透析袋使用前如何处理.doc

透析袋在使用前如何处理透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4透析，升高温度可加快透析速度。透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素（再生纤维素RC、纤维素酯CE、PVDF等）制成的透析膜，目前常用的是美国美国光谱医学公司（spectrum，上海欧韦达仪器科技有限公司是中华区特约总经销）和美国Union Carbide （联合碳化物公司，上海欧韦达仪器科技有限公司是华东区特约经销商）生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等种类，单位为道尔顿（D）。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为8 mm77 mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量）通常为1万左右。截留分子量越大也就是说透过性越大，一般而言，透析袋截留分子量越小价格越贵，因为截留的分子越小要求透析袋越密，价格越贵。透析袋使用前处理： 1. 把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。2. 在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。4. 放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。前处理也可以将透析袋放在广口瓶中充满水，松动瓶盖，于20psi（1.40kg/cm2)高压灭菌10min，代替第四步用1mmol/LEDTA(PH=8)中煮沸10min的操作。5. 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。若长时间不用，可加少量叠氮钠NaN2，以防长菌 。从此时起取用透析袋是必须戴手套。6. 用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。这样做可以保证透析袋有良好的透析效果。7.新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。8.佰易聚商城技术说：透析袋不推荐反复使用，如果要反复使用就是用之前怎么处理的，用后也怎么处理。9.透析袋要看你购买的是可再生的还是一次性的。即使是可再生的也请使用于同种蛋白，避免交叉污染。10.短时间内再次使用的话，可用去离子水洗净后，浸泡于20%乙醇溶液中，使用时务必将乙醇洗净。11.使用后的透析袋保存方法：.用生理盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸馏水清洗干净，然后置于50乙醇中保存即可美国美国光谱医学公司生产的透析袋大部分是预处理过的，即用型，使用前只需用蒸馏水冲洗即可使用，spectra/por7系列和生物技术级的透析袋基本不含硫化物和重金属离子。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。检查透析效果的方法是：用1 BaCl2检查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 检查NaCl、KCl等。透析纳米颗粒带有机溶剂的，如何处理透析袋重复使用？先看是美国光谱医学的还是美国联合碳化的透析袋？美国公司的方法都不一样的。大多数先用50乙醇煮沸1小时，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。透析膜 (前处理方法如下)：1. 戴手套把透析膜剪成适当长度，浸在蒸馏水中 15 min 泡软。2. 浸入 10 mM sodium bicarbonate 中，并加热至 80，一边搅拌至少 30 min。3. 换到 10 mM Na2EDTA 中浸泡 30 min，以新鲜的 EDTA 同样方法处理三次。4. 再用 80 蒸馏水洗 30 min，然后换到 20% 酒精中，放在 4 冰箱中保存。透析是利用半透膜的选择性在溶液里分离大分子和小分子的一种分离技术，常常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、还原剂之类的小分子杂质，有时也用于置换样品缓冲液。样品在膜的一边，缓冲液在另一边，小分子即向两边扩散直到平衡透析是利用半透膜的选择性在溶液里分离大分子和小分子的一种分离技术，常常用于除去蛋白或核酸样品中的盐、变性剂、还原剂之类的小分子杂质，有时也用于置换样品缓冲液。样品在膜的一边，缓冲液在另一边，小分子即向两边扩散直到平衡,而大分子则由于半透膜的阻拦而留在一端，通过不断更换缓冲液，即可将样品中要除掉的小分子稀释到足够低的浓度。该技术自五十年代发展流行起来，主要使用半透膜制成的透析袋作为工具，一直存在透析时间长、样品回收率不高、无法处理微量样品的难题。如今Pierce公司推出三种不同的透析工具有效解决了部分问题.这是专为10到100微升的微量样品透析而设计的。把样品加在平底的透析管（类似小量提质粒的离心纯化柱Mini Spin，可以插入1.5毫升的离心管中，管底是半透膜)中，再插入特制的浮板（浮漂）中，置于缓冲液面10分钟即完成透析。