学士学位论文_orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定.doc

NANCHANG UNIVERSITY 学学 士士 学学 位位 论论 文文 THESIS OF BACHELOR 20XX 20XX 年 题 目 orfH79基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定 学 院 生命科学院 系 生物技术系 专业班级 生物工程 学生姓名 XX 学号 XXXXXXXX 指导教师 XXX 职称 XXXX 起讫日期 XXXXXX 南南 昌昌 大大 学学 学士学位论文原创性申明学士学位论文原创性申明 本人郑重申明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式表明 本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担 作者签名 日期 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和 借阅 本人授权南昌大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在 年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密 请在以上相应方框内打 作者签名 日期 导师签名 日期 摘要 I orfH79 基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定 专 业 生物工程 学 号 XXX 学生姓名 XX 指导教师 XXX 摘要 细胞质雄性不育 CMS 现象在植物中普遍存在 表现为雄性败育 但雌配 子和营养生长正常 用于三系杂交水稻避免人工去雄 具有很高的实用价值 然而细胞质雄性不育是细胞核质互作的结果 可以为研究核质互作的分子机理 提供一个很好的材料 线粒体基因组分子内形成异常嵌合基因是 CMS 产生的基 础 由于水稻花药线粒体体外培养及植物线粒体直接转化技术的限制 水稻 CMS 分子机理研究进展缓慢 然而细菌基因的转录和翻译及能量合成方式与线 粒体具有较大的相似性 线粒体基因orfH79是水稻红莲型细胞质雄性不育基因 所以本实验将不育基因导入大肠杆菌中来研究 线粒体中央是基质 基质内含 有与三羧酸循环所需的全部酶类 内膜上具有呼吸链酶系及 ATP 酶复合体 线 粒体对呼吸作用的能量代谢起重要作用 而丙酮酸激酶是能量代谢的关键酶 本实验就是研究orfH79基因对丙酮酸激酶的影响 即通过测酶活来表明 就是 看orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活的影响 本实验就是通过测定管和对照管的 丙酮酸激酶酶活的大小 来推出 orfH79 基因对丙酮酸激酶的酶活影响 最终推 出不育基因对丙酮酸激酶的影响 关键词 细胞质雄性不育 orfH79 基因 大肠杆菌 丙酮酸激酶酶活 Abstract II orfH79 transformed e coli enzyme determination of pyruvate kinase Abstract The phenomenon of cytoplasmic male sterility CMS is widespread in plants performance of abortive male but female gamete and vegetative growth normal It is used for three line hybrid rice to avoid artificial emasculation has the very high practical value Cytoplasmic male sterility CMS is the nucleus interactions however as a result to study on molecular mechanism of karyoplasm interaction provides a good material Mitochondrial genome within molecules form abnormal chimeric gene is the basis of CMS to produce because the rice anther mitochondrial mitochondria in vitro culture and plant the limitation of direct conversion technology rice CMS molecular