Sweden,抗生素选择时需考虑的因素,药物,感染部位浓度,对细菌MIC,结果,微生物学抗菌机制抗菌谱,药代动力学吸收、分布、代谢、排泄给药方案,药效学时间/浓度依赖型杀菌剂/抑菌剂组织渗透抗菌时效,临床效果细菌清除患者依从性耐受性耐药产生,抗生素治疗失败的主要原因,抗生素药效学与药代动力学关系研究,PK/PD药代条件下的药效 PARAMETERS：PK：Cmax、AUC、T1/2 PD：MIC PK/PD：AUC/MIC Cmax/MIC TMIC,抗生素药效学与药代动力学关系研究,抗生素PK/PD分类,抗生素药效学与药代动力学关系研究,PK/PD研究的应用给药方案的制定与优化,抗菌药物合理应用的药理学考虑,药动学/药效学参数与抗菌效力（动物模型）,参数 药物高于MIC时间青、头孢、碳青烯、氨曲、大 环、克林24h AUC/MIC氨基糖苷、氟喹酮、阿奇峰值/MIC 四环、万古、链阳 氨基糖苷、氟喹酮,第一大类： 时间依赖杀菌作用 （持续后效应-无或轻、中度）-L Abx（P、Cef、氨曲、碳烯类），克林和大环（红、克）、四环在MIC4-5倍时杀菌率即处于饱合杀菌范围主要依赖于接触时间超过MIC时间是与临床疗效相关的主要参数,氨基糖苷类属于浓度依赖性抗生素体内外研究证明Cmax/MIC为10左右为最佳治疗参数对革兰阳性、阴性菌均具有PAE（0.757.5hr）。,第二大类:氨基糖苷类一日一次给药,低浓度易诱导适应性耐药高浓度不易选择耐药高剂量少次数给药可避免耐药,氨基糖苷类一日一次给药,氨基糖苷类药物每日一次给药理论依据充分临床疗效不变或更好毒副反应少更具经济学价值,氨基糖苷类一日一次给药,二、药敏试验结果分析,分类方式,不可能的结果 罕见的结果（值得注意） 罕见的矛盾的结果 有提示意义的结果，结果需要修正,肠杆菌科细菌结果,A. 如果三代和四代头孢菌素R/I，而一代，二代头孢或头孢克肟、头孢泊肟、氨基青霉素敏感。这样的结果不可能B. 脲基青霉素R/I，而氨基和/或羧基青霉素S。这样的结果不可能。C.粘质沙雷菌和斯氏普罗威登斯菌：四环素或呋喃妥因 S，这里细菌对这两类抗生素天然耐药，结果不可能。,罕见的结果（值得注意）-重作!,肠杆菌科细菌：亚胺培南/美洛培南 R（沙雷菌中可能）阴沟肠杆菌、产气肠杆菌和弗枸：头孢西丁 S奇异变形菌：呋喃妥因和四环素S普通变形杆菌：头孢噻吩，氨基青霉素，头孢呋辛 S沙雷菌：头孢呋辛 S对所有受试抗生素均R，不可能的结果,罕见的矛盾的结果,如果奈替米星 R/I 而妥布霉素 S （通常二者同步耐药）如果丁氨卡那 R/I，而妥布霉素/奈替米星 S（对丁氨卡那耐药的肠杆菌科细菌对其它氨基糖苷类抗生素耐药）-内酰胺类抗生素/酶抑制剂R，而该种-内酰胺类抗生素 S，不可能的结果。,有提示意义的结果，结果需要修正,A. 非ESBL的大肠埃希菌，所有氨基青霉素R，阿莫西林/克拉维酸 I/S，氨苄西林/舒巴坦 I/S，所有三代头孢 S，羧基青霉素 R/I，脲基青霉素 R/I，说明该菌耐药性可能是由于获得性-内酰胺酶引起。结果应修正为所有青霉素 R，所有一代头孢 R。,B.大肠埃希菌，志贺菌或小肠结肠炎耶尔森菌：任何一代头孢 R/I，所有羧基青霉素 S，或所有脲基青霉素 S，且所有三代头孢 S，说明耐药性可能是由低水平头孢菌素酶引起。结果修正为所有一代头孢为R，所有氨基青霉素 R/I，阿莫西林/克拉维酸 R/I，氨苄西林/舒巴坦 R/I。,C.大肠埃希菌：所有氨基青霉素 R，阿莫西林/克拉维酸或氨苄西林/舒巴坦 R，所有一代头孢菌素 R，所有二代头孢菌素 R/所有头霉素 R，所有三代头孢菌素 R/I，说明耐药性由内在高水平头孢菌素和/或ESBL引起，使青霉素、青霉素/酶抑制剂，头孢菌素和单环类的活性降低。结果修正为所有三代头孢 R，所有青霉素 R，氨曲南 R，所有二代头孢 R，所有青霉素/酶抑制剂 R/I，所有口服三代头孢 R，头孢哌酮 R，所有头霉素 R。,D. 大肠埃希菌：所有氨基青霉素 R，阿莫西林/克拉维酸 R/氨苄西林/舒巴坦 R，所有一代头孢菌素 R，所有羧基青霉素/所有脲基青霉素 R/I，所有三代头孢菌素S，说明耐药性由内在低水平头孢菌素和/或高水平获得性-内酰胺酶引起，使青霉素、青霉素/酶抑制剂，二代头孢菌素的活性降低。