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干细胞分子生物学 干细胞 干细胞 StemCells 是一类具有无限制自我更新能力 同时也可分化成特定组织的细胞 干细胞在细胞发育过程中处于较原始阶段 按照其分化的潜能 可分为 1 全能性干细胞 TotipotentStemCells 2 多能性干细胞 PluripotentStemCells 3 单能干细胞 UnipotentStemCells 干细胞分类 按照分化潜能的大小 干细胞基本上可分为以下三种类型 1 全能性干细胞 TotipotentStemCells 它具有形成完整个体的分化潜能 受精卵细胞前几次分裂所产生的细胞也是全能干细胞 2 多能性干细胞 PluripotentStemCells 这种干细胞具有分化出多种组织细胞的潜能 但却失去了发育成完整个体的能力 3 单能干细胞 UnipotentStemCells 这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化 如上皮组织基底层的干细胞 肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞 干细胞分类 按照发生学来源 干细胞可以分为胚胎干细胞和成体干细胞 1 胚胎干细胞 EmbryonicStemCells ESC 是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团 InnerCellMass 的细胞 它具有体外培养无限增殖 自我更新和多向分化的特性 无论在体外还是体内环境 ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型 2 成体干细胞 AdultStemCells ASC 是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞 这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞 成体干细胞负责组织的更新和创伤修复 能反复分化充满组织 这对维持机体组织器官的稳定性有着重要的意义 胚胎发育的过程 中心的囊胚腔内一侧的细胞群 称内细胞群 这些未分化的细胞可进一步分裂 分化 发育成个体 内细胞群在形成内 中 外三个胚层时开始分化 胚胎干细胞的来源 1998年分离得到人的胚胎干细胞Dr Thomson从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞 Science 1998 Vol282 1145 1147 1998年Dr Gearheart从终止妊娠的胎儿生殖组织中分离出多能性干细胞 PNAS 1998 Vol95 13726 13731 首次分离人的胚胎干细胞 胚胎干细胞的生物学特性 1 全能性2 无限增殖性3 胚胎干细胞具有种系传递的功能4 胚胎干细胞易于进行基因改造操作5 胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常 体外培养时 细胞排列紧密 呈集落状生长 细胞克隆和周围存在明显界限 形成的克隆细胞彼此界限不清 细胞表面有折光较强的脂状小滴 细胞克隆形态多样 多数呈岛状或巢状 体外培养的胚胎干细胞的形态 人的ES细胞分化潜能 人的ES细胞可以分化为人体的200多种细胞 胚胎干细胞的用途 研究胚胎发育的调控机制2 药物的筛选 应用人多潜能干细胞可以减少动物的实验和临床的研究3 将干细胞定向分化 制造组织和器官 ES细胞经定向分化诱导 可以产生所需要的组织 器官 如果用生物材料 可以降解 做成某器官的外形支架 将ES细胞种植在支架上 有可能最终形成所器官和组织 用于患者器官的移植和损伤的修复 或者疾病的细胞治疗 4 动物的克隆和构建基因敲除 