mechanism research progress has been slow However bacterial gene transcription and translation and energy synthesis method and mitochondria has great similarities Mitochondrial genes orfH79 type is red violet rice cytoplasmic male sterile genes So this study will research sterility gene into e coli Mitochondria the central is a matrix matrix contains all the required enzymes and the Krebs cycle the lining of respiratory chain enzymes and ATP enzyme complexes This experiment is to study the effect of orfH79 gene of pyruvate kinase namely by measuring the enzyme activity show that is watching orfH79 genes affect enzyme activity of pyruvate kinase This study is through the tube and to take care of the size of the pyruvate kinase enzyme activity to launch orfH79 genetic influence on the enzyme activity of pyruvate kinase finally introduced sterility gene effects on pyruvate kinase Key words cytoplasmic male sterility OrfH79 gene E coli Pyruvate kinase enzyme activity 目录 目录 III 摘要 Abstract 目 录 第一章 引言 1 1 1 植物细胞质雄性不育研究意义 1 1 2 植物细胞质雄性不育可能的形成机理 1 1 3 线粒体基因与植物细胞质雄性不育 2 1 4 利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育 3 1 5 丙酮酸激酶与线粒体的关系 5 1 6 研究目的及意义 5 第二章 材料与方法 7 2 1 实验材料与试剂 7 2 2 试验方法 8 第三章 实验结果与分析 10 第四章 实验讨论 13 4 1 微量 orfH79 蛋白抑制丙酮酸激酶的酶活 13 4 2 orfH79 基因抑制大肠杆菌生长机理 14 参考文献 16 致谢 19 第一章 引言 1 第一章 引言 1 1植物细胞质雄性不育研究意义 植物细胞质雄性不育 cytoplasmic male sterility CMS 是一种因线粒体基 因区域的改变 突变 重排 转座等 所导致的 不能产生有活力花粉的母状 遗传性状 是高等植物中较为常见的生物学特征 广泛存在于大约 150 个物种 中 由于细胞质雄性不育系统在研究核质互作 细胞器遗传转化 杂交种商业 化生产等方面所具有的优势 科学家们做出了长期的努力 希望弄清其形成机 理 以前的研究大多集中在对 CMS 的花粉败育时期和原因 不育的稳定性及可 恢复性等进行了较多的经典研究 随着分子生物学理论和技术的迅速发展更新 特别是细胞器分离技术和离体翻译体系的建立 极大地推进了在分子水平对植 物细胞质雄性不育机理的研究 丰富了人们对 CMS 现象的认识 本文则是利用 水稻雄性不育来研究核质互作 1 2 植物细胞质雄性不育可能的形成机理 尽管在一些植物中已经鉴定出与 CMS 有关的线粒体 DNA 片段 但是对植 物细胞质雄性不育的机理仍然知之甚少 一般推测 植物 CMS 形成机理有两种 第一种线粒体基因组中新的嵌合阅读框与其相邻近的保守基因共转录 造成保 守基因的单顺反子转录本减少 从而减少了保守基因编码的蛋白量 致使植物的 某些功能异常或丧失而不育 第二种新的嵌合阅读框编码了一个毒性蛋白 该 蛋白干扰保守基因的生物活性或干扰花药发育中的生理生化过程从而中断花粉 发育形成雄性不育 从恢复基因对 CMS 的影响来看 如果是第一种原因引起 CMS 那么相应的 恢复基因就应该是通过恢复保守基因的表达量来起作用 对几种植物 CMS 的研 究显示 在恢复基因有与无的两种遗传背景下 虽然嵌合基因的转录模式有明 显不同 