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流式细胞术 流式细胞术 对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测 FlowCytometry 特点 速度快 10000cells s 特异性强 灵敏度高 MRD 1 10000 多参数分析 活细胞分选 研究对象 单细胞悬液可检测的样本种类多样 外周血 骨髓 细胞穿刺液 洗脱液 实体组织 培养细胞 藻类等 2 流式细胞术 3 FACSVerse AccuriC6 LSRforttesa 现代流式细胞仪 Flowcytometer 4 FL2PE SSC FSC 电子系统 计算机系统 FL3PerCP Cy5 FL1FITC Lightdetectors 液流系统 光学系统 laser 流式细胞仪工作流程 5 流式细胞仪的构造 1 细胞样本成单列依次通过光检测区 6 液流系统 流动室 Flowcell Laser Sample 流体动力学聚焦 鞘液 sheath 7 样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法鞘液压力恒定 流速不变通过调节样本压力调节样本进样速率 液流系统 液流驱动系统 8 调节样本进样速度 样本流与鞘液压力差改变 样本流直径改变 细胞间距改变 10psi 10psi 10psi 10 2psi 10 4psi 10 8psi 压力差样本流进样速度 Hi Lo Med 9 Lowpressure Highpressure 细胞周期 FL3 0 1024 2048 3072 4096 Count 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 G0 G1CV 2 42 G2 M Sphase G0 G1 GO G1CV 7 79 GO G1CV 7 79 10 流式细胞仪的构造 1 细胞样本成单列依次通过光检测区 2 激发并收集各种光信号 11 光学系统 激发光学系统 激发光源 激光透镜和反射镜 将激光引导到检测区域接收光学系统 滤光片等 将产生的光信号引导到对应的光学接收器 12 激发光学系统 将激光引导到检测区域 产生光信号 激光 单波长高强度高稳定 488nmblue633nmred405nmviolet LightSignals 光学棱镜 13 流式细胞仪检测信号 Laserbeam 1 散射光信号2 染色过细胞的荧光信号 前向角散射光 FSC 侧向角散射光 SSC 360度立体角 14 通过流式细胞仪我们可以得到 相对细胞大小 前向角散射光 FSC 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 侧向角散射光 SSC 染色过细胞的相对荧光强度 荧光 Fluoresentlight 15 前向角散射光 FSC Forward AngleLight Scatter FSC信号收集方向与激光束相平行 FSC与被测细胞或颗粒相对大小及表面积相关 16 前向角散射光 FSC FSCisproportionaltorelativesize cell surfacearea 17 侧向角散射光 SSC Side scatteredlight 90DegreeLightScatter SSC信号收集方向与激光束相垂直 90 SSC与被测细胞或颗粒内部颗粒度和结构复杂度相关 18 侧向角散射光 SSC SSCisproportionaltocellgranularityorinternalcomplexity 19 散射光 FSC SSC 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 通常使用 散点图 来看散射光信号 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 20 eg MajorleucocytesubpopulationscanbedifferentiatedusingFSCandSSC Figure CellsubpopulationsbasedonFSCvsSSC DualParameterdot plot 21 流式细胞仪检测信号 Laserbeam 1 散射光信号2 染色过细胞的荧光信号 自发荧光信号特异性荧光信号 22 荧光信号 Fluoresentlight 23 双色荧光散点图 24 荧光强度 Fluoresenceintensity 荧光信号的强度代表被测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质浓度 25 荧光信号 Fluoresentlight 荧光信号收集方向与激光束相垂直 90 26 接收光学系统 接收光信号 并将光信号引导到对应的接收器中 光学滤片 LongpassShortpassBandpass 500 25 27 FACSCalibur光路图 每个探测器前往往为BP 所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号 28 光学探测器 光电二极管 FSCPhotodiodes 光电倍增管 SSC FluoresencePhotomultipliertubes PMTs 光电转换器 将光信号转换为电信号 29 流式细胞仪的构造 3 光信号转换成电信号 数字化处理 1 细胞样本成单列依次通过光检测区 2 激发并收集各种光信号 30 电子系统 将光信号转化为电信号 模拟信号 将模拟信号转化为数字信号计算每个脉冲峰和计算机连接以传出数据 将光信号成比例的转换成电信号 并进行数字化处理后传入计算机 31 光信号转换为电信号 PMT电压电信号 32 电压脉冲的产生 模拟信号 33 计算一个电压脉冲峰 面积是对荧光光通量进行积分测量的结果宽度 面积 高度 与颗粒通过激光照射区的时间成正比特定参数可选择面积 宽度信号 DNA含量分析 34 模拟信号转换为数字信号 35 流式细胞仪的构造 3 光信号转换成电信号 数字化处理 4 数字信号传入计算机 1 细胞样本成单列依次通过光检测区 2 激发并收集各种光信号 36 数据的获取表现 37 专业软件中的数据表现 单参数直方图双参数散点图三维点图 等高图密度图 38 设门 Gating 平均荧光强度 百分比 39 流式细胞仪的构造 1 细胞样本成单列依次通过光检测区 2 激发并收集各种光信号 3 光信号转换成电信号 数字化处理 4 数字信号传入计算机 5 活细胞分选 40 分选系统 检测 加电 偏转 收集 41 Review Sorting 42 ReviewQuestions 在仪器设置中调高Red参数的电压 左图中群体会发生什么变化 43 如何进行流式细胞实验 1 样本处理2 荧光染料的选择3 染色4 数据收集和分析 44 1 样本处理 单细胞悬液 细胞悬液 直接使用外周血 骨髓 最接近生理状况 操作简便 样本用血量小灌洗液 体腔积液培养细胞 细胞系实体组织 病理组织 新鲜样本 石蜡包埋样本针吸组织 新鲜样本 45 2 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 46 荧光信号 Fluoresentlight 47 Fluorescein FITC 400nm 500nm 600nm 700nm Wavelength Excitation Emisson 300nm400nm500nm600nm700nm 48 Excitation Emisson 300nm400nm500nm600nm700nm Phycoerytherin PE 49 Allophycocyanin APC 633nm红激光 Excitation Emisson 300nm400nm500nm600nm700nm 50 2 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 51 FACSCalibur光路图 每个探测器前往往为BP 所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号 52 2 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 53 2 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 54 55 荧光光谱重叠与补偿 530 30 585 42 利用电子术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称 荧光补偿 56 荧光补偿 补偿前补偿后 57 2 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 58 59 3 染色 体积温度孵育时间对照 60 4 数据收集和分析 1 画图 直方图 散点图 2 调整仪器设置到合适的状态3 寻找目标细胞4 我们可以得到怎样的结果 它们意味着什么 61 仪器设置调节 1 用阴性细胞调整仪器PMT电压 2 用单染色的细胞调节仪器补偿 二原则 62 同型对照 Isotypecontrol 例 一个双色染色的实验抗体AFITC 抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC IgG1PE那么需要准备的是阴性对照 细胞加上IgG1FITC IgG1PE单阳性对照 FITC 细胞加上AbAFITCPE 细胞加上A