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实验原理与方法蔬菜生理与生态实验室南京农业大学园艺学院二零零九年十月目 录1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定愈创木酚法3、CAT(过氧化氢酶)测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:6、O2-产生速率的测定7、过氧化氢(H2O2)含量的测定碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定10、谷胱甘肽还原酶测定11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3/5RACE 扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）47一 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）【实验原理】SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 甲硫氨酸4. EDTA-Na25. 核黄素6. 氮蓝四唑(NBT)7. 陶瓷小研钵8. 4-5ml 离心管9. 10ml 玻璃试管（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。4. 60M核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。【实验步骤】1. 酶液提取 称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和40l（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和40l PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和40l PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25下反应20min；（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560）3. 计算结果已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活单位（U），按下式计算活性n=(ODmax-OD560)/ODmax/2SOD总活性 ( Ack-AE )V/（1/2AckWVt） SOD比活力SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。【注意事项】1. 酶液提取须在4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4. 加反应液时最好在暗光下进行；5. 核黄素产生O2.，NBT还原为篮甲潛都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40molm-2s-1，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase. Improved assays and an assay applicable to acrylamide gel. Anal Biochem, 1971, 44: 276-287. Zhou W, Zhao D, Lin X. Effects of water logging on nitrogen accumulation and alleviation of waterlogging damage by application of nitrogen fertilizer and mixtalol in winter rape (Brassica napes L.). J. Plant Growth Regul, 1997,16, 47-53. 二 愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定-愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 2-甲氧基酚4. 30H2O25. 陶瓷小研钵6. 2ml 离心管（三）试剂1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100ml PBS(0.2M，pH6.0)；【实验步骤】1. 酶液提取 称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。2. 酶活性测定（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28l愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后加入19l30的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40l酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，3. 计算结果以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性POD活性=（A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g FW)A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L. Muoz-Muoz, F. Garca-Molina, P.A. Garca-Ruiz, E. Arribas, J. Tudela, F. Garca-Cnovas, J.N. Rodrguez-Lpez, Enzymatic and chemical oxidation of trihydroxylated phenols, Food Chemistry,Volume 113, Issue 2,15 March 2009, Pages 435-444F. Quintanilla-Guerrero, M.A. Duarte-Vzquez, B.E. Garca-Almendarez, R. Tinoco, R. Vazquez-Duhalt, C. Regalado, Polyethylene glycol improves phenol removal by immobilized turnip peroxidase,Bioresource Technology, Volume 99, Issue 18, December 2008, Pages 8605-8611三 CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料植物叶片等植物材料（三）试剂1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸馏水定容至500ml。2 0.3H2O2: 吸取0.5ml 30的H2O2，用PBS (pH7.0)定容至50ml。【实验步骤】1. 酶液提取 称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清夜即为CAT粗提液。2 酶活性测定（1）反应混合液的配制：取100ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.1546ml 30%的H2O2摇匀即可。（2）取2.9 ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。3 结果计算：酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=A240Vt /（WVs0.01t） (u/g FW)A240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。【注意事项】H2O2易分解，应现用现配。【参考文献】Aebi H (1984) Catalase in vitro. In: Packer L (ed) Methods in enzymology. Orlando, FL: Academic Press, pp 121126四 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定【实验原理】AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)cm（2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用mol AsAg/FWh 表示。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. EDTA-Na24. 抗坏血酸5. 30% H2O26. 陶瓷小研钵7. 2ml 离心管（三）试剂（按50个样计算）：1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去离子水定容到400ml。2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24 g/M0.1mM500ml=0.01861 g）；3. 5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去离子水稀释到100ml。【实验步骤】1. 酶液提取方法同SOD.2. 酶活性的测定（以2 ml体系测定）（1）（以2 ml体系测定）取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20下测定OD290值在40s内的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性（室温下测定，以不加H2O2为空白对照调零）。（2）若以3 ml体系测定，则取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20下测定OD290值在40s内的变化3. 酶活性计算以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g(FW)表示APX活性（u/g）= A290.VT/0.01VS.t.WA290表示在290nm处吸光值的变化VT 提取液总体积；VS 酶液的体积；W 叶片的鲜重 ；t 反应时间【注意事项】加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。【参考文献】Nakano Y, Asada K. 1981.Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867-880五 GR（谷胱甘肽还原酶）的测定【实验原理】【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 叶片或根系2. GSSG3. NADPH4. Hepes（三）试剂1. Hepes缓冲液 (PH7.8)：称取Hepes 1.9155g,用蒸馏水定容至200ml2. 