顾振纶—金蝉花孢子粉及野生金蝉花粗多糖—抗肿瘤作用初步报告

金蝉花孢子粉及野生金蝉花粗多糖抗肿瘤作用初步报告,Applied report of Cordyceps cicadae and polysaccharide of wild cordycepssobolifera on Anti-tumors,2011年3月18日 香港,一、前 言,Introduction,蝉花Cordyceps cicadae属虫生性药用真菌，生于蝉蛹体上，是蝉在羽化前，接近地面约34cm处，被蝉拟青霉等麦角菌科( Claviceptaceae)真菌寄生的产物。,其药用始载于南北朝刘宋时代的雷公炮炙论。唐慎微所著经史证类备急本草言 “蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊，惊痫，夜啼，心悸”。本草纲目中亦记载：“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。,医家认为蝉花是:一种与冬虫夏草相近的珍贵药材。,1. 蝉花的分类,大蝉草 大蝉草又名金蝉花，其子座一般单生、2个或多个，不分枝，棒状，褐色；寄生的蝉若虫较大。小蝉花 麦角菌科虫草属真菌小蝉草寄生于蝉科慈姑（Platylenre Kaempferi Fabr）幼虫的体内所抽出的子座及寄生幼虫尸体的干燥复合体。,蝉生虫草 其子座聚生至近丛生，从成虫寄主的整个腹部长出，子囊壳斜埋在子座内。蝉拟青霉 蝉拟青霉又名雌蝉花，属半知菌类或有丝分裂孢子真菌，其孢梗束自虫体头部丛聚成束长出，浅黄色，长 1.56.0cm，前端膨大，呈纺锤形。,2. 蝉花的药理作用, 免疫调节作用 调节脂类代谢 滋补强壮，提升机体的营养状况 抗疲劳，抗应激 解热镇痛催眠作用 降血糖作用 抗肿瘤作用,日本学者Ukai等从蝉花中分离出一种水溶性多糖即半乳甘露糖，它由D-甘露糖和 D-半乳糖构成，二者比例4：3。当剂量为20mg/kg时，对小鼠S180肉瘤的抑制率为47。 蝉花粗提物能选择性杀伤 G2/M期细胞，显著抑制肺癌细胞株 PAA细胞生长。,一定浓度的蝉拟青霉多糖能使人外周血单个核细胞的增殖率升高，较高浓度多糖能抑制白血病细胞株U937、 K562的增殖，同时蝉拟青霉多糖能提高外周血单个核细胞表达 nTNF-、nIFN-。,Materials and Methods,二、材料与方法,1. 药品 人工培养金蝉花孢子粉（孢子粉），批号：101201 野生金蝉花粗多糖（粗多糖），批号：110128 均由上海泛亚生命科学研究院提供 人工培养金蝉花孢子粉醇提物由苏州中药研究所植化室制备。 人工培养金蝉花孢子粉醇提物、野生金蝉花粗多糖 均用DMSO溶解后配成100mg/ml（DMSO含量5），4保存。,2. 实验用肿瘤细胞（由中国科学院上海细胞库供应）,3. 主要试剂： DMEM（高糖）、MEM及1640培养基，批号：1361834，Hyclone 产品。 胎牛血清（FBS），Hyclone 产品。 四氮唑蓝 (MTT)、胰酶、二甲基亚砜（DMSO）、RNA酶（Rnase）、 碘化丙锭(Propidium Iodide，PI)，均为Sigma产品。 戊二醛、锇酸等制作电镜样本所需试剂，由苏州大学电镜室提供。 Annexin V/PI 双染试剂盒：Biouniquer Technology Co. LTD Wright-giemsa染色试剂盒：苏州金莱生物科技有限公司。,4. 主要仪器设备 CO2 培养箱，Napco 5410 型，Napco 公司，美国。 医用净化工作台，YJ-1450 B 型，吴江市设备净化总厂。 倒置显微镜，CKX41，OLYMPUS 公司，日本。 酶联免疫检测仪，DG5032 型，南京华东电子集团医疗装备有限公司。 流式细胞仪，EPICS XL 型，Beckman-Coulter 公司，美国。 荧光显微镜，IX71 型，OLYMPUS 公司，日本。 高速低温离心机，5417R 型，Effendorf 公司，德国。 透射电子显微镜，H-600 型，Hitachi 公司，日本。 扫描电子显微镜，S-4700型，日立公司，日本。,三、实 验 结 果,Results,（一）四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测结果,Fig. 1-1A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae were detected by MTT assay （n=6）,表1-1A 金蝉花孢子粉对9株肿瘤细胞生长抑制率的影响 （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-1B 金蝉花孢子粉对11株肿瘤细胞生长抑制率的影响（n=6）,表1-2A 野生金蝉花粗多糖对9株肿瘤细胞生长抑制率的影响 （n=6）,Tab. 1-2A. The inhibited rates of Cordyceps cicadae polysaccharide were detected by MTT assay. （n=6）,*P0.05, *P0.01 vs control group,*P0.05, *P0.01 vs control group,表1-2B 野生金蝉花粗多糖对11株肿瘤细胞生长抑制率的影响（n=6）,（二） 瑞氏吉姆萨（Wright-giemsa）染色结果,Fig. 2-1 Effect of on SW1990 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,图2-1 