肿瘤干细胞培养技术.doc

肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37，5CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分1。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L谷氨酰胺；细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.10.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、转移生长因子(-transforming Growth Factor ,TGF)和叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。(二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以诱导干和祖细胞增生。SCF主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。SCF是一种作用于最早期造血干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。(三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53个氨基酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细胞培养的最常用的添加因子之一。EGF可显著促使细胞分裂、增殖，在一定浓度范围内(520ng/ml),随EGF浓度提高,效应加强。(四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种分子量为16-18kD由146个氨基酸组成的阳离子多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。bFGF具有多种生物学功能，可以促进和调节血管内皮细胞、上皮细胞、和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性的许多种细胞的增殖和分化。二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定和培养。不同组织来源的肿瘤特性不同的，培养条件也不完全相同，本章就已有报道的从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离的肿瘤干细胞的体外培养体系加以阐述，在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同的肿瘤干细胞建立稳定的体外培养条件。(一)白血病干细胞 ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD34+/CD10/CD19)采用悬浮培养体系培养2。ALL急性淋巴细胞白血病患者来源的骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO二甲基亚砜(Manor Park Pharmaceuticals)冻存液将分离得到的MNC在液氮中备用。培养时以5105个/mL密度接种在IMDM无血清培养基中，添加了10g/mL人胰岛素，200g/mL转铁蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。使用时以下两组生长因子任选其一：20ng/mL重组人Fms样酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF和50ng/mL SCF。20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。每周半量换液一次，培养6周后收集细胞用于细胞遗传学和形态学分析。(二)乳腺癌干细胞 乳腺癌干细胞培养多参考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系3，在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长，我们称之为乳腺干细胞球。原代培养时在超低粘附板(Corning)以20000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4g/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂体浸膏。乳腺干细胞球培养710天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na消化10分钟(Invitrogen)，收集细胞到离心管中800rpm离心。离心后得到的细胞需通过40m 滤膜并且在显微镜下观察是否为单个细胞。10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连的团块数量应该在30到150之间，如果细胞团大于100需要重复进行消化和过滤的步骤。外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD44 + / CD24 /low)的培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理，在胶原酶(Roche)和透明质酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37消化2小时后通过30m滤膜后得到单细胞悬液。以1000个/mL无血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、 20ng/mL EGF、5g/mL胰岛素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长，每隔3天使用胰酶EDTA消化2分钟后传代4。乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中分离得到乳腺癌干细胞(CD24 /low /CD44 +)，收集细胞500g离心5分钟,使用Hanks缓冲盐溶液洗涤后以1000个/mL重悬于无酚磺酞的DMEM F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、 5g/mL牛胰岛素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天换液一次5。(三)脑胶质瘤 临床获得的肿瘤标本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除红细胞，在充氧的人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液，总的来说，每份肿瘤标本大概可以获得25106个细胞。肿瘤细胞使用TSM(tumor sphere medium)肿瘤细胞球培养基，添加20 ng/ml重组人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1神经元存活因子NSF(Clonetics)和60g/ml N乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为3 106。原代培养三天后免疫磁珠分选得到CD133+脑胶质瘤干细胞，使用上述细胞培养基培养6。