结果修正为所有青霉素 R，所有青霉素/酶抑制剂 R/I。,E. 奇异变形杆菌、沙门菌：所有氨基青霉素 R，所有三代头孢菌素 S。修正结果为：所有青霉素 R，所有一代头孢菌素 R/I。F. ESBL型大肠埃希菌，结果修正为所有青霉素 R，所有头孢菌素，除头霉素外 R，氨曲南 R。,G. 普通变形杆菌：所有氨基青霉素 R，所有一代头孢菌素 R，所有羧基青霉素 R/I或所有脲基青霉素R/I，所有三代头孢 S。说明可能由内在头孢菌素酶和获得性-内酰胺酶引起，使青霉素、青霉素/酶抑制剂、一代二代头孢菌素的活性下降。结果修正为所有青霉素 R，所有二代头孢 R/I，所有青霉素/酶抑制剂 R/I。,H. 普通变形杆菌：所有氨基青霉素 R，任何一代头孢 R，所有羧基青霉素或脲基青霉素 S，所有三代头孢菌素 S。说明耐药性由内在的头孢菌素酶引起，使一代、二代头孢菌素抗菌活性下降。结果修正为：所有一代头孢 R，所有二代头孢 R/I。I肠杆菌科细菌：对环丙沙星耐药的细菌对所有三代喹诺酮类抗生素耐药。,J. 志贺菌：所有氨基青霉素 R，所有三代头孢 S，任何羧基青霉素或任何脲基青霉素 R/I，说明耐药性可能由获得性-内酰胺酶引起，使青霉素和一代头孢菌素的抗菌活性下降。结果修正为所有青霉素 R，所有一代头孢菌素 R/I。,K奇异变形菌、沙门菌：所有氨基青霉素 R，所有一代头孢和所有脲基青霉素 R/I，所有头霉素 S，任何三代头孢菌素 R/I或头孢泊肟 R，或氨曲南 R/I，说明耐药性可能由ESBL引起，使青霉素、青霉素/酶抑制剂、头孢菌素和单环类抗生素的抗菌活性下降。结果修正为：所有青霉素 R，所有头孢菌素（除头霉素外） R，氨曲南 R。,非发酵菌铜绿假单胞菌/不动杆菌,不可能的结果,A. 如果三代和四代头孢菌素S/I，而一代，二代头孢或头孢克肟、头孢泊肟、氨基青霉素敏感。这样的结果不可能B. 所有氨基青霉素，或阿莫西林/克拉维酸，或氨苄西林/舒巴坦，或任何一种一代或任何一种二代头孢，或任何头霉素，或任何四环素，或任何一代喹诺酮类，或复方新诺明 S。这样的结果很罕见，铜绿假单胞菌对上述抗生素呈多重耐药性,C. 鲍曼不动杆菌或无硝不动杆菌：所有氨基青霉素或一代二代头孢或氯霉 S，这个结果不可靠，这两个菌对以上抗生素天然耐药。D. 洋葱伯克霍尔德菌：氨基糖苷类抗生素或亚胺培南 S，这个结果不太可能，该菌对以上抗生素天然耐药。,罕见的结果（值得注意）,A. 铜绿假单胞菌：如果亚胺培南 R，而头孢他啶 S，替卡西林 S，说明耐药性最大可能为细菌细胞壁通透性下降所致，不指示与其它-内酰胺类抗生素的交叉耐药。B. 不动杆菌属（洛菲不动杆菌和琼氏不动杆菌），气单胞菌属（嗜水、豚鼠、维罗纳气单胞菌温和生物变种），支气管炎博德特菌，浅黄金色单胞菌，多杀巴斯德菌，多食鞘氨醇杆菌，洋葱伯克霍尔德菌，施氏假单胞菌：对复方新诺明 R。这种结果不太可能，这些细菌对该药通常是敏感的。,罕见的矛盾的结果,A. 丁氨卡那 R/I，庆大霉素或奈替米星 S。结果矛盾 B. 妥布霉素 R/I，庆大霉素 S。结果矛盾 C. 假单胞菌：派拉西林 R/I，任何氨基青霉素 S或替卡西林 S，该结果不可能，因为对脲基青霉素耐药的细菌通常交叉耐受氨基和羧基青霉素。,有提示意义的结果，结果需要修正,A. 非发酵菌：如果对环丙沙星 R，则说明对其它喹诺酮类抗生素耐药，结果修正为：所有喹诺酮类抗生素 R。B. 铜绿假单胞菌：头孢他啶 R/I，替卡西林/克拉维酸 R或所有脲基青霉素 R，说明细菌对所有三代头孢、青霉素、青霉素/酶抑制剂及单环类交叉耐药。报告修正为：所有三代头孢 R/I，所有青霉素 R/I，所有青霉素/酶抑制剂 R/I，所有单环类 R/I。,C. 铜绿假单胞菌：替卡西林 R，替卡西林/克拉维酸 R或派拉西林 R或阿洛西林 R，头孢他啶 S，氨曲南 S。说明耐药性是由获得性-内酰胺酶引起。结果修正为所有青霉素 R。,葡萄球菌,不可能的结果,葡萄球菌：青霉素G S或-内酰胺酶阴性，苯唑西林 S，这个结果较罕见，对青霉素敏感的葡萄球菌不常见到。葡萄球菌：所有抗生素 R，不太可能。葡萄球菌：呋喃妥因 R，葡萄球菌对呋喃妥因通常敏感。,罕见的结果（值得注意）,金黄色葡萄球菌：万古霉素 R/I，对万古霉素耐药的金