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计划类别应用基础研究计划指南代码H0905苏州市科技计划项目 计划类别应用基础研究计划指南代码H0905苏州市科技计划项目申报书（应用基础研究）项目名称阿立哌唑降低帕利哌酮所致高催乳素水平的动物模型分子机制研究承担单位苏州市广济医院应用单位苏州市广济医院单位地址苏州市广济路286号邮编215008项目负责人王培培电管部门市卫生局申报日期xx年5月18日苏州市科学技术局二一五年制科技计划项目申报书编写提纲 一、立项依据1本项目国内外科技创新发展概况和最新发展趋势；精神分裂症在一般人群中的患病率约为1%，是一种慢性、高致残性的精神障碍疾病。 目前，抗精神病药物治疗仍然是主要的防治手段，但长期使用将会出现锥体外系反应、肝肾功能损害、催乳素水平升高等不良反应。 帕利哌酮（Paliperidone,PAL）是一种新型抗精神病药物，因其疗效确切1，且锥体外系反应轻、肝毒性小2受到广泛的应用。 尽管PAL疗效卓越，不容忽视的是，作为利培酮的活性代谢产物，PAL可拮抗垂体泌乳细胞的多巴胺D2受体，显著增高催乳素（Prolactin,PRL）水平3。 高催乳素血症（Hyperprolactinemia,HPRL）是继PRL价格因素4之后的导致患者中断药物治疗的重要因素。 阿立哌唑（Aripiprazole,ARI）与PAL同为非典型抗精神病药物，与PAL不同的是，ARI为多巴胺受体的部分激动剂5在中脑-边缘通路，多巴胺（Dopamine,DA）浓度高，ARI有功能性拮抗作用，可改善精神分裂症的阳性症状；而在中脑-皮质通路，DA浓度低，ARI则显示功能性激动作用，可减轻阴性症状；在黒质-纹状体通路，ARI不完全阻断该通路，很少引起锥体外系反应；同样，ARI不完全阻断结节-漏斗通路，很少引起PRL升高。 xx年，美国学者研究发现6，垂体多巴胺D2受体主要有三条信号通路（图1）-抑制蛋白/糖原合成激酶-3途径（-arrestin）；百日咳毒素不敏感的G z蛋白途径（Pertussis toxin-insensitive G z pathway;Pertussis toxin,PTX）；百日咳毒素敏感的G i/o蛋白途径（PTX-sensitive G i/o pathway）。 激动以上三条信号通路均可抑制PRL的释放，但-arrestin通路和G z-蛋白通路的机制尚不明了。 G z-蛋白和G i/o-蛋白可抑制腺苷酸环化酶（Adenylyl cyclase,AC），使cAMP生成减少；而cAMP是合成和释放PRL的第二信使，此外也可通过激动电压门控Ca2+通道，引起钙内流，从而导致胞外PRL的释放。 Gz-蛋白和G i/o-蛋白抑制AC，从而减少胞外PRL分泌。 此外，Gi/o-二聚体可调控K+通道和Ca2+通道，抑制Ca2+内流，从而抑制PRL的释放。 精神分裂症的发生与脑内的DA和5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine,5-HT）水平密切相关。 抗精神病药物常通过影响体内的DA受体和5-HT受体发挥治疗作用，而多巴胺D2受体的阻断，可引起PRL脱抑制释放，这是抗精神病药物诱导HPRL的重要原因。 最新研究发现7，PAL诱导HPRL的发生与多巴胺D2受体信号通路密切相关，但现有研究仅揭示了PAL或ARI对PRL影响的部分机制，对于ARI如何降低PAL诱导的高催乳素水平以及ARI、PAL和DA之间的相互影响及其作用机制，国内外尚缺乏相关研究资料。 图1垂体多巴胺D2受体的多条信号通路（“”表示激动因素，“”表示抑制因素）参考资料1Turkoz I.,Bossie C.A,Dirks B.,et al.Direct andindirect effectsof paliperidoneextended-release tabletson negativesymptoms ofschizophrenia.Neuropsychiatr DisTreat.xx;4 (5):949-958.2Paulzen M.,Orfanos S.,Grnder G.Remission ofdrug inducedhepatitis afterswitching fromrisperidone topaliperidone.Am JPsychiatry.xx;167 (3):351-352.3Melkersson,K.I.Prolactin elevationof theantipsychotic risperidoneis predominantlyrelated toits9-hydroxy metabolite.Hum Psychopharmacol.xx;21 (8):529-532.4Citrome L.,Kamat