实验表明，100微升pH2.8的IgG洗脱液在1升pH9.4的缓冲液中只需不到10分钟即可平衡到pH9.4。如果在装缓冲液的烧杯底加磁力棒搅拌则更能加速透析速度。这种方法有较高的回收率，能够节约珍贵的样品，并能节约时间，特别适合摸条件的预实验。根据半透膜的孔径和分子量截留值（分离范围）可分为3种规格：3.5K MWCO、7K MWCO和10K MWCO。透析袋直径大约2cm，样品为大分子溶液，长度约10cm，请问一般多久需要换水，多少天可以除去小分子？简单的做法是每过1天换水一次，总共换水4-5次。专业点的做法是，把水置于下面，下面为蒸馏瓶，上面是冷凝管及透析袋，带一个连通器，上面的水满了就会自动跑到蒸馏瓶里，达到无限循环不断把小分子透析到底部蒸馏瓶中。另外实验室里比较常见的做法是：利用反滴法分级沉淀，大分子会倾向于凝聚，而小分子一般不会析出，即使析出也会以小颗粒状分散于溶液，一般用反滴法得到的产物在氢核磁共振谱上是看不到小分子的吸收峰的，纯度很高。为了提高透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国美国光谱医学公司生产的各种型号的透析设备，由于使用对流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。选用透析袋需要知道目的物质的分子量，每次处理的样品量，同一批次的平行试验，是否需要保持目的物质的活性来选择，目前国内使用的透析袋主要由上海欧韦达仪器科技有限公司提供，该公司能提供专业的技术指导。普通型透析袋是再生纤维素，英文缩写RC。比如美国viskase的透析袋，再生纤维素是纤维素的一种，再生纤维素主要是指人工化学合成的。煮透析袋时EDTA和NAHCO3的作用是什么?EDTA，二价金属离子螯合剂，除去钙镁等二价离子，防止他们跟目的样品螯合，影响活性NaHCO3，中和乙酸，延长透析袋寿命。2%(W/V)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)煮沸后我直接就透析了，忘了再1mmol/L EDTA(pH 8.0)煮沸了，透析效果会不会不好？没有EDTA煮问题不大。EDTA煮主要是为了除去生产时附在透析袋上的金属离子的。如果你的蛋白对金属不敏感的话，第一次煮过就差不多了。市售透析袋大多都是纤维素成分的，在做透析时容易发生破袋现象。简单的解决方法就是套两层透析袋。这样可以保证在透析所需时间中不会都破袋。即便是含有纤维素酶，这时候它也几乎没有活性。因为样品中还含有其他杂质，再加上不在适宜的反应PH和水解温度下。可能是你透析袋装液时的预留空间不够，应留1/3-1/2空间。硫酸铵分级沉淀蛋白质的原理和方法是什么原理就是溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同，步骤就是不断加硫酸铵以血浆为例：加到盐浓度2030%时纤维蛋白原沉淀，再加到浓度50%时球蛋白沉淀，饱和时清蛋白沉淀 一， 基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。原理就是溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同，步骤就是不断加硫酸铵以血浆为例：加到盐浓度2030%时纤维蛋白原沉淀，再加到浓度50%时球蛋白沉淀，饱和时清蛋白沉淀二， 试剂及仪器1 .组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（ NH 4 ）2 SO 43. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）4.蒸馏水5. PBS( 含 0.2g /L叠氮钠)6.透析袋7.超速离心机8. pH 计9.磁力搅拌器三， 操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% 50% 。（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品20 000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 C ），使蛋白质充分沉淀。（三）透析1.蛋白质溶液 10 000 g 离心 30 min （ 4 C ）。弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。四.应用提示（一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ；2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 C ）；3.3000 g 离心 30 min （ 4 C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；5.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。用于蛋白沉淀的饱和硫酸铵溶液怎么配制？网上说将800g左右的硫酸铵加入到1L水中，然后加热搅拌到大部分固体溶解，趁热过滤，然后室温静置过夜。用硫酸铵分级