理工大常用临床病原学检测2017

常用临床病原学检测,毛小琴 云南省第一人民医院检验科,0,病原微生物鉴定,微生物培养,标本接种,样品接收,药物敏感试验,工作流程,微生物室工作流程简介,1,一、标本采集和运送,2,（一）微生物标本采集的一般原则：1.早期采集： 采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，而且必须在使用抗生素或其他抗菌药物之前采集。2.无菌采集： 采集的标本应无外源性污染。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、关节液等无菌标本时，应注意对局部及周围皮肤的消毒，严格进行无菌操作；对于与外界相通的腔道，如窦道标本应由窦道底部取活组织检查，而不应从窦道口取标本，以免受皮肤表面正常菌群的污染，造成混淆和误诊；对于从正常菌群寄生部位（如口腔）采集的标本，应明确检查的目的菌，在进行分离培养时，采用特殊选择性培养基。采集的标本均应盛于无菌容器内，盛标本的容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂或酸类处理。,3,3.方法得当： 即根据检测的目的菌采用适宜的方法。如，厌氧菌、需氧或兼性厌氧菌，以及L型菌采用的方法不同。如尿液标本，疑为厌氧菌感染时，应以无菌注射器从耻骨上缘行膀胱穿刺术抽取；若怀疑是需氧或兼性厌氧菌的感染。则可通过自然导尿获取标本。4.标本适量： 采集量不应过少或过多，而且要有代表性，同时有些标本还要注意在不同时间采集不同部位标本。如肠热症患者，发病的第1周应采集血液，第2周应采集粪便和尿液。否则影响细菌检出率。5.安全采集： 采集标本时不仅要防止皮肤和黏膜正常菌群对标本的污染。同时也要注意安全，防止传播和自身感染。,4,（二）微生物标本运送的一般原则：1.及时送检！ -标本采集后应立即送至微生物学实验室。 -标本采集后在室温下超过2h未送达实验室者可视为不合格标本。2.标识无误！ -送检标本必须与检验申请单有相同的唯一标识，而且送检标本应注明标本来源和检验目的。3.正确运送！ 如：棉拭子宜用运送培养基；可能混有正常菌群的标本不能用肉汤培养基运送；血培养瓶室温运送；尿液标本不能及时送检时，可4冷藏，但若用于淋病奈瑟菌培养时则需室温保存和运送；胸腹水等无菌体液可用无菌小瓶送检，也可直接注入血培养瓶中送检，等等。当标本不能及时送检时，应使用运送培养基。4.安全运送！-标本在运送过程中保证无渗漏、无污染等。,5,（一）直接显微镜检测法 （即形态学检查）-涂片染色法：常用的有革兰染色、抗酸染色，主要用于直接观察细菌形态、染色性状或观察宿主细胞内包涵体的特征等。-悬滴法或压片法：需借助暗视野显微镜或相关显微镜，主要用于观察病原体的生长、运动方式、螺旋体的形态或动动。2.病原体特异性抗原检测 -用已知抗体，借且免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等技术检测标本中未知的病原体抗原。,二、微生物检查方法,形态学检查,革兰氏染色,6,（三）病原体的分离培养和鉴定,7,细菌鉴定,8,细菌鉴定,9,10,1.形态学检查,一、观察细菌的培养特征来判断，观察内容包括：细菌培养物的颜色、气味、溶血性、菌落形态、细菌动力及在液体、半固体、固体培养基中的生长状态；二、显微镜检查：借助各种显微镜可对细菌形态、基本结构、排列方式、数量、活体状态、运动特征等进行直观检查，对样本中细菌的含量和种类做出大致判断。,2.生物化学检查法,生物化学法又叫生化反应试验，它是利用各种不同细菌在进化中形成的独特的酶系统，在其生长环境中加入相应作用底物和指示剂，经培养一定时间后，细菌的代谢产物呈现肉眼可见或仪器可分析的变化，根据这些变化可对细菌的种类进行鉴别。糖代谢试验；蛋白质代谢试验；碳源和氮源利用试验；氧化酶、接触酶等单项检测试验。,11,对于工作经验很丰富的检验人员，双歧法也不失为一种简便而有效的细菌鉴定方法，这个方法所选用的测试特异性很好。,（1）双歧法：工作量大、工作效率低、准确性差、人为因素。,12,（2）数值法：将细菌的形态和理化特征用数字表示，按照数学理论的方法将反应谱进行数字处理最后得出结果。数值鉴定的流程,13,14,结果判读,查询编码册或软件,15,16,免疫学检查又叫血清学检查，它是利用抗体-抗原反应在细菌感染的种类、性质、部位及病人的感染程度进行特异性诊断，包括：沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体相混合，在一定条件下，形成肉眼可见的沉淀物 。