S.A,Sapin C.,et al.Cost-effectiveness ofaripiprazole once-monthly paredwith paliperidonepalmitate once-monthly injectablefor thetreatment ofschizophrenia inthe UnitedStates.J MedEcon.xx;17 (8):567-576.5Paul EK.J.,Susan LM.Aripirazole:a partialdopamine D2receptor agonistantipsychotic.Expert Opin.Investig.Drugs.xx;12 (4):655-662.6Gonzalez-Iglesias A.E,Murano T.,Li S.,et al.Dopamine inhibitsbasal prolactinrelease in pituitary lactotrophsthrough pertussistoxin-sensitive and-insensitive signaling pathways.Endocrinology.xx;149 (4):1470-1479.7Kucka M.,Tomic M.,Bjelobaba I.,et al.Paliperidone andaripiprazole differentiallyaffect thestrength ofcalcium-secretion couplingin femalepituitary lactotrophs.Sci rep.xx;5:8902.2本项目的研究的目的、意义（突出说明对科技、经济与社会发展的作用）;本项目拟通过分子机制的研究揭示ARI降低PAL诱导的高催乳素水平以及ARI、PAL和DA之间的相互影响及其作用机制。 为进一步阐明抗精神病药物对多巴胺D2受体的其他信号通路的影响奠定基础，也为研究ARI对其他抗精神病药物所致HPRL的作用提供参考。 3本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况。 本项目尚处于规划研究阶段，前期有一定的临床基础和研究方法的积累，但尚缺乏系统的组织研究。 目前，尚无相关知识产权。 二、研究内容1具体研究开发内容和要解决的关键技术问题；建立PAL诱导的高催乳素水平的动物模型；垂体细胞原代培养和灌流培养；PRL和cAMP水平的测定以及Ca2+信号的实时监测。 2项目的特色和创新之处；首次对ARI降低PAL诱导的高催乳素水平的分子机制进行研究，阐明ARI、PAL和DA之间的相互影响及其作用机制。 首次建立适合精神科研究的药物诱导高催乳素水平的动物模型。 3要达到的主要技术、经济指标及社会、经济效益。 主要技术动物模型的建立；垂体细胞原代培养和灌流培养技术；PRL和cAMP水平的测定以及Ca2+信号的实时监测技术。 社会、经济效益揭示ARI降低PAL诱导的高催乳素水平以及ARI、PAL和DA之间的相互影响及其作用机制。 为进一步阐明抗精神病药物对多巴胺D2受体的其他信号通路的影响奠定基础，也为研究ARI对其他抗精神病药物所致HPRL的作用提供参考。 三、研究试验方法、技术路线以及工艺流程1.PAL诱导的高催乳素水平的动物模型的建立（in vivo）取二月龄雌性SD鼠，以0.10mg/d的剂量灌胃给予PAL，一段时间后（参照预试结果）测定PRL水平以建立动物模型。 筛选成功建立模型的大鼠，以0.4mg/d的剂量灌胃给予ARI，分别于给药30min、1h、2h、4h、8h测定血清中的PRL水平（以模型鼠为对照）。 2.垂体细胞多巴胺D2受体信号通路的机制研究（in vitro）原代细胞培养取雌性SD鼠的脑垂体，分离垂体前叶的腺垂体细胞进行培养（培养基M199+Earles salts,10%马血清,0.1%BSA,青霉素，链霉素）。 灌流试验将腺垂体细胞与预处理的Cytodex-1微载体8共培养24h。 次日，将结合了腺垂体细胞的微载体转移至37预热的生物反应器中（图2），以温HEPES（+M199+0.1%BSA、青霉素、链霉素）持续灌流培养。 实验前，以0.5ml/min速度灌流2h以达稳态平衡。 腺垂体细胞+Cytodex-1微载体转移至生物反应器灌流培养培养24h温HEPES0.5ml/min,2h成年雌性SD鼠CO2窒息死亡断头，取脑垂体分离腺垂体切割（1*1*1mm）消化，分散培养图2Super-Spinner改装的持续灌流培养系统9加样处理在持续灌流下，将药物按实验设计方案加入培养液中（图3），PAL、ARI的加样量初步拟用1M（以文献9为依据），收集灌流流出液，储存于-20，待测。 