《尼克酰胺NA在细胞》PPT课件.ppt

尼克酰胺 NA 在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用RoleofNicotianamineintheIntracellularDeliveryofMetalsandPlantReproductiveDevelopment MichikoTakahashi YasukoTerada IzumiNakaiLaboratoryofPlantBiotechnology UniversityofTokyo JapanDepartmentofAppliedChemistry ScienceUniversityofTokyo JapanThePlantCell Vol 15 1263 1280 June2004 1Introduction2Methods3Results4Discussion 1Introduction 1尼克酰胺 Nicotianamine NA 是一种金属螯合剂 普遍存在于高等植物中 NA可螯合金属阳离子 研究认为NA在植物体内Fe和其他金属的运输过程中起作用 NA也可能与Fe 作用保护细胞免受氧化胁迫的伤害 但是 在高等植物中NA准确的作用仍不清楚 2尼克酰胺氨基转移酶 Nicotianamineaminotransferase NAAT 催化NA的氨基转变 在禾本科植物中 NAAT是获得Fe所必需的 NAAT为禾本科植物所特有 3麦根酸类植物高铁载体 Mugineicacidfamilyphytosiderophores MAs 由禾本科植物根系分泌 它是一类低分子量的非蛋白氨基酸 可溶解土壤中的Fe 是天然的Fe螯合肽 NAAT是MAs合成过程中的关键酶 Fig1 催化NA的氨基化 是MAs生成过程中的一个基本媒介 MAs只有在禾本科植物中产生 注 在缺铁胁迫下 禾本科植物根系分泌出MAs 活化土壤中难溶的三价铁化合物 然后在专一的转运蛋白的作用下将Fe3 MAs转运进胞质中 从而被植物利用 4MAs的生物合成途径 为了研究非禾本科植物中NAAT产生异常的原因 把包含花椰菜病毒的35S启动子与hvnaat A基因编码区结合的载体转入烟草 产生NA但是不产生植物铁载体 表达NAAT基因的转基因烟草植物 naat烟草 的幼叶有网纹状失绿症 花的形状异常且不育 naat烟草可产生大量的NAAT 从而使得NA短缺 本文描述转基因烟草表达大麦NAAT基因和在植物中NA消耗的表型 并试探就NA在细胞内金属运输和植物生殖发育过程的作用 2Methods 1二元载体构建 缺铁大麦根部中分离hvnaat AcDNA 在pUC118菌株SmaI位点克隆 pUC118 hvnaat A用XbaI和SacI进行融合 克隆在pIG121Hm菌株中 2植物材料和生长条件 1 通过三亲株交配 二元载体pIG121Hm hvnaat A被引入到根瘤农杆菌株C 58 烟草中进行转化和再生 离体烟草腋芽T0嫁接到nas烟草上 收获naat烟草T1的种子 在nas烟草上继续嫁接获得T2 2 Naat烟草 T2 nas烟草 野生型烟草和对照烟草生长在装有蛭石的盆里 条件为25C day night 自然光照 每天用稀释1000倍的Hyponex营养液浇灌植物 培养后作为实验材料 注 Nas烟草也是转基因植物 是使用具有花椰菜病毒35S启动子 hvnas1基因插入pBIGRZ1菌株转化而成 并被证明超表达NAS nicotianaminesynthase 基因 3DNA凝胶电泳分析 DNA的提取 分离 电泳 扩增 杂交 拍照4RNA凝胶电泳分析 RNA的提取 变性 电泳 扩增 杂交 拍照5尼克酰胺氨基转氨酶 NAAT 的分析 用HPLC分析6叶片的显微结构和超微结构观察 环氧树脂切片法7金属浓度的测定 发射光谱仪测定8金属在叶片中的分布 同步加速器诱导辐射X 射线荧光光谱仪 XRF 观察 9NA的提取和分析 用HPLC进行定量分析10失绿叶叶绿素的测定 用SPAD 502叶绿素仪测定11花型异常的逆转实验 离体腋芽用五个溶液处理 1 0 MNA 20 M柠檬酸Fe III 2 20 MNA 20 MFeCl3 3 20 MNA 20 MFeSO4 4 20 MNA 20 M柠檬酸Fe III 5 100 MNA 20 M柠檬酸Fe III 12Naat烟草在nas烟草上的嫁接 以nas烟草为砧木 去除叶子 把naat烟草嫁接于上 Figure9A 进行两次嫁接试验以获得足量的种子 最后 再嫁接离体烟草 T2naat烟草 进行分析 3Results 1大麦naat A基因在烟草中的整合及其表达 2转基因烟草 naat烟草 的表型具失绿症 幼叶失绿症是植物金属缺乏的普遍症状 因此 作者通过电感耦合等离子发射光谱仪测定了naat烟草和对照叶片中的四种金属 