转基因动物模型 胚胎干细胞应用的制约 伦理问题 ES细胞建系过程中需要破坏受精卵或囊胚 在许多国家和民族的宗教信仰中 受精卵或囊胚即是生命 免疫排斥问题 从ES细胞中获得的功能细胞对患者来说属于异体细胞 体细胞核移植 SCNT 是得到多能性干细胞的另一种途径 体细胞核移植 Dolly 1996 7 5 世界上第一只克隆羊Dolly2003 2 14 由于英国爱丁堡大学的伊恩博士研制成功 由于肺结核而被安乐死 它的标本于2003年4月9日陈列于苏格兰首都爱丁堡国家博物馆 体细胞去分化成为胚胎干细胞 早在20世纪中期 Gurdon就发现了爪蟾卵中可能存在多能性诱导因子 PIF 1997年克隆羊的诞生揭示了哺乳动物卵中也存在多能性诱导因子 PIF 之后 细胞融合等实验暗示ES中就含有多能性诱导因子 具体是哪些基因或蛋白维持干细胞的多能性 体细胞诱导产生多能干细胞 这个问题的核心内容就是寻找多潜能性的诱导因子 Pluripotencyinducingfactor PIF 早在20世纪中期 Gurdon就发现了爪蟾卵中可能存在PIF 1997年克隆羊的诞生揭示了哺乳动物卵中也存在PIF 2006年首次提出iPS细胞的概念 iPS细胞 iPScells inducedpluripotentstemcells 诱导性多能干细胞四个基因 Oct4 Sox2 Klf4和c Myc 的组合转入分化的体细胞中 使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型 iPScells研究领域的开创者 学习研究经历1993年3月 大阪市立大学医学研究科博士毕业1993年4月 美国加州大学旧金山分校博士后奖励2009年拉斯克基础医学奖2008年邵逸夫生命科学与医学奖2011年沃尔夫医学奖未来诺贝尔奖得主热门人选 日本京都大学再生医科学研究所教授美国科学院外籍院士 2011 3 山中伸弥 ShinyaYamanaka iPS研究的源起 假说存在一些维持干细胞分化潜能 诱导体细胞去分化成为多能干细胞的因子 蛋白 体细胞移植实验证明存在诱导体细胞去分化成为多能干细胞的诱导因子 如何在体细胞表达候选基因 构建候选基因表达的反转录病毒载体将待表达的候选基因的cDNA序列插入到反转录病毒载体 转入宿主的细胞后 反转录病毒载体随机整合到宿主细胞基因组内 筛选诱导产生的干细胞 1 观察外型 细胞数太多 不够准确 2 利用干细胞和体细胞的差异区分基因表达 只在干细胞中特异表达的基因 选择性杀死不表达干细胞标记基因的细胞 保留表达干细胞标志基因的细胞让其增殖 富集 Fbx15 geo geoKnockin小鼠 诱导性干细胞的药物筛选系统 Fbx15基因是小鼠胚胎干细胞特异表达的基因 geo是一个融合基因 半乳糖苷酶与新霉素抗性基因 新霉素抗性基因编码新霉素磷酸转移酶 能催化G418磷酸化 使其失去活性 G418是一种氨基糖苷类抗生素 通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成 一定浓度的G418能够杀死不表达新霉素抗性基因真核和原核细胞 半乳糖苷酶的催化X gal产生蓝色产物 用于监测基因的表达 在小鼠胚胎干细胞中 通过同源重组在fbxl5基因下游插入一个 geo融合基因 半乳糖苷酶与新霉素抗性基因 将这种基因重组过的胚胎干细胞显微注射到小鼠子宫 该研究所采用的成纤维细胞就来源于带有这种筛选基因的纯合子小鼠 同源重组构建knockout knockin小鼠 Fbx15 geo geoKnockin小鼠 筛选多能干细胞的诱导因子 第一轮筛选24个候选基因分别一个个转入小鼠的成纤维细胞 没有获得具有抗G418的细胞 第二轮筛选24个候选基因一起转导 分离得到了抗G418的细胞 某些细胞克隆表现与胚胎干细胞类似的形态和增殖特征 进一步分析证实了它们丧失了成纤维细胞特异的基因表达 而获得了胚胎干细胞标志物基因表达 包括Oct 