应用于如链球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌的鉴定 凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体可发生特异性结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集小块。用于沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌及链球菌等的鉴定。荚膜肿胀试验：常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和炭疽芽胞梭菌等检测。制动试验：主要用于霍乱弧菌的快速鉴定。,3.免疫学检查法,17,18,4.分子生物学检查法,应用分子生物学方法进行细菌检测，如部分的核酸杂交技术、聚合酶链反应技术（PCR）及质粒指纹图谱技术，还有逐渐成熟的蛋白质芯片技术及DNA芯片技术。-全自动细菌鉴定飞行质谱仪（简单介绍）,二、细菌耐药性检查,常用检测细菌耐药性的方法为：KB法（即纸片扩散法）：根据纸片中所含药物的抑菌环大小来判断。抑菌环越大越敏感。优点：选药灵活、便宜、一个平皿可测多个药缺点：影响因素多MIC法：检测能够抑制被测菌生长的最低药物浓度，MIC值越小越敏感。优点：操作容易（一次可操作检测多种药物）；敏感株的MIC呈正态分布；已实现自动化等,19,药敏试验折点的建立,1. MIC的分布2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点3. 临床疗效和细菌清除率4. 抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点,药代动力学和药效学,药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄药效学：药物对机体的作用 时间依赖型（TMIC：内酰胺类，大环内酯类浓度依赖型（AUC/MIC比率：AGS, FQ这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案,22,选药原则,主要根据细菌种类和抗生素作用机制选药。选择试验的药物应具有确切的临床疗效，试验药物的体外试验结果可以接受，并且试验药物具有代表性。,预报用药,测试药菌名 推测其它药物的敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素所有（除葡多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌红霉素G球菌 罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素所有林可霉素,测试药 菌名 推测其它药物的敏感性氨苄西林 肠球菌青霉素青霉素G 葡萄球菌 氨苄，美洛，替卡头孢噻吩 肠杆菌科 拉定，氨苄，克罗万古霉素s 所有 替考拉宁s奈啶酸 肠杆菌科 所有FQs,预报用药,报告结果方式,敏感（S）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药（R）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度,中介 (I)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效 (尿FQ)加大用药剂量可能有效非敏感（NS）：由于没有耐药菌株或耐药菌发生罕见，此分类特指仅有敏感解释标准的分离菌株。,报告结果方式,ESBL筛选和确证,目前国家规定需监测ESBLs的菌株是：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变性杆菌。,ESBL解读：,（一）ESBLs 阳性（+）：若实验室采用CLSI M100-S19及之前的标准，则需要将所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南修订为耐药。当使用当前的解释标准时（采用CLSI M100-S26标准），在报告结果前不再需要常规测试ESBL（即，不再需要将青霉素类、头孢菌素类或氨曲南结果从敏感修正为耐药）。