图3灌流试验加样处理流程图cAMP的检测在cAMP检测实验中，需在培养液中加入非特异性的cAMP和cGMP磷酸二酯酶抑制剂（1mM IBMX），并以三乙胺、乙酸酐（2:1）乙基化样品（10l/0.5ml样品），处理后的样品储存于-20，待测。 PRL的检测检验方法采用荧光磁微粒酶免法（苏州广济医院检验科），仪器为日本东曹Control ControlPAL PALARI ARI ARI PAL PAL+ARI PALControl ControlPALPALARIARIARI PALPAL+ARI PALNo DA1M DAPerifusion experiment50min100min株式会社生产的全自动酶免疫测定仪AIA2000。 Ca2+信号检测参照Arturo E等10的方法，对Ca2+信号进行检测。 将垂体泌乳细胞与多聚赖氨酸预处理载玻片于Krebs-Ringer培养基中共培养，加药孵育1h后，于荧光倒置显微镜下检测钙信号（激发波长340nm、380nm；发射波长520nm）。 钙信号的改变以F340/F380表示。 参考文献8Trabelsi K.,Majoul S.,Rourou S.,et al.Development ofa measlesvaine productionprocess inMRC-5cells grownon Cytodex1microcarriers andin astirred bioreactor.Appl MicrobiolBiotechnol.xx;93 (3):1031-1040.9陈昭烈,Iding K.,Ltkemeyer D.,Lehmann J.用改装的Super-Spinner搅拌瓶连续灌流培养产凝血酶原CHO工程细胞.生物工程学报.xx;17 (1):109-112.10Gonzalez-Iglesias A.E,Yonghua J.,Tomic M.,et al.Dependence ofelectrical activityand calciuminflux-controlled prolactinrelease onadenylyl cyclasesignalingpathwayinpituitarylactotrophs.Mol Endocrinol.xx;20 (9):2231-2246. 四、工作基础和条件1承担单位概况（人员、资产、业务与管理状况），拥有知识产权状况（包括本项目已有知识产权状况）；课题承担单位苏州市广济医院，是国内最早建立的专科精神病院之一，系我省规模较大的三级精神病专科医院，现为苏州大学附属广济医院。 医院实际开放床位近800张，病源丰富。 医院近5年承担国家级（子课题）、省级市级课题近20项目，有丰富的科研管理和协调组织能力。 目前医院拥有开展本研究的大型仪器设备包括高效低温离心机、ABI基因测序仪、全自动高压灭菌器、凝胶成像仪（伯乐）、电泳仪（伯乐）、PCR仪、紫外可见光度计等，具备该课题的实验室基础设备。 同时医院已自建实验动物房。 此外，医院属于苏州大学附属医院，可利用苏州大学相关研究所/室的仪器设备，并可得到一流专家的科研指导。 如果课题获得资助，医院将给予不少于1:1的经费配套，同时在人力、物力上给予大力支持，保证课题的顺利实施。 2本项目现有的研究工作基础（包括与本项目研究有关的主要论文、专著情况，小试或中试成果情况，现有装备条件等）;本课题研究组已查阅国内外相关文献几十篇，对抗精神病药物导致高催乳素血症的临床研究现状和多巴胺D2受体影响PRL分泌的信号通路及最新研究进展进行了充分的学习与研究，有可靠的理论基础，并掌握了最新研究动态。 目前我院分子生物实验室具有的设备基因测序仪（Life Technologies，Ion torrent）、电泳仪（Bio-Rad,Mini ProteanTetra微型垂直电泳槽，Mini SubCellGT微型水平电泳槽）、凝胶成像仪（Bio-Rad,GEL DOCXR）以及全自动高压灭菌器、PCR仪（Eppendorf,Mastercycler pro）、AIA2000全自动酶免疫测定仪（日本东曹株式会社）、-80冰箱（Thermo，Hfu586/510L）、小型离心机、高效低温离心机、紫外可见光度计、Agilent HPLC等设备。 同时，我院属于苏州大学附属医院，可利用苏州大学相关研究所/室的仪器设备，并可得到一流专家的科研指导。 3项目负责人的主要学历、工作简历，在国内外学术组织、刊物及国际性学术会议任职情况（列表，如任职、邀请报告等）；主要负责人课题负责人一王培培，硕士研究生学历，xx年毕业于山东大学药学院，同年8月就职于苏州市广济医院药剂科。 课题负责人二姚树永，高级职称，现任苏州市广济医院药剂科主任；药学本科，xx年毕业于苏州大学药学系。 论文发表Pei-pei W.,Guo-wei Z.,Wen X.,et al.A newflavonol C-glycoside anda rarebioactive lignanamidefrom Piperwallichii Miq.Hand.