Cu Fe Zn和Mn 的浓度和分布 3叶片中金属的浓度和分布 naat烟草叶片中金属水平的降低表明植物内部金属的运输已经改变 因为NA是NAAT的酶作用物 可以想象NAAT的大量产生消耗了这个部位的NA 内源NA的短缺导致naat烟草内部金属的运输产生缺陷 为此 作者测量了naat烟草和对照烟草叶片的内源NA 4naat烟草中NA的浓度 5NA Fe处理失绿症被逆转为了验证naat烟草的失绿症是由于NA的短缺所造成的 供给naat烟草Fe或Fe NA 离体的naat烟草用以下五种溶液处理 1 FeCl3 2 FeSO4 3 柠檬酸铁 4 FeCl3 NA 5 FeSO4 NA Fig6naat烟草失绿症的逆转实验 D SPADvaluesandconcentrationsofmetalsinyoungnaattobaccoleavestreatedwiththefivesolutions Fig6naat烟草失绿症的逆转实验 上述结果显示虽然NA和柠檬酸盐可促进Fe向幼叶运输 但只有NA促进Fe向失绿区运输 用柠檬酸铁处理的幼叶的SPAD值比用FeSO4 FeCl3的高 这个结果也表明 在螯合剂 NA和柠檬酸盐 缺乏的情况下 Fe的运输很小 再者 用含有NA的铁盐溶液处理的幼叶Cu Zn Mn的浓度也很高 这也表明NA也促进这些金属的运输 因为只有NA Fe溶液逆转了naat烟草的失绿症 使用59Fe去探究NA是否促进叶内Fe的运输 用NA 59Fe或者不加NA的59Fe处理离体的naat烟草腋芽 处理6h后 叶片中的59Fe通过放射能照像可显示出来 Fig6E E Uptakeanddistributionof59FeinnaattobaccoleavestreatedwithoutNA NA 59Fe orwithNA NA 59Fe for6h analysisperformedinduplicate Fig6naat烟草失绿症的逆转实验 6不正常的花型和不育1 野生型与对照烟草表型 五个花瓣 花色粉红 花粉在开花以前释放 圆锥花序或聚伞形花序顶生 孢蒴卵形 2 Naat烟草表型 有两种类型的异型花 Type I的花与Thetype II的花 1 Type I的花 开花早 花蕾形状异常 烟草的第一个花蕾最不正常 并且type I的花比野生型的花有更大更厚的萼片 A放射花瓣 花瓣丝状 B花器官异常 花瓣状萼片 雄蕊 花瓣与花丝融合C花冠开裂D花器官数量不正常 雄蕊 花瓣和心皮数量不正常 多或少 E混合花 两个花共有萼片 或几个特征的混合 6不正常的花型和不育Figure7 InflorescencesofWild TypeTobaccoandType InaatTobacco 2 type II的花 发育明显不同于type I花 开花晚 type II的花与野生型的花有一些相似的特征 有正常花型 萼片 雄蕊 花瓣颜色相近 并且花粉囊产生少量的花粉 Figure8 InflorescencesofWild TypeTobaccoandType IInaatTobacco 在naat烟草中 两种类型的花产生的花粉数量少 花粉在花开放几天后释放 花粉粒没有充满花粉囊 花粉粒形状像箭头 花丝是粉色而不是白色 与野生型烟草相比 在naat烟草花的花粉囊的横向部分显示有少量的花粉 这些花粉没有发育 另外 畸形的雌蕊或长或短 且经常观察到柱头形状不规则 所有的naat烟草植物的叶表现为失绿症且不育 作者通过野生型烟草和naat烟草杂交来探究生殖器官不育的可能原因 野生型花粉被涂到naat烟草的柱头上 或者naat烟草的花粉被涂到野生型花粉的柱头 Table1 杂交结果 野生型烟草雌蕊 naat烟草花粉 孢蒴中的种子量少 但都成熟了 相反 野生型烟草花粉 naat烟草雌蕊 产生11个孢蒴 只有一个有少量种子 这些种子小而轻且为棕色 这表明naat烟草的雌蕊和雄蕊都有完成受精的能力 但是 在naat烟草中花粉的数量不能有效的完成生殖 而且naat烟草的雌蕊由于缺少NA使得金属供应短缺 故不能产生成熟的种子 因此 naat烟草的不育出现了三个结果 1 花粉产量少 2 花粉囊开裂晚 3 受精之后卵不成熟 7生殖器官形态异常通过NA处理被逆转为了探究内源NA短缺是否导致花序的形态异常 与Fig6A的描述的方法相同 除了改变NA的浓度 供给naat烟草NA 离体naat烟草用五个溶液处理 Table2 100 MNA和20 M柠檬酸铁可逆转这种形态异常 A20 M柠檬酸铁B100 MNA 20 M柠檬酸铁 8通过嫁接育性被恢复 Fig10 为了检测内源NA短缺是否会导致不育 把naat烟草嫁接到野生型烟草上或者转基因植物nas烟草上 超表达大麦烟碱酰胺合酶基因HvNASl naat烟草嫁接到野生型烟草上后尽管幼叶的失绿症被恢复 但育性不能被恢复 