3 4 Nanog Cripto Dax1和FGF4 通过挨个抽离24个基因中的单个基因 他们最后鉴定出克隆成必需的10个因子 第三轮筛选又从这10个因子中逐个抽出单个因子 最终将必需因子的范围缩小至4个 Oct 3 4 KLF4 SOX2和c Myc 缩小候选基因的范围 是否需要4个基因 去掉Oct3 4或Klf 没有多能干细胞克隆去掉Sox2 粗糙的细胞表面去掉C Myc 细胞形态异常 基因表达检测 mRNA检测 蛋白质检测 RT PCR WesternBlot DNA甲基化与组蛋白乙酰化对基因表达的影响 DNA甲基化 组蛋白H3K9 组蛋白 第 位赖氨酸残基 甲基化抑制基因转录 基因启动子中的组蛋白被乙酰化程度越高 基因的表达活性越高 相反乙酰化程度越低 表达活性越低 5 CG 3 序列 组蛋白乙酰化 iPS细胞的形态特征 表达24个候选基因产生与ES细胞的形态类似的细胞 iPS细胞的增殖 基因表达 基因的甲基化模式 细胞增殖特性 ES细胞特异表达基因的表达分析 ES细胞特异表达基因启动子区域的甲基化分析 iPS细胞中ES细胞标志基因的表达 ES细胞标志基因的表达方法 RT PCR iPS MEF3是指由三个诱导基因产生的iPS细胞iPS MEF4是指由四个诱导基因产生的iPS细胞 iPS细胞的表观遗传学特征 表观遗传学特征 胚胎干细胞标志基因启动子区域组蛋白H3K9的甲基化 胚胎干细胞标志基因启动子区域组蛋白H3的乙酰化 iPS细胞的表观遗传学特征 表观遗传学特征 胚胎干细胞标记基因启动子的甲基化 iPS细胞中的胚胎干表面标志物检测 胚胎干表面标志物检测 碱性磷酸酶 AlkalinePhosphatase AP 与SSEA I StageSpecificEmbryonicantigen1 被认为是小鼠胚胎干细胞的标记 iPS细胞的基因表达谱 裸鼠皮下注射iPS细胞诱导畸胎瘤 iPS细胞的悬浮培养和贴壁分化 拟胚体形成 贴壁分化 Smoothmuscleactin平滑肌细胞特异表达的蛋白 中胚层标志物 fetoprotein 内胚层标志物 IIItubulin神经细胞特异表达的蛋白 外胚层标志物 成体小鼠成纤维细胞诱导产生iPS细胞 成体小鼠成纤维细胞来自于Fbx15bgeo bgeo小鼠 同时表达GFP蛋白 GFP 绿色荧光蛋白 胚胎干细胞标志基因的表达 iPS细胞核型分析 结论 Fbxl5基因作为筛选标志得到的多能干细胞 iPScell 在形态 增殖能力 成瘤性等方面与ES细胞相似 但是在基因表达 DNA甲基化模式等方与ES细胞不完全相同 并且不能产生成年嵌合体 这种不完全程序化可能是因为Fbxl5选择表达所致 用更好的选择标记可能产生更佳的ES细胞样iPS细胞 诱导体细胞多能性的候选基因 1 其它研究人员已经发现Oct3 4 Sox2 Nanog等基因对维持胚胎干细胞和早期胚胎的多能性具有重要作用 Nicholsetal 1998 Niwaetal 2000 2 Stat3 E Ras c myc Klf4 b catenin等对胚胎干细胞表型的维持和胚胎干细胞的快速增殖起重要作用 Matsudaetal 1999 3 作者发现了多个在ES细胞中特异表达的基因 Maruyamaetal 2005 Mitsuietal 2003 作者选择了上述24个基因做为诱导体细胞多能性的候选基因 只需要4个基因可以将体细胞去分化成为干细胞 Sox2 SelfRenewalOct4 DifferentiationswitchKlf4 p53pathway Oncogenec MycGlobalHistoneAcetylation Oncogene iPS细胞是否是多能干细胞 从多个方面与胚胎干细胞进行比较1 iPS细胞克隆形态2 生长特性3 表面标志物4 基因表达模式5 表观遗传学特征6 拟胚体 Embryoidbodies EBs 形成7 畸胎瘤 Teratoma 形成8 嵌合体 