-Mazz.Chin JNat Med.xx;12 (5):377-381.Ping C.,Pei-pei W.,Ze-zhao J.,et al.Sesquiterpenoids fromthe fruitsof Alpiniaoxyphylla andtheir anti-acetylcholinesterase activity.Helvetica ChimicaActa,xx;doi:10.1002/chin.xx35206.Ping C.,Pei-pei W.,Guo-hua S.,et al.Acetylcholinesterase inhibitoryactivities of48traditional Chinesemedicinal herbs.J PharmSci.xx;1:106-109.Ping C.,Lei Q.,Li T.,Pei-pei W.,et al.Two halogenatedsesquiterpenoids fromthe fruitsof Alpiniaoxyphylla.Helvetica ChimicaActa.xx;96 (6):1163-1167.姚树永.精神病院门诊患者苯二氮卓类药物的使用分析.中国药物经济学.xx;4:7-10.姚树永.精神专科医院住院患者镇静催眠药应用时点的调查分析.当代医学.xx;19 (30):77-78.4项目负责人以往承担国家、省级等各类科技计划项目完成情况（立项年度、项目编号、项目名称、计划类别、完成时间、完成效果）及科技奖励、已获专利情况；项目负责人王培培主要曾参与国家自然科学基金项目“马齿苋酰胺生物碱标准化提取物和马齿苋酰胺E体内抗老年性痴呆活性研究”（NO.81073005，xx.1-xx.12）和山东省中青年科学家奖励基金项目“马齿苋酰生物碱标准化提取物及马齿苋酰胺E抗老年性痴呆活性研究”（BSxxYY032，xx.10-xx.10），申请专利一篇“马齿苋酰胺E在制备抗老年痴呆神经退行性疾病药物中的应用”（申请号xx10184208），发表优秀毕业论文“马齿苋酰胺生物碱标准化提取物和马齿苋酰胺E抗老年性痴呆活性研究”以及论文若干。 此外，曾参与山东大学自主创新基金自然科学专项和山东大学自由探索项目，指导4名山东大学临床药学本科生参与暑期实践项目以及本科毕业论文的设计和研究。 项目负责人姚树永，主要曾参与课题“精神分裂症高危阶段、首发和慢性期的事件相关电位P300的研究”（KJXWxx032,SYSDxx124）；另现有课题“多巴胺D2受体TaqIA和A-241多态性与利培酮治疗精神分裂症所致高催乳素血症的关联研究”正在积极研究中。 5项目实施具备的人才队伍、经费配套投入能力及科技服务管理能力；课题研究组人员配备合理，含高级职称3名，中级职称2名，初级职称1名，课题成员大多具有研究生学历。 课题负责人具有丰富课题开展及研究经验，对神经精神药理研究具有良好的基础；课题指导者为硕士生导师，带领3名在读研究生参与本课题，对动物实验、动物行为观察具有丰富的研究经验。 医院相关配套经费投入及时，具有良好科技服务管理能力。 为保证课题顺利实施，特请医院科教科科长杜向东教授为课题指导。 杜向东，男，副主任医师、副教授、硕士生导师，苏州市姑苏卫生重点人才，现为苏州大学附属广济医院科教科科长、司法鉴定科科长，医院省级重点专科、市级重点学科负责人之一。 现为中华医学会心身医学分会委员、中国睡眠研究会青年委员、中国睡眠研究会睡眠与心理专业委员、江苏省医学会心身行为分会委员、江苏省医学会精神病学分会青年委员、江苏省心理卫生协会理事、苏州市司法鉴定协会理事。 获江苏省医学新技术引进二等奖1项，苏州市医学新技术引进奖2项。 近五年承担省市级科研项目6项。 6本项目实施可能对环境的影响及预防治理方案。 本项目在实施过程中可能会产生一定的生物和化学废物，本课题组成员承诺将严格按照医院和苏州大学的相关管理规定执行，杜绝对环境产生不良影响。 五、研究工作的预期成果、成果递交方式及专利生产情况；项目成果具体应用情况。 五、研究工作的预期成果、成果递交方式及专利生产情况；项目成果具体应用情况。 通过机制探索研究，揭示ARI降低PAL诱导的HPRL的作用机制。 本课题主要以论文发表为成果上报，计划发表核心期刊论文2-3篇。 六、计划进度安排与考核指标工作进度（按半年度分）主要工作内容xx年7月至xx年12月初步建立模型（预试阶段）xx年1月至xx年6月完成动物模型的建立xx年7月至xx年12月在建模基础上按实验规划进行试验并进行数据的统计分析xx年1月至xx年12月完成细胞分子机制研究并进行统计分析2018年1月至2018年6月撰写论文项目完成后主要考核指标包括1.项目技术考核指标；2.项目的成果（知识产权、小试、样品、论文等）；3.项目的社会效益