花粉囊部分正常 但种子不成熟 文中没有显示数据 嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性 且叶片没有失绿症 Figure10 RecoveryfromSterilitybyGrafting Figure10 RecoveryfromSterilitybyGrafting Figure10 RecoveryfromSterilitybyGrafting 由上图可知嫁接在nas烟草上的naat烟草恢复了育性 且叶片没有失绿症 另外 大多数花粉囊正常 粉红色的雄蕊花丝逆转为白色 花粉粒完全发育 种子成熟 然而 多数种子发育不完全 且种皮皱缩 成熟种子的数量下降 从嫁接植物获得的成熟种子发芽正常 但是幼苗的叶片有失绿症 花序形态不正常且不育 数据没有显示 说明育性与NA有极大的关系 9嫁接在nas烟草上的naat烟草各器官的金属浓度 Fig11 这些结果表明 把naat烟草嫁接在nas烟草上后可提供naat烟草NA 因此naat烟草花的Fe Cu Zn都有明显的升高 10NtNAS表达 Fig12 RNA凝胶电泳分析探究了在烟草花中的NAS表达 Figure12 本文分析了开花第一天成熟花蕾的四种花器官 花瓣 花丝 雌蕊 花粉囊 NtNAS在所有花器官中都得到了表达 这比表明花序中产生的NA是正常花发育所要求的 尤其 NtNAS在雄蕊花丝中的高度表达表明在运输金属给花粉囊的过程中NA具有重要作用 4Discussionandpossibleconclusion 1naat烟草的表型与NA有关表达大麦naat A基因的naat烟草幼叶具有明显的NAAT活性 这导致NA在这一部位被严重消耗 因此 内源NA在naat烟草中没有被检测到 而在对照中含量显著 这表明naat烟草的表型主要是内源NA缺乏的结果 2NA是Fe在叶脉间以及叶脉到交错区运输所必需的 1 在naat烟草幼叶的四种金属 尤其是Fe和Cu的浓度比对照烟草叶的低 再者 在对照烟草叶中 Fe主要分布在叶脉和幼叶的失绿区 相反 在naat烟草中 在叶脉只有少量的Fe 在失绿区Fe的数量极少 这个结果表明 naat烟草幼叶缺铁 故可得出结论 naat烟草幼叶失绿症是由于运输到叶片的Fe不足所致 尤其在失绿区 2 单一用Fe处理naat烟草 失绿症不能逆转 柠檬酸铁处理增加了幼叶的Fe含量 但是也不能逆转失绿症 表明柠檬酸盐可运输Fe到幼叶但是不能到达失绿区 Fe NA的处理增加了Fe的浓度并且逆转失绿症 添加外源的59Fe和NA时 59Fe立即被运输到naat烟草幼叶的叶脉和失绿区 这些结果表明NA加强了Fe向幼叶叶脉和失绿区的运输 3 添加NA的溶液处理幼叶也增加了Cu和Zn的浓度 表明NA也促进这些金属向幼叶运输 在naat烟草中的四种金属浓度 在幼叶和花中 下降的顺序都相似 依次为Mn Zn Fe Cu 在naat烟草中金属浓度的下降可归于内源NA的亏缺 3NA是生殖生长和受精必需的100 MNA 柠檬酸铁的处理 可克服花形态异常 花粉成熟缺陷和花粉囊晚开裂 如果在某一部位NAAT没有消耗NA 浓度小于100 M的NA可能会逆转花的形态异常 因此 低浓度的NA影响花的形态 由此可得出一些重要的结论 正常花发育比正常的叶发育要求更高的NA浓度 在生殖时期柠檬酸盐不能代替NA 也不能作为Fe养份从幼叶叶脉转运到失绿区 NA和Fe都是花正常发育所必需的 并且同时添加NA和柠檬酸铁对正常的花发育是有效的 Cu和Zn也参与正常的花发育 嫁接在野生型烟草上的naat烟草可以逆转失绿症和花型异常 但是不能逆转不育 嫁接在nas烟草上的naat烟草可逆转幼叶的失绿症 花型异常 花粉成熟缺陷 花粉囊晚裂和不育 因为野生型烟草产生的NA比nas烟草的少 数据没有显示 可能是野生型烟草产生的NA的量不能有效补偿NAAT消耗的内源NA 从而没有足够的NA运送到种子 嫁接在nas烟草上的naat烟草花的Fe Cu Zn的浓度都增加了 且nas烟草花中的Fe Cu Zn比野生型的高 但nas烟草中Cu的浓度不高 表明NA可能参与Cu的动态平衡 嫁接试验的结果表明 种子成熟比叶和花的正常发育需要的NA多 而且NA影响花中的金属浓度 这些结论表明NA是正常花序形成 正常花粉产生和种子成熟所必需的 4生殖时期金属的重要性Fe Cu Zn 和Mn在植物生殖阶段是很重要的 因为在这个时期 这些金属是许多关键蛋白的组分 在naat烟草中雌蕊长度异常可能是由于Fe缺乏导致酶合成紊乱所致 5NA充当金属载体naat烟草中的嫁接实验和金属浓度显示NA促进Fe Cu Zn向花器官和种子运输 花器官中NtNAS的表达也表明NA促进金属向花序运输 尤其NtNAS在雄蕊花丝的表达说明花粉囊花粉的成熟需要NA来运输金属 在幼叶和花中 柠檬酸盐不能代替NA 这些结果表明 NA通过存