但都可以检测到线粒体保守基因转录本的存在 且在量上没有明显的 区别 这表明第一种解释并不理想 对第二种解释目前有较多的实验支持 He 等将含特异启动子 线粒体转导 序列 菜豆的不育相关基因orf239的序列导入烟草细胞核基因组 获得了几株 第一章 引言 2 含有orf239的不育和半不育的转基因植株 免疫细胞学分析表明 在转基因植 株中异常发育的小孢子细胞壁表达出不育相关蛋白 orf239 认为 orf239 序列的 表达可能与转基因烟草的花粉败育直接相关 赵荣敏等学者将 orf224 部分编码 序列及全长序列导入大肠杆菌 结果发现具有 orf224 特异表达产物特征的大肠 杆菌生长减缓 推测 orf224 可能编码一个毒蛋白 在此研究水稻的不育情况利 用的是 orfH79 基因 来研究水稻不育情况的形成途径 1 3 线粒体基因与植物细胞质雄性不育 高等植物线粒体基因组尽管非常庞大 但所编码的功能基因有限 拟南芥 线粒体因组 DNA 是至今唯一全序列测定的高等植物线粒体基因组 全长 366924bp 的 DNA 序列只编码 57 个基因 高等植物线粒体基因的编码序列保守 性很强 而编码区以外的序列保守性很低 这个特点有利于利用已知基因研究 其它各种植物线粒体基因的多态性变在植物线粒体中还 DNA 含有一些开放的阅 读框架 它们能转录 但其功能和编码蛋白不清楚 这些阅读框有的是通过线 粒体基因组重排而形成的嵌合基因 在不同植物中发现的近 20 个不同嵌合基因 中有的与植物雄性不育性有关 1 3 1 确定细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段的方法 确定与细胞质雄性不育相关基因或基因片段 可采用以下几种材料 1 不 育系和保持系 2 不育系和育系的自发回复突变体 3 组培或原生质体融合分 化产生的不育和可育植株 可以采用如下方法 1 用已知线粒体基因作探针对 上述材料线粒体 DNA 进行 RFLP 分析或 Northern 分析 寻找二者间存在差异 的基因 2 用限制性内切酶消化不育和正常胞质线粒体 DNA 直接从分离胶上 回收并克隆不育或正常 mtDNA 特异片段 3 用 AP PCR RAID 或 AFLP 等方 法比较正常和不育胞质线粒体 DNA 差异 克隆不育系特异的扩增片段 4 用差 异展示的方法 寻找不育与正常胞质线粒体差异 RNA 以上 4 种方法获得的差 异片段可直接作为探针从线粒体 DNA 文库或 eDNA 文库中筛选阳性克隆 进 而确定与细胞质雄性不育有关的阅读框 1 3 2 与细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段 水稻 BT CMS 不育系统的线粒体的 DNA 含两个 atp6 基因 而保持系只有 第一章 引言 3 一个 系列分析表明 不育系两个 atp6 基因中的一个与保持系完全一致 只是 在终止子下游 49 位产生歧化 另一个 atp6 基因是一个嵌合基因 来源于线粒 体 DNA 分子内重组 Kodoawki 将它定名为 urf rmc 水稻野败型不育系和保持 系除前述发现线粒体 DNA 酶切带谱有着差异 大多数小麦不育系来自于普通小麦和提莫菲维小麦的杂交后代 T CMS 小 麦体细胞 培养再生不育和可育株 atp6 基因附近有差异 而 T CMS 小麦不育系 和保持系 coxl 区域有差异 不育系 coxl 上游多一个 orf256 估计不育系 atp6 基 因区域以及 orf256 可能与 T CMS 小麦不育性有关 另外 有人还发现 T CMS 小麦不育系和保持系们 rm5 rm8 以及 atpA 也有差异 对于 K CMS 和 V CMS 小麦李传友和王斌发现不育系和对应保持系 atpA atp9 cob 基因附近有 差异 而黑麦不育和正常胞质的 atp6 和 coxl 位点有差异 1 4 利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育 1 4 1 利用大肠杆菌研究过的 CMS 基因 已有的研究表明一些经过转基因鉴定的引起植物细胞质雄性不育的基因 在原核生物中表达对其生长具有抑制作用 至今为止 在原核生物中 CMS 分子 机理的研究较深入的只有 T 型玉米细胞质不育基因 urf13 Deway 等将 urf13 基 因导入大肠杆菌 发现 urf13 基因所编码蛋白能吸附在玉米线粒体内膜上 当 大肠杆菌培养物中加入 methomyl 时 大肠杆菌的细胞膜通透性增加并膨胀 同 时大肠杆菌的呼吸也受到抑制 最后导致细菌死亡 这种情况与 T 型玉米离体 线粒体加入 methomyl 的表型类似 接着 Korth 在研究 T 型玉米时 发现 URF13 蛋白一部分与大肠杆菌线粒体内膜形成低聚状态同时在线粒体内膜上会 