金蝉花对人胰腺癌SW1990细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖组；G：5-氟尿嘧啶）,I,A control,B 50g/ml,C 100g/ml,D 250g/ml,I 100g/ml,F 1mg/ml,G 5-Fu(5),H 50g/ml,J 250g/ml,K 500g/ml,L 1mg/ml,E 500g/ml,孢子粉,粗多糖,图2-2 金蝉花对人宫颈癌Hela细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：蝉花粗多糖组；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-2 Effect of on Hela (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,图2-3 金蝉花对人回盲肠癌ccl-244细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖组；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-3 Effect of on ccl-244 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,粗多糖,孢子粉,图2-4 金蝉花对人横纹肌肉瘤RD细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖组；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-4 Effect of on RD (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,图2-5 金蝉花对人胶质瘤LN229细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖组；G：环磷酰胺）,Fig. 2-5 Effect of on LN229 (Light microscope 200) A: control group; H-L: Cordyceps cicadae for 48h respectively; G-K: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:100 M Cy.,粗多糖,孢子粉,图2-6 金蝉花对人胃癌HGC-27细胞形态学的影响（A：正常组；B-F：孢子粉；H-L：粗多糖组；G：5-氟尿嘧啶）,Fig. 2-6 Effect of on HGC-27 (Light microscope 200) A: control group; B-F: Cordyceps cicadae for 48h respectively; H-L: Cordyceps cicadae polysaccharide respectively; G:5 M 5-Fu.,孢子粉,粗多糖,上述结果表明：人工培养金蝉花孢子粉和野生金蝉花粗多糖对体外培养的人胃癌HGC27、人白血病K562和PBL985/GPD、人横纹肌肉瘤RD、人宫颈癌Siha、Hela、人胰腺癌SW1990、人胶质瘤LN229及人回盲肠癌ccl-244细胞等肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用。,（三） 流式细胞仪（PI单染）检测结果,G1期： DNA合成前期,S期：DNA合成期,G2期：DNA合成后期,M期：有丝分裂期，DNA的复制,Cell Cycle,图3-1 金 蝉花对人胰腺癌SW1990细胞周期的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,图3-2 金蝉花对人白血病K562细胞周期的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶 ）,Fig.3-2 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of K562 treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide;D: 5 M 5-Fu.,图3-3 金蝉花对人宫颈癌Hela细胞周期的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.3-3 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,表3-1 金蝉花对人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宫颈癌Hela细胞周期的影响,Tab.3-1 Flow Cytometric analysis of DNA histogram of SW1990、K562 and Hela treated with Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide.,流式细胞仪（PI单染）检测结果表明： 金蝉花孢子粉醇提物和野生蝉花粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人白血病K562细胞周期阻滞在G2期； 金蝉花孢子粉醇提物可使人宫颈癌Hela细胞周期阻滞在G1期。,肿瘤细胞死亡有哪几种形式？