（ppt）用实时荧光定量pcr检测石蜡标本中的麻风菌dna以提高课件

用实时荧光定量PCR检测石蜡标本中的麻风菌DNA以提高PB患者的确诊水平 温艳 1杨荣德2谭福跃2邢燕1袁联朝1李桓英11首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所1000502云南省文山州皮肤病防治所663000 1873 麻风病是由感染麻风杆菌造成的慢性传染病 挪威A Hansen 从病人组织中发现麻风菌1943 氨苯砜类药物用于麻风病的治疗1958 WHO成立了麻风防治机构 全球麻风病控制工作统一计划1981 WHO推荐联合化疗方案 麻风病 麻风菌在人体感染的过程 卜 亚临床感染 无临床症状 自我痊愈 过程 MB PB LL BL BB BT TT 亚临床阶段中间发展过程临床变化分型 目前麻风已经不再是一种灾难 1985年 122个国家中520万人感染此病 1991年WHO提出 到2000年消除麻风作为一个公共卫生问题 指标为 1 10000 世界范围总数少于6000000个病例 2005年 全球麻风病人降到3000000 目前 2000000病人 这主要归功于1980年推广的MDT联合化疗 存在问题全球麻风病每年病人数徘徊不变 在过去的8年 非洲 美洲和亚洲每年超过200000病人 提示 麻风病的传播没有阻断 主要障碍是在哪里发生和如何传播的信息不清楚 不能有效的早期诊断病人 麻风流行现状 麻风病早期诊断的实验室技术平台 研究背景 麻风病诊断 病理组织检查和抗酸染色结合临床检查 病理学检查包括病原学检查抗酸菌 AFB 组织中病理变化 然而常规病理学检查 HE 存在特异性 敏感性不足 特别是对查菌阴性 病理表现为非特异性改变的患者 PCR技术用于皮损活检和组织液的检测 可检出新鲜未固定组织标本中的微量麻风菌DNA 对早期和疑难病例的诊断有潜在优势 研究背景 本实验室已经建立了NestedPCR和realtimePCR方法 YanWen XingYan YuanLian Chao RongDeYang FuYueTan YingZhangandLiHuan Ying ApplicationofRLEPRealTimePCRfordetectionofM lepraeDNAinParaffin embeddedSkipBiopsySpecimensforDiagnosisofPaucibacillaryleprsy Am J Trop Med Hyg 90 3 2014 524 529YanWen XingYan YuanLian Chao LiuJian YingZhangandLiHuan Ying Whole BloodNested PCRAmplificationofM leprae SpecificDNAforEarlyDiagnosisofLeprosy Am J Trop Med Hyg 88 5 2013 918 922杨荣德 谭福跃 邢燕 刘健 温艳 李桓英 实时荧光定量PCR检测石蜡标本中麻风菌DNA中国麻风皮肤病杂志2013 29 7 目的 将realtimePCR方法应用于临床初步诊断PB麻风病患者的石蜡标本 为形态学和临床的麻风病诊断提供参考依据 检测早期和疑似麻风病例 提高对早期麻风的诊断水平 研究对象 MDT治疗前后的皮损组织石蜡包埋标本92例 BL型麻风患者石蜡标本2008年和2013年分别为7例和8例 共15例 2012年以来陆续收集70例临床诊断PB麻风病患者的石蜡包埋组织标本 DNA提取 石蜡包埋组织标本的DNA提取 切厚度为8 10 m的石蜡组织10片 放入1 5ml离心管中 为了防止标本之间的交叉污染 在切不同的石蜡组织时 先用1摩尔的氢氧化钠 再用75 酒精擦洗切片刀 提取DNA的过程严格按照DNeasyBlood Tissuekit试剂盒 QIAGEN Cat NO 69504 操作手册进行 脱蜡选用DeparaffinizationSolution试剂盒 QIAGEN Cat NO 19093 建立realtimePCR 使用Taqman探针通用PCR试剂盒 ABI P N4304437 PCR循环条件为95 变性15秒 60 退火 延伸60秒 共40个循环 之前包括50 2分钟和95 变性10分钟 在ABI Prismer7500型荧光定量PCR仪 AppliedBiosystems公司 上进行实时观测以及数据的采集与分析 扩增片段长度为101bp RealtimePCR结果判定标准 标准曲线及每个检测标本均做复孔 初步确定取15 Ct 35作为阴阳性分析结果界定值 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 结果 theRLEPreal timePCR标准曲线 Tento107copiesoftheplasmidDNAwereusedforstandardcurvepreparationCt 3 44log 36 65 R2 0 9995 AmplificationCurve A 107copies lplasmid B 106copies lplasmid C 105copies lplasmid D 104copies lplasmid E 103copies lplasmid F 102copies lplasmid G 10copies lplasmid 检测结果 已确诊的麻风病患者石蜡标本realtimePCR 检测结果 临床初步诊断PB和I型麻风病石蜡包埋组织标本 讨论 本研究对70例临床初步诊断PB和未定类麻风病患者的石蜡标本采用realtimePCR检测 阳性率为71 4 50 70 病理检测阳性率为51 4 36 70 两者有显著性差异 p 0 05 BT和TT患者中查菌阴性的和未定类患者realtimePCR检测阳性率均达66 7 而病理检测阳性率分别为60 22 2 和44 4 显然对查菌阴性患者的辅助诊断价值较高 国外报告了60 70 的显微镜检AFB阴性的标本PCR结果阳性 本试验得到了相似的结果 RealtimePCR使用RLEP引物扩增的101bp片段快速 特异 灵敏 标本便于运输 方法稳定 重复性强 既可以在有条件的实验室推广 也可以通过标本