形成穿孔 之后 在研究萝卜 CMS 基因 orf138 芥菜 CMS 基因 orf288 BT 型 水稻 CMS 基因 orf79 向日葵 CMS 基因 orf522 时 CMS 基因在原核生物中的 表达均能对大肠杆菌生长产生抑制作用 但 CMS 基因所编码蛋白在大肠杆菌中 究竟如何抑制细菌生长的分子机理并没有进一步进行深入的研究 1 4 2 大肠杆菌与线粒体有类似的遗传体系 1 4 2 1 细菌的内共生学说 第一章 引言 4 由美国生物学家马古利斯 LynnMargulis 于 1970 年出版的 真核细胞的 起源 一书中正式提出 是关于真核生物细胞中的细胞器 线粒体和叶绿体起 源的学说 根据这个学说 它们起源于内共生于真核生物细胞中的原核生物 这种理论认为线粒体起源于好氧性细菌 很可能是接近于立克次体的变形菌门 细菌 而叶绿体源于内共生的光合自养原核生物蓝藻 这个理论的证据非常完 整 目前已经被广泛接受 它的主要根据是 1 共生是生物界的普遍现象 例如根瘤菌与豆科植物的共生关系 蓝藻 或绿藻与真菌共生形成地衣等 有一种草履虫 其体内有小的藻类与之共生 并能进行光合作用 过去说澳洲白蚁消化道内生活着一种所谓混毛虫 实际由 两种螺旋体 两种真细菌和一种纤毛虫组成 它们能分泌有关的酶 消化纤维 素 特别是近年发现的灰孢藻 它本身并无叶绿素 但有许多叶蓝小体生活在 体内 进行光合作用制造食物 这种共生关系看来建立不很久 因为叶蓝小体 在细胞内还不大固定 灰孢藻的发现是对 内共生假说 的有力支持 2 叶绿体和线粒体都有其独特的 DNA 可以自行复制 不完全受核 DNA 的控制 线粒体和叶绿体的 DNA 同细胞核的 DNA 有很大差别 但同细 菌和蓝藻的 DNA 却很相似 蓝藻的核糖体 RNA rRNA 不仅可以与蓝藻本身 的 DNA 杂交 而且还可与眼虫叶绿体的 DNA 杂交 这些都说明它们之间的同 源性 3 线粒体和叶绿体都有自己特殊的蛋白质合成系统 不受核的合成系统 的控制 原核生物的核糖体由 30S 和 50S 两个亚基组成 真核生物的核糖体由 40S 和 60S 两个亚基组成 线粒体和叶绿体的核糖体分别与细菌和蓝藻的一致 也是由 30S 和 50S 两个亚基组成 这说明细菌和线粒体 蓝藻和叶绿体是同源 的 抗生素可以抑制细菌和蓝藻的生长 也可以抑制真核生物中的线粒体和叶 绿体的作用 这也说明线粒体与细菌 叶绿体与蓝藻是同源的 4 线粒体 叶绿体的内 外膜有显著差异 内 外膜之间充满了液体 研究发现 它们内 外膜的化学成分是不同的 外膜与宿主膜比较一致 特别是和内质网膜很相似 内膜则分别同细菌和蓝藻的膜相似 总之 内共生假说 得到了多方面的实验 支持 因而被越来越多的人所接受 1 4 2 2 大肠杆菌与线粒体相似性 线粒体在形态 染色反应 化学组成 物理性质 活动状态 遗传体系等 方面 都很像大肠杆菌 线粒体具有独立的转录翻译体系 线粒体有其独立的 rRNA tRNA 核糖体等可以用来表达的基因 这些成分与细胞质相应成分不同 第一章 引言 5 而与细菌的比较相似 不受细胞核控制 且与大肠杆菌一样都具有多顺反子的 转录线粒体遗传体系和大肠杆菌有很多相似的地方 如 1 DNA 结构为环状 无内含子 2 核糖体为 70S 型 3 RNA 聚合酶不被放线菌素 D 所抑制 溴化乙锭可抑制 4 氨酰基 tRNA 合成酶 tRNA 与细胞质中不相同 5 N 甲酰甲硫氨酰 tRNA 是蛋白质合成的起始氨酰基 tRNA 其对细菌蛋白质合成 的抑制剂氯霉素敏感而对细胞质蛋白合成的抑制剂放线菌酮则不敏感 近年来 科学家发现了原核生物的质膜上存在着与线粒体内膜上结构保守和功能相似的 呼吸电子传递链复合体 I II III IV 和 V 所以本文用大肠杆菌代替线粒 体 现在没有技术研究线粒体 而线粒体和大肠杆菌有类似的地方 本实验就 是将不育基因导入大肠杆菌中来研究 1 5 丙酮酸激酶与线粒体的关系 线粒体由两层膜包被 外膜平滑 内膜向内折叠形成嵴 两层膜之间有腔 线粒体中央是基质 基质内含 有与三羧酸循环所需的全部酶类 内膜上具有呼 吸链酶系及 ATP 酶复合体 线粒体能为细胞的生命活动提供场所 是细胞内氧 化磷酸化和形成 ATP 的主要场所 有细胞 动力工厂 power plant 之称 线粒体有自身的 DNA 和遗传体系 但线粒体基因组的基因数量有限 因此 线粒体只是一种半自主性的细胞器 线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位 是糖类 脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所 线粒体负责的最终氧化的共 同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化 