（即检测为敏感即为敏感，耐药即为耐药）。然而，为了流行病学调查或感染控制目的仍可测试ESBL。,ESBL解读：,氨苄西林测试结果可用于预报阿莫西林结果。在许多国家供货有限药物（如，拉氧头孢、头孢尼西、头孢孟多和头孢哌酮）的解释标准没有被评估，假如考虑使用这些药物治疗大肠埃希菌、克雷伯菌或变形杆菌引起的感染，应执行ESBL试验：如果分离菌株ESBL试验阳性，应报告以上药物为耐药。对四环素敏感的菌株也被认为多西环素和米诺环素敏感。然而，对四环素中介或耐药的某些菌株可以对多西环素或米诺环素或二者敏感。,LOREM IPSUM DOLOR,ESBL筛选阴性，但1-3代头孢菌素类（R），-内酰氨酶抑制剂组成的复方制剂（R）：提示该菌株可能为高产AmpC酶，此时对所有青霉素类、1-3代头孢菌素类、氨曲南及头霉素均耐药。可以选用碳青霉烯类（如亚胺培南、美洛培南）或四代头孢（头孢吡肟）。易产生诱导型AmpC酶的菌株主要有：肠杆菌属、沙雷菌属、枸橼酸杆菌属。而高产AmpC酶的产生与抗生素诱导有关，三代头孢、克拉维酸、亚胺培南均为强诱导剂。,MRSA筛选,解读：头孢西丁是被用于检测mecA介导苯唑西林耐药的替代品；根据头孢西丁结果来报告苯唑西林敏感或耐药。筛选阳性表示该菌存在mecA介导的苯唑西林耐药，属于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。MRSA对当前所有使用的b-内酰胺类药物均耐药（除具有抗MRSA活性的新的头孢菌素外，如：头孢洛林）。值得注意的是：由于罕见非mecA介导的苯唑西林耐药机制，即mecA阴性但苯唑西林MIC是耐药（ mecA 4 g/ml）的菌株，应报告苯唑西林耐药。,筛选高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌,判断联合用药方案：敏感：与作用于细胞壁合成，而且也是敏感的药物（如氨苄西林、青霉素和万古霉素）联合时出现协同作用。耐药：与作用于细胞壁合成的药物联合时无协同作用。,临床需了解的一些事：,从脑脊液中分离的流感嗜血杆菌，常规只测试和报告：氨苄西林、一种三代头孢菌素（多为头孢曲松或头孢噻肟）、氯霉素和美罗培南头孢噻肟或头孢曲松治疗脑膜炎需用最大剂量为了在常见感染的脓肿和/或血供差的组织中达到最佳药物浓度，治疗厌氧菌感染推荐用最大抗菌药物剂量。当使用最大剂量，并进行适当的辅助治疗，如外科引流和清创术等，对厌氧菌感染的治疗极其重要。由于大部分革兰阳性微生物是b-内酰胺酶阴性，因此，推荐青霉素和氨苄西林作为首选；但对于革兰阴性微生物则否，由于大多产b-内酰胺酶。,（一） 天然耐药！,例如：肺炎克雷伯菌对氨苄西林天然耐药奇异变形杆菌对四环素类（包括替加环素）、呋喃妥因天然耐药铜绿假单胞菌对复方磺胺天然耐药阴沟肠杆菌对头孢呋辛天然耐药产单李斯特菌对氨曲南天然耐药曲霉菌对氟康唑天然耐药等等,肠杆菌科细菌的固有耐药性,葡萄球菌属细菌固有耐药性,肠球菌属细菌的固有耐药性,（二）药敏试验有局限性,药敏报告不是代表致病菌；药敏标准的局限性；现在的药敏判断标准和疗效判定的指标不一致,未找到真正的感染菌,有菌部位标本如痰、咽试子、前列腺液、粪便、尿液、阴试子等，标本的采集很难不污染携带菌；无菌部位的标本如血液和脑脊液，如培养出表皮葡萄或类白喉棒状杆菌也有识别的必要。现代感染的特点是，低免疫人群大大增多，条件致病菌、非致病菌引起的感染增多，这些特点给致病菌的判断带来了困难。可想而知，按不是感染菌的药敏结果去治疗感染菌，怎么能获得一致的结果。,药敏标准的局限性,CLSI制定的药敏判断标准是以不同药物进入体内后血液中最高浓度与该药物体外最低抑菌浓度（MIC）间的关系所制定，如（一般情况）MIC最高血液浓度4-8倍为 S 用常规剂量有效MIC最高血浓度为 R 无效,存在的问题,药物在个各局部组织分布浓度与血液不同，甚至高几倍或几十倍，局部用抗生素的药敏试验标准是什么?局部用药依据体外抗生素试验结果与临床疗效的相关性?,如头孢派铜在用药1-3h后胆汁中的浓度是血液浓度的100倍；环丙沙星在尿液的浓度可达200mg，是血液的50倍；左氧氟沙星在肾组织的浓度是血液的2-5倍 4。因此如果在上述高药物浓度部位感染时，按CLSI制定的标准判断敏感性就不能获得体外药敏和体内疗效一致的结果。,药敏判断标准的新观点,要用药代动力学药效学（PharmacokeneticsPharmacodynamics，PK-PD）及蒙特卡洛分析法（Mont