Chimeras 形成 启示 复杂现象的背后可能存在简洁的控制因素选择一些可能性大的候选因素和巧妙的筛选系统 找到控制因素 候选因素和筛选系统的建立是关键 多角度验证这些控制因素得到的现象是否是所需要的 11个月后 得到的更好的iPS细胞 使用小鼠模型使用不同的药物筛选基因 Oct4 Nanog 同样的4个基因作为诱导因子获得了更加与胚胎干细胞类似的iPS细胞 Oct4 IRES GFPneoallele Oct4基因作为筛选基因 胚胎干细胞特异表达基因的表达分析 iPS细胞的基因表达模式 iPS细胞的甲基化模式 4个月后 实验方法 加入了小鼠的反转录病毒受体提高了转染效率使用一位36岁女性的面部皮肤细胞4个转录因子共同转入皮肤细胞 与人类胚胎干细胞类似的iPS细胞 与ES细胞类似的基因表达模式 胚胎干细胞标志基因的表达 DNA甲基化模式 iPS细胞分化成不同类型的细胞 bIII tubulin amarkerofectoderm acidicprotein GFAP ectoderm a smoothmuscleactin a SMA mesoderm desmin mesoderm a fetoprotein AFP endoderm vimentin mesodermandparietal 裸鼠皮下注射iPS细胞诱导畸胎瘤 干细胞之争 2009年1月 美国食品和药品管理局 FDA 批准了全球首宗人类胚胎干细胞治疗临床试验 这项批准将创造 人类医学史上的新篇章 iPS细胞诱导效率低 不到0 1 安全性问题 具有致瘤性 iPS细胞诱导过程中使用的转录因子c Myc和Klf4都是癌基因 病毒插入也可以导致肿瘤发生 而且 未分化iPS细胞自身尚可在体内形成畸胎瘤未来还有很多问题需要通过基础研究解决 iPS细胞的应用局限 干细胞科研领域的人物介绍 山中伸弥 ShinyaYamanaka iPS领域的开创者 RudolfJaenisch 现就职于美国麻省理工学院 MIT 的whitehead研究所 他是该研究所的创始人之一 RudolfJaenisch在一系列领域都做出了有影响的工作 包括基因敲除小鼠 表观遗传学研究 核移植 iPS等 JamesAThomson1995年和1998年 JamesAThomson分别在世界上首次建立猴和人的胚胎干细胞系 1995 PNAS 1998 Science 而正是由于人胚胎干细胞系的建立才产生了再生医学的概念 使干细胞研究这么热门 在建立人胚胎干细胞系之后 JamesAThomson在人胚胎干细胞培养体系的优化 iPS 维持多能性及分化的分子机制等领域做出了开创性的工作 RichardYoung麻省理工学院whitehead研究所在利用组学工具研究干细胞做出重要贡献 早在2005年 他的实验室在Cell上首次报道人胚胎干细胞中三个维持多能性的重要基因Oct4 Sox2和Nanog在全基因组上的结合情况 揭示这三个基因协同作用维持胚胎干细胞多能性的分子机制 并提出核心转录因子调控网络的概念 突破了研究单个基因在干细胞中作用的限制 开创了从整体水平了解干细胞复杂调控机制的新时代 KennethR Chien心血管疾病在各种致死因素中排在第一位 因此关于它的发病机制及治疗手段的研究一直是热点 KennethChien是该领域最出色的科学家之一 也是许多该领域最好的综述的作者 他的贡献包括发现isl1 细胞是心肌细胞的前体细胞 阐明心肌细胞发育的分子调控机制等 目前是哈佛大学心血管研究中心的主任 丁胜美国加州Scripps研究所干细胞研究中很重要的一个方向是开发可以调控干细胞特性的小分子 而丁胜博士是该领域做的最好的科学家之一 他实验室的工作有筛选维持胚胎干细胞多能性的小分子 利用小分子提高重编程的效率 首次建立大鼠iPS细胞系 宋洪军 Songhongjun 约翰霍普金斯大学宋洪军实验室的研究方向主要为哺乳动物成体神经干细胞及神经发生的分子机制 包括神经干细胞分化成神