分别对应有氧呼吸的第二 三阶段 丙酮酸激酶使磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 变为 ATP 和丙酮酸 是糖酵解过 程中的主要限速酶之一 是有氧呼吸的关键酶 是能量呼吸过程中重要的酶 一般认为 丙酮酸激酶活性受参与糖酵解的物质 如磷酸烯醇式丙酮酸 1 6 二 磷酸果糖和中间产物等几种物质调节 它们都能增加丙酮酸激酶的活性 因此 糖酵解的速度正相关于以上几种物质的含量 丙酮酸激酶是作为糖酵解的重要 限制酶之一 影响糖酵解的速度 从而影响有氧呼吸作用 线粒体又是细胞能 量过程重要场所 丙酮酸激酶对于线粒体中反应过程中具有重要的作用 1 6 研究目的与意义 植物细胞质雄性不育在杂种优势利用上的重要价值一直是人们研究的热点 第一章 引言 6 并且是研究核质互作的好材料 对了解植物生命活动机制有重要意义 然而 植物细胞质雄性不育因其自身的表型特异性 活性线粒体体外操作与培养的技 术瓶颈严重阻滞了 CMS 分子机理的研究 至今为止 细胞质雄性不育的分子机 理仍不清楚 本课题以大肠杆菌这一与线粒体类似的遗传体系来系统的研究水稻红莲型 雄性不育基因 orfH79 对大肠杆菌抑制机理 同时避开了线粒体体外培养的难题 为研究 CMS 分子机理提供了一个新的思路 本课题研究的是雄性不育基因 orfH79 对大肠杆菌上丙酮酸激酶的影响 是通过测过 orfH79 基因转化大肠杆菌 丙酮酸激酶的酶活测定实现的 第二章 材料与方法 7 第二章 材料和方法 2 1 实验材料与试剂 2 1 1 菌株与培养基 1 菌株 构建原核表达载体的工程菌株为 pET 28a 和 BL21 均在本实验室 80 保存 2 培养基 LB 培养基 1L 胰化蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 加入去离子水至 1000ml 用 5mol LnaOH 调整 PH 至 7 0 121 高压灭菌 20min 配置 LB 固体培养基时 调整 PH 后加入琼脂粉 15g L 即可 2 1 2 试剂配制 1 9 的生理盐水 1 8g 的氯化钠定容至 200ml 的溶液 2 南京建成公司 PK 试剂盒 试剂一 液体 60ml 1 瓶 4 保存 试剂二 粉剂 2 支 20 保存 每支用时加蒸馏水 1 4ml 用不完的放 20 以下 可保存 3 7 天 如果样品量少 可以将 1 4ml 再分成 2 3 管放 20 以 下保存 每次取一管用 以免反复冻融 试剂三 液体 4 支 4 保存 用不完的仍放 4 8 保存 试剂四 粉剂 4 支 20 保存 用时每支加蒸馏水 320ul 用不完的试剂放 20 以下保存 试剂五 粉剂 4 支 20 保存 用时每支加蒸馏水 650ul 用不完的试剂放 20 以下保存 3 蛋白定量测试盒 100T 96 样 试剂一 考马斯亮蓝备液 60ml 1 瓶 4 保存 6 个月 考马斯亮蓝显色液的配制 按考马斯亮蓝贮备液 双蒸水 1 4 的比例进行配制 即 5 倍稀释 用多少配多少 现用现配 试剂二 蛋白标准 0 563g L 蛋白标准液 0 5ml 1 支 4 保存 1 个月 如要 延长时间将标准液分装后 20 冷冻保存 6 个月 4 蛋白提取裂解液 10ml 8mol L 尿素 2mol L 硫脲 4 w v CHAPS l w v DTT 0 8 w v 35mmol LTris 5mmol LEDTA 临用前加入 0 1gDTT 100ul PMSF 以及 80ul 两性电解质 PH3 10 第二章 材料与方法 8 5 蛋白提取缓冲液 0 01mol L Tris 0 25mol L 葡萄糖 2 1 3 主要仪器 仪器名称生产厂家 冷冻高速离心机 Milli Q 超纯水系统 超低温冰箱 分光光度计 超声波细胞粉碎仪 摇床 生化培养箱 立式灭菌锅 分析天平 酸度计 超净工作台 快速混匀器 SIGMA 公司 Millipore 公司 Thermo 公司 上海光谱分析仪器厂 宁波新芝公司 Sanyo 公司 Sanyo 公司 杭州汇尔仪器公司 Eppendorf 公司 上海同卡实业有限公司 苏州净化有限公司 2 2 试验方法 2 2 1 细菌蛋白提取 1 取活化的 pET 28a orfH79 和 pET 28a BL21 表达菌株 按 1 接种于 50mlLB 培养基中 摇床振荡培养 37 200rpm 2 每隔一段时间测其光密度 OD600nm时的吸光值 当 OD 值为 0 6 时 在培养 基中加入 50 l IPTG 继续振荡培养 3 一个锥形瓶中的 pET 28a orfH79 BL21 表达菌株培养六小时即 Na6 菌种 第 二个锥形瓶中的 pET 28a orfH79 BL21 表达菌株即 Na12 菌种 第三个锥形瓶中 pET 