也有学者从临床肿瘤组织获得的单个肿瘤细胞悬液在Neurobasal培养基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。实验中使用的细胞应该在4代之内，分选得到的Nestin+/CD133+细胞即为脑肿瘤干细胞7。大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选的方法得到脑胶质瘤干细胞8, 在100-mm培养盘中(Nunc)使用无血清的DMEM培养，添加了10g/ml牛胰岛素、100g/ml人转铁蛋白、100g/ml BSA、60ng/ml黄体激素、16g/ml四甲烯二胺、40ng/ml亚硒酸钠、63g/ml N乙酰半胱氨酸、5M血小板凝集抑制剂forskolin、50units/ml青霉素、50g/ml链霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。大鼠胶质瘤细胞系9L，无血清NSC增殖培养基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1B27 (Gibco)。每隔两天换液一次。当肿瘤细胞球达到100200个时使用0.1%胰酶和1EDTA (Gibco) 37C消化10分钟。通过25m细胞滤膜(BD Biosciences) 以1000个/ml 密度接种在添加促有丝分裂剂的NSC培养基中每隔两天换液一次，18天后可以进行细胞的传代，培养的细胞球即为具有化疗抵抗和侵袭能力的肿瘤干细胞样细胞9。(四)黑色素瘤 原代培养转移性黑色素瘤细胞，外科手术获得的肿瘤组织在12小时内处理，冲洗肿瘤组织去除表面坏死组织后1 mg/mL IV型胶原酶(Invitrogen ) DMEM中4消化46小时，得到的单细胞悬液用HBSS洗涤后种在非粘附性的培养板中，使用以下两种培养基小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)人胚胎干细胞(hESC)营养液，并且添加4ng/mLbFGF。使用黑色素瘤培养液建立黑色素瘤细胞系由以下成分组成MCDB 153培养基(Sigma)、L15 (Invitrogen)、2% FCS、5g/mL胰岛素(Sigma)、15g/mL牛垂体浸膏(Cambrex)、1.68mmol/L氯化钙和5ng/mL EGF (Sigma)。建立的WM115 and WM239A 黑色素瘤细胞系使用Mel 2%培养液不加垂体浸膏和EGF。在hESC培养基采用有限稀释的方法从原代培养的细胞中培养黑色素瘤细胞10，尽管单个细胞增殖能力有限，两个单个原代培养的细胞经培养可以形成新的肿瘤细胞球，710天后以1000个/mL密度消化传代。黑色素瘤干细胞表面标记为CD20+。分离自小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中CD44+CD133+CD24+肿瘤干细胞在无血清培养基中添加20g/L EGF 、20g/LbFGF和100U/ml青霉素G和100g/ml 链霉素11。(五)结肠癌干细胞 临床结肠癌标本使用机械和酶消化得到单细胞悬液，流式或免疫磁珠分选的CD133+细胞被认为是肿瘤干细胞并使用无血清营养液培养培养12，添加20ng/ml EGF和10 ng/mlFGF-2。为了获得原代培养的肿瘤细胞在酶消化后将细胞种到胶原包被的培养板种营养液为添加了10% FCS的DMEM。(六)前列腺癌干细胞 前列腺癌组织中分离肿瘤干细胞：人前列腺癌组织在征得病人的同意下从40个病人根治性前列腺切除术中获得肿瘤标本。前列腺癌通过组织学检查而确认，有些使用的标本是淋巴结转移灶。从肿瘤组织中分离得到的CD44/21hi/CD133+ (同时也是正常前列腺上皮细胞的标志)细胞并且在四个标本中进行了长期培养一个活组织检查为良性肿瘤。完全角(质)化细胞生长介质培养基 角质化细胞无血清培养基添加EGF和牛垂体浸膏(Invitrogen)，此外还添加了2ng/mL LIF(Sigma)、2ng/mL SCF(Sigma)和100ng/mL霍乱毒素(Sigma) 13。(七)肺癌干细胞 外科手术获得肺癌肿瘤组织块，冲洗去除表面血细胞后置于含有青霉素/链霉素和两性霉素B的DMEMF12中过夜以避免污染。20 mg/ml II型胶原酶(Gibco-Invitrogen) 37消化2小时。得到的细胞在无血清培养基中包括DMEMF12(Gibco-Invitrogen) 中添加50 mg/ml 胰岛素,100 mg/ml转铁蛋白, 10 mg/ml四甲烯二胺，0.03mM亚硒酸钠，2mM 黄体激素，0.6%葡萄糖，5mM HEPES, 0.1%碳酸氢钠，0.4% BSA，谷氨酰胺和抗生素，20 mg/ml EGF和10 mg/ml bFGF。用未经过处理的细胞培养皿降低细胞的贴壁性来支持未分化的肿瘤细胞球的生长14。营养液每周换两次直到形成悬浮细胞球。扩增培养是经过机械地消化细胞球在完全新鲜的培养液中传代单个活小的聚集物。CD133为肺癌干细胞标记。(八)卵巢癌 小鼠乳腺癌细胞系MOVCAR 7和4306在含有4% FBS (MIS-free) DMEM 并添加了L-谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素，1%胰岛素转铁蛋白硒ITS(GIBCO)37C, 5% CO2, 在T175培养瓶中培养15。临床标本去除红细胞后，10% FBS RPMI ，1%青霉素/链霉素和1% 两性霉素。(九)肝癌干细胞 人肝癌细胞系HuH7 细胞系中分选得到的SP细胞使用无血清培养基DMEM/Hams F-12 (Invitrogen)中，作者16尝试了添加干细胞因子SCF(Chemicon), 血小板衍生的生长因PDGF(Pepro Tech),碱性成纤维生长因子bFGF(R&D Systems)和白血病抑制因子LIF(Chemicon)，最终确立了添加 20ng/ml 重组人LIF, 可以有效的培养HuH7细胞系中的肿瘤干细胞。(十)鼻咽癌干细胞 人鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE2等分选SP细胞即为鼻咽癌细胞干细胞，将分选后的细鼻咽癌干细胞ultraMEM培养基(cambrex)添加5FBS，10ng/ml bFGF(sigma) 和10ng/ml EGF(sigma) 1mmol/L L谷氨酰胺(sigma)50U/ml 青霉素G和50g/ml链霉素17。干细胞培养最初用饲养层细胞培养，其缺点为操作复杂，有多种交叉污染的风险，目前较少采用。实际上饲养层细胞培养发挥着关键作用的是饲养层细胞分泌多种细胞因子，因此，使用无血清培养基中添加一定量的LIF、EGF、bFGF等细胞因子完全可以取代饲养层细胞, 抑制干细胞分化并维持其增殖。但是，由于干细胞在体外培养过程中存在自发分化趋势，通常认为干细胞包括胚胎、骨髓血、脐带血干细胞以及肿瘤干细胞只能做短期培养，从而限制了干细胞的扩增和研究。Akio Soeda18等从临床脑肿瘤组织中原代培养并建立了一个脑肿瘤干细胞系，脑肿瘤细胞在有血清培养基中贴壁单层培养后换无血清培养基仍可以形成新的细胞球并且移植到免疫缺陷鼠中有致瘤能力。重新形成的细胞球保持了干细胞特性，而且从中分离得到的单个肿瘤干细胞可以形成新的细胞球和肿瘤甚至可以在体外长期培养超过2年时间。这说明了肿瘤干细胞中有部分细胞在非贴壁或贴壁条件下传代多次后仍然保持了干细胞的特性。胰腺癌、食管癌、头颈部皮肤癌中肿瘤干细胞也已经分离和鉴定但是到目前为止还未见有体外培养的报道。因此，如何建立稳定的干细胞的体外培养条件，防止肿瘤干细胞的分化仍然是一个急需解决的问题。(江苏大学 徐学静，钱晖)参考文献：1 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