,肿瘤细胞死亡的主要形式： 坏死（necrosis） 凋亡（apoptosis） 坏死性凋亡（necroptosis ） 自噬（autophagy）,（四） 流式细胞仪（Annexin V/PI双染）检测结果,金蝉花能否诱导肿瘤细胞凋亡？,图4-1 金 蝉花对人胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,3.85%,43.77%,12.11%,5.31%,A,B,C,D,左上象：死亡细胞,左下象：活细胞,右上象：晚期凋亡细胞,右下象：早期凋亡细胞,图4-2 金蝉花对人白血病K562细胞凋亡的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,Fig.4-2 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in K562 after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,Fig.4-3 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h. A: control group; B: 1mg/ml Cordyceps cicadae; C: 1mg/ml Cordyceps cicadae polysaccharide; D: 5 M 5-Fu.,图4-3 金蝉花对人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响（A：正常组；B： 1mg/ml 孢子粉; C: 1mg/ml 粗多糖; D: 5 M 5-氟尿嘧啶）,表4-1 金蝉花对人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宫颈癌Hela细胞凋亡的影响,Tab.4-1 Flow cytometric analyses of Annexin V-FITC binding and PI uptake in SW1990、K562 and Hela after Cordyceps cicadae and Cordyceps cicadae polysaccharide treatment for 48 h.,流式细胞仪（Annexin V/PI双染）初步观察结果: 金蝉花孢子粉作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宫颈癌Hela细胞48小时后，凋亡率分别为43.17%、52.59%和 86.75% ； 蝉花粗多糖作用人胰腺癌SW1990、人白血病K562及人宫颈癌Hela细胞48小时后，凋亡率分别为12.11%、33.35%、 57.5% 。,（五） 电镜观察结果,核大，核型不规则，有切迹，核质比值大，核仁明显，细胞器丰富。（18000）,给药前人胰腺癌细胞,胞核内核膜旁异染色质边集，细胞膜溶解消失，线粒体肿胀，内质网扩张 ，呈坏死性凋亡。（12000）,孢子粉（1mg/ml）,图 5-1. 透射电镜观察金蝉花对人胰腺癌SW1990及人宫颈癌Hela细胞超微结构的影响,胞核变小，核浆比值减小，核仁减小，异染色质增多，沿核膜边集，呈早期凋亡形态 （22500） 。,核膜旁异染色质边集，胞浆内空泡变性，可见自噬小体（18000） 。,人胰腺癌细胞粗多糖组（1mg/ml）,人胰腺癌细胞粗多糖组（1mg/ml）,核型不整，核膜有切迹，核浆比值大，双核仁，细胞表面有微绒毛（9000）。,给药前人宫颈癌Hela细胞（1mg/ml）,核小，核异染色质边集在核膜旁，未见核仁 （22500）。,人宫颈癌Hela细胞孢子粉组（1mg/ml）,人宫颈癌Hela细胞孢子粉组（1mg/ml）,核膜旁异染色质边集，可见自噬小体，脂质空泡（30000）。.,核膜旁异染色质边集，胞质内线粒体肿胀，内质网扩张，细胞膜破损，呈坏死性凋亡（ 9000 ）,人宫颈癌Hela细胞粗多糖组（1mg/ml）,透射电镜观察结果表明： 1. 金蝉花孢子粉和粗多糖可诱导人胰腺癌SW1990、人宫颈癌Hela细胞和人胰腺癌SW1990细胞凋亡。 2. 金蝉花孢子粉和粗多糖可诱导人胰腺癌SW1990及人宫颈癌Hela细胞坏死性凋亡。 3. 金蝉花孢子粉和粗多糖可诱导人胰腺癌SW1990及人宫颈癌Hela细胞自噬。,金蝉花孢子粉和粗多糖对肿瘤细胞形态和 肿瘤细胞膜有什么影响呢？,细胞分裂末期，其中数对子细胞逐步分开，子细胞呈椭圆形（1000）。,给药前人胰腺癌SW1990细胞,细胞呈不规则梭形，表面不平，有细长突起，较多微绒毛结构（ 1000）。,图5-2 扫描电镜观察人胰腺癌SW1990及人宫颈癌Hela细胞表面结构,人胰腺癌SW1990孢子粉组（1mg/ml）,细胞变形，微绒毛减少，细胞表面塌陷，伴穿孔改变（1000）。,细胞变形，悬浮，表面塌陷，有裂缝，穿孔，微绒毛减少或消失，伴穿孔改变（ 800 ）。,人胰腺癌SW1990粗多糖组（1mg/ml）,给药前人宫颈癌hela细胞,细胞表面密布微绒毛，边缘有突起（1500）,细胞变形明显，细胞膜表面有穿孔（1500）。,人宫颈癌hela细胞孢子粉组（1mg/ml）,细胞变细长，类似神经细胞样形态改变，细胞膜表面微绒毛减少（ 3000 ）。,人宫颈癌hela细胞粗多糖组（1mg/ml）,细胞变形，细胞膜缺损，有穿孔（1000）。,细胞变形，微绒毛减少，穿孔明显（3000）。,扫描电镜初步观察结果： 金蝉花孢子粉和粗多糖可使人胰腺癌SW1990及人宫颈癌Hela细胞变形，细胞膜发生穿孔、空洞等改变，破坏细胞膜的完整性。,综上所述，我们从肿瘤细胞的形态、细胞膜结构、细胞内亚微结构、细胞增殖动力学及细胞死亡途径等方面初步观察了金蝉花的抗肿瘤作用。 我们在初步的实验研究中有什