28a BL21 表达菌株培养 12 小时即 28a 菌种 将菌体转移至离心管中 以 6000rpm 冰冻离心 10min 收集菌体 4 菌体使用缓冲液悬浮洗涤 3 次 离心 10000rpm 收集菌体 5 菌体转移到容器中 加入 5ml 裂解液 充分混匀 6 冰浴超声 5min 200w 15sec 脉冲 30sec 停止 7 取出细胞裂解液 以 14000rpm 冰冻离心 15min 收集上清 第二章 材料与方法 9 2 2 2 测蛋白浓度 1 操作表 按操作表 的步骤进行操作 空白管标准管测定管 双蒸水 ml 0 563g l 标准液 ml 样品 ml 考马斯亮蓝显色剂 ml 0 05 0 0 3 0 0 05 0 0 3 0 0 0 0 05 3 0 表 混匀 静置 10 分钟 于 595nm 处 1cm 光径 双蒸水调零 测各管 OD 值 2 2 3 测定吸光度 1 操作表 按操作表 的步骤进行操作 测定管 对照管 试剂一 ml 试剂二 ml 试剂三 ml 试剂四 ml 试剂五 ml 1 0 05 0 05 0 025 0 05 1 0 05 0 05 0 025 0 05 表 将各管上述试剂混匀后 37 度预热 10min 然后按表 进行操作 测定管对照管 蒸馏水 ml 样本 ml 0 0 02 0 02 0 表 加样本的同时开始计时 快速混匀后 波长 340nm 0 5cm 光径的石英比色 皿 蒸馏水调零 测定 30 秒时初始吸光度 A1 值 然后将比色皿中的反应液倒 入预先编号的原试管中 放入水浴箱中准确水浴 15 分钟 然后取出试管测定 第二章 材料与方法 10 15 分 30 秒时的吸光度 A2 值 第三章 结果与分析 3 1 实验结果与分析 1 蛋白浓度测定结果 蛋白浓度计算公式 蛋白浓度 g L 测定 OD 值 空白 OD 值 标准 OD 值 空白 OD 值 标准品浓度 0 563g L 利用染液 从中测定丙酮酸酶的活性 重复试验 得在 590nm 的波长下测得的 OD 值数值三组数据如下表 菌种 组数 空白 加蒸 馏水 标准蛋白 Na6Na1228a A B C 平均值 0 330 0 332 0 327 0 330 0 510 0 518 0 516 0 515 0 679 0 681 0 685 0 682 0 893 0 907 0 905 0 902 0 753 0 739 0 749 0 747 表 1 1 菌 种 组数 空白 加 蒸馏水 标准蛋白 Na6Na1228a D E F 平均值 0 351 0 354 0 350 0 352 0 510 0 513 0 516 0 513 0 681 0 685 0 686 0 684 0 931 0 933 0 930 0 931 0 755 0 754 0 757 0 755 表 1 2 菌 种 组数 空白 加 蒸馏水 标准蛋白 Na6Na1228a G H I 平均值 0 333 0 332 0 334 0 333 0 443 0 441 0 445 0 443 0 583 0 587 0 605 0 592 0 872 0 871 0 880 0 874 0 680 0 699 0 697 0 692 表 1 3 根据蛋白浓度的计算公式 可以得出不同菌种重复试验下所得蛋白浓度的平均 第三章 结果与分析 11 值 单位 g L 菌种 组数 Na6Na1228a 1 2 3 1 07 1 16 1 33 1 74 2 02 2 77 1 27 1 41 1 75 表 1 2 吸光度结果 利用 PK 试剂盒 测得菌种的酶活性 在 340nm 的波长下测得的 OD 值数值如表 1 菌种 OD 值 Na6Na1228a 反应前吸光度 A1 0 506 0 507 0 509 0 460 0 463 0 458 0 498 0 496 0 501 A1 的平均值 0 5070 4600 498 反应后吸光度 A2 0 490 0 492 0 491 0 453 0 455 0 447 0 457 0 456 0 451 A2 的平均值 0 4910 4550 455 表 2 1 菌种 OD 值 Na6Na1228a 反应前吸光度 A1 0 663 0 664 0 665 0 482 0 483 0 484 0 510 0 512 0 511 A1 的平均值 0 6640 4830 511 第三章 结果与分析 12 0 6410 4720 461 0 6490 4680 462 反应后吸光度 A2 0 6520 4780 457 A2 的平均值 0 6470 4730 460 表 2 2 菌种 OD 值 Na6Na1228a 反应前吸光度 A1 0 541 0 543 0 544 0 532 0 535 0 531 0 539 0 537 0 536 A1 的平均值 0 5430 5330 537 反应后吸光度 A2 0 530 0 532 0 529 0 527 0 522 0 524 0 491 0 489 0 492 A2 的平均值 0 5300 5240 491 表 2 3 酶活的定义是指在 37 度 PH7 6 的条件下 每克组织蛋白每分钟将 1umol 的磷酸烯醇式丙酮酸 PEP 转变成丙酮酸为一个酶活力单位 由酶活的定义 可得丙酮酸激酶活力的计算公式 丙酮酸激酶活力 A1 A2 毫摩尔消光系数 1 反应时间 比色光径 反应液总体积 取样量 匀浆蛋白含量 1000 酶活单位 U gprot 即丙酮酸激酶活力 A1 A2 6 22 1 15 1 1195 20 所测蛋白含量 1000 其中 毫摩尔消光系数 6 22 反应时间 15s 比色光径 1cm 反应液 总体积 1195ul 取样量 20ul 蛋白含量单位 g L 由酶活计算公式 可得丙酮酸激酶酶活的测定 菌种 酶活 U gprot Na6Na1228a 1 2 3 平均值 5 99 9 37 6 26 7 02 2 94 3 17 2 08 2 73 21 68 23 16 18 83 21 40 第三章 结果与分析 13 第四章 实验讨论 14 第四章 实验讨论 4 1 微量 orfH79 蛋白抑制丙酮酸激酶的酶活 28a 菌种是指导入pET 28a载体的大肠杆菌 Na 菌种是指导入嵌合不育基 因的载体orfH79 pET 28a的大肠杆菌 其中 Na6 菌种表示导入orfH79 pET 28a的大肠杆菌有氧条件下培养 6 个小时 Na12 菌种表示导入orfH79 pET 28a 的大肠杆菌有氧条件下培养 12 个小时 由实验结果可知 28a 的酶的活性明显大于 Na6 和 Na12 的酶的活 表明导入 orfH79 pET 28a的大肠杆菌对丙酮酸激酶的酶活性起抑制作用 而丙酮酸激酶 作为有氧呼吸过程中的关键酶 可知不育基因表达产物蛋白对有氧呼吸过程有 抑制作用 而 Na6 的酶的活性大于 Na12 的酶的活性 由上述结果可知不育基因 orfH79 抑制大肠杆菌丙酮酸激酶的活性 并随着有氧条件下培养时间越久抑制 作用会更强 可推测导入不育基因 orfH79 载体的大肠杆菌随有氧条件培养时间 越长 不育基因表达产物蛋白的积累越多 而过多的产物积累进一步抑制了大 肠杆菌的有氧呼吸 4 2 orfH79 基因抑制大肠杆菌生长机理 花药与花粉的发育是非常复杂的过程 如果主要代谢途径出现功能障碍如 糖代谢 就可能影响花粉发育 25 研究表明 在 CMS 的烟草花药中 ATP ADP 比值低于正常育性的烟草 彭等将orfH79基因转入野生型水稻后导致花粉败育 并且小孢子内有过量积累活性氧 ATP ADP 比值下降 6 推测花粉发育时期能 量不足导致 CMS 并且 张等在研究水稻 HL 型 CMS 时 发现 HL CMS 系与可育 植株相比 呼吸电子传递链途径受到抑制 细胞质雄性不育系植株产生的生物 量明显低于可育植株 而呼吸作用反而上升 推测 ATP 相关酶 F0F1 ATPase 的 异常对 HL CMS 有较大的影响 43 本实验从呼吸作用的关建酶丙酮酸激酶酶活 研究得出 orfH79 基因的表达产物会抑制大肠杆菌有氧呼吸 导致有氧呼吸产生 的能量不足 从而抑制大肠杆菌生长 与一些学者以前的研究结果相吻合 本次实验只是研究水稻细胞质雄性不育的形成机理的方向之一 是在以前 师兄有氧条件下 orfH79 基因转化细菌生长曲线测定实验基础上进一步研究的 第四章 实验讨论 15 由师兄实验结果可知导入orfH79 pET 28a的大肠杆菌生长受到抑制 可知有氧 条件下 orfH79 基因对细菌的生长是抑制的 本实验则是具体研究不育基因对细 菌有氧呼吸过程的酶的影响 综合来看 可以知道不育基因对细菌有氧呼吸产 生抑制 使细菌能量供应不足 从而影响细菌的生长 参考文献 参考文献 1 王永飞 马三梅 植物细胞质雄性不育的分子机理研究进展 J 自然科学进展 2002 10 2 凌杏元 植物细胞质雄性不育分子机理研究进展 N 植物学通报 2000 17 4 319 3 韩国忠 基因工程及其分子生物学基础 M 北京 北京大学出版社 1999 4 吴冠芸 生物化学与分子生物学实验常用数据手册 M 北京 科学出版社 1999 5 高洁 油菜细胞质雄性不育系叶绿体 DNA 特异片段的分子克隆 N 遗传学报 1987 14 5 337 6 孙威 油菜 cpDNA 基因组雄性不育特异 DNA 片段的定位 N 遗传学报 1992 19 1 55 7 谢友菊 用线粒体 DNA 鉴定玉米雄性不育细胞质的研究 N 遗传学报 1988 15 5 335 8 Leaving C S The Texas cytoplasm of maize Cytoplasmic and disease susceptibility Science 1990 250 942 9 易平 汪莉 红莲型细胞质雄性不育线粒体相关嵌合基因的发现 J 科学通报 2002 2 130 133 10 吴豪 徐虹 刘振兰 刘耀光 植物细胞质雄性不育及其育性恢复的分子基础 J 植物学通报 2007 11 张晓 张锐 侯思宇 郭三堆 高等植物线粒体基因组研究进展 J 中国农 业科技导报 2011 12 Kaul MLH Male Sterility in Higher Plants Berlin Spinger Verlag 1998 211 256 13 Hanson MR Bentolila S Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development Plant Cell 16 Suppl 2004 154 169 14 Xiaojue Peng Kun Wang Chaofeng Hu Youlin Zhu Ting Wang Jing Yang Jiping Tong Shaoqing Li Yingguo Zhu The mitochondrial gene orfH79 plays a critical role in impairing both male gametophyte development and root growth in CMS Honglian rice BMC Plant Biology 10 125 参考文献 17 15 Korth KL Struck F Kaspi CI Siedow JN Levings III CS URF13 a maize mitochondrial pore forming protein is oligomeric and has a mixed orientation in Escherichia coliplasma membranes Proc Natl Acad Sci USA 88 1991 10865 10869 16 P Bergman J Edqvist I Farbos Male sterile tobacco displays abnormal mitochondrial atp1 transcript accumulation and reduced floral ATP ADP ratio Plant molecular biology Plant molecular biology 2000 17 Sophie Grigorieff Mohammed Sabar Christine Lelandais Lack of mitochondrial and nuclear encoded subunits of complex I and alteration of the respiratory chain in Nicotiana sylvestris mitochondrial deletion mutants National Acad Sciences 1997 18 S Iwata C Ostermeier B Ludwig Structure at 2 8 A resolution of cytochrome coxidase from Paracoccus denitrificans Nature vol 376 1995 19 Yan B Pring DR Transcriptional Initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features Curr Genet 32 1997 287 295 20 Paul Jarvis Intracellular signalling The chloroplast talks Current Biology 11 8 pp R307 R310 21 Jeffrey L Blanchard and Michael Lynch Organellar genes why do they end up in the nucleus Trends in Genetics 2000 16 7 315 320 22 朱英国 水稻雄性不育生物学 M 武汉 武汉大学出版社 2000 1 3 23 Grigorieff Three dimensional structure of bovine NADH ubiquinone oxidoreductase complex I at 22 in ice Journal of Molecular Biology 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