10mM GSSG：称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸馏水中3. 2.4mM NADPH：称取4mgNADPH溶于2ml蒸馏水中【实验步骤】1. 酶液提取 称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为GR粗提液。2. GR测定 取样品上清液0.1ml（3次重复），放入试管中，加入Hepes1700ul，NADPH 100ul及其GSSG100ul在OD340下测定。【注意事项】1. 酶液提取须在4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。【参考文献】Hong Zhu, Zhuoxiao Cao, Li Zhang, Michael A. Trush, Yunbo Li(2007) Glutathione and glutathione-linked enzymes in normal human aortic smooth muscle cells: chemical inducibility and protection against reactive oxygen and nitrogen species-induced injury. Mol Cell Biochem 301:4759.Wheeler CR, Salzman JA, Elsayed NM, Omaye ST, Korte DW (1990) Automated assays for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase activity. Anal Biochem 184:193199.六 O2-产生速率的测定【实验原理】O2-与羟胺反应产生NO2，NO2在对氨基苯磺酸和-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2-的含量。【仪器、材料与试剂】（一）仪器 1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 叶片或根系2. 磷酸氢二钠3. 磷酸二氢钠4. 盐酸羟胺5. 对氨基苯磺酸6. -萘胺7. 冰醋酸（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。2. 10mM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。3. 17mM对氨基苯磺酸：称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml4. 7mM a-萘胺：称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。【实验步骤】1. 酶液提取 称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为酶-粗提液。2. O2-产生速率测定（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；（2）在25下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl；（3）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM-萘胺，混合后涡旋；（4）在25下保温20min后在3000g离心3min；（5）以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。3. 计算结果根据测得的OD530，查NO2-标准曲线得到NO2-，依照羟胺与O2-的反应式：NH2OH2O2-H+NO2-H2O2 H2O 计算O2-，即NO2-2=O2-。再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2-产生速率（nmol min-1mg-1蛋白，也可用nmol min-1g-1鲜重）。【注意事项】1. 样品中若含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，再加入对氨基苯磺酸和-萘胺作NO2-的显色反应；2. 应用羟胺反应来检测生物材料的含量，必须严格控制反应系统的pH（8.0，并尽可能降低反应液中的溶解氧和Fe的含量。因为羟胺自动氧化随反应系统的pH值升高而加强，同时随反应液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。【参考文献】Desen Ke, Guchou Sun, Zhengxun Wang (2007) Effects of superoxide radicals on ACC synthase activity in chilling-stressed etiolated mungbean seedlings. Plant Growth Regul 51:8391.Wang AG, Luo GH (1990) Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants. Plant Physiol Commun 6:5557.七 碘化钾分光光度法测定过氧化氢（H2O2）的含量【实验原理】过氧化氢(H2O2)既是一种较强氧化剂，又是一种较弱还原剂。它存在范围广，化学性质活泼，对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。过氧化氢可以与碘化钾发生反应：H2O22KII22KOHI2通常以I3-的形式存在于水溶液中。利用I3-在352nm有吸收峰这一原理，用分光光度法测定过氧化氢，方法快速简便，干扰少，仪器普及。【仪器、材料与试剂】（一） 仪器1. 分光光度计2. 台式离心机3电子天平（二）材料1. 三氯乙酸2. 酒石酸3. 碘化钾4. 过氧化氢（30）51ml移液枪6陶瓷小研钵72ml 离心管8100ml容量瓶（三）试剂1. 0.1% TCA：称取0.1g三氯乙酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。2. 2%酒石酸溶液：称取2g酒石酸，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。3. 2.5%碘化钾溶液：称取2.5g碘化钾，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。4. 过氧化氢标准溶液：取含H2O2的30标准品过氧化氢3ml，稀释至1000ml，用高锰酸钾标定，再分别稀释成100、10、1及0.1mg/l的过氧化氢标准溶液。【实验步骤】1取1g植物样品，加入0.5mL的0.1% TCA，在液氮下研磨，研磨后所得匀浆以19000g离心20min。2. 取上清液0.5mL，加2ml 1M KI溶液和0.5ml 100mM硫酸钾的缓冲液，暗反应1h；3反应结束后，以0.1%的TCA为参比，测定在390nm处的吸光值；4标准曲线绘制：分别取浓度为10.00mg/1的H2O2使用液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml于100ml容量瓶中，分别加入2ml 2%酒石酸溶液，2ml lM硫酸溶液，2ml 2.5%碘化钾溶液，用蒸馏水定容后，以试剂空白为参比于352nm处，用1cm比色皿测定吸光度A，作A H2O2浓度(mg/1)曲线。5通过已知浓度的过氧化氢标准曲线，计算样品中过氧化氢的含量。【注意事项】pH值对吸光度有一定的影响，pH26时吸光度最大且稳定，故实验采用酸度条件为pH26。【参考文献】Chakrabarty D. and Datta S. KMicropropagation of gerbera:lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities during acclimatization processPhysiol Plant,2008,(30):325331八 丙二醛（MDA）含量的测定【实验原理】MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 三氯乙酸4. 硫代巴比妥酸5. 陶瓷小研钵6.10ml 离心管（三）试剂1 5%的三氯乙酸（TCA）溶液：称取5g三氯乙酸用少量蒸馏水溶解后定容于100ml容量瓶中；2. 0.67%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.67g硫代巴比妥酸用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100ml容量瓶中。【实验步骤】1. 取0.5g样品（叶片或根系）剪碎放入研钵中，加入5ml 5%TCA溶液研磨成匀浆后转入离心管中在3000r/min下离心20min；2. 取上清液2ml于离心管中，加入等体积的0.67%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100沸水浴中煮30min，用冷水迅速冷却后在3000 r/min下离心10min；3. 取上清液在450nm、532nm、600nm下测OD值（用去离子水调零）；4. 计算组织中MDA含量：MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/g FW)=CV/W式中V为提取液体积(1.8ml)，W为样品鲜重(0.5g)。【注意事项】煮沸后要再进行一次离心【参考文献】Kumar G N M, Knowles N R. Changes in lipid peroxidation and lipolytic and free-radical scavenging enzyme activities during aging and sprouting of potato (Solanum tuberosum) seed-tubers. Plant Physiol, 1993, 102: 115124 九 还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定【实验原理】抗坏血酸又名维生素C，以两种形式存在于植物中，即还原型抗坏血酸(Ascorbic acid ，AA)和脱氢型抗坏血酸(Dehydroascorbic acid，DHA)。这两种形式可通过氧化还原而互变，因而都具有生理活性。抗坏血酸可以将金属离子还原，使之产生稳定的有色溶液。最通用的是抗坏血酸将Fe3还原成Fe2，加入螯和剂后，Fe2即显色，在络和物最大吸光处测定吸光度，其吸光值同抗坏血酸的浓度成正比。该法可以同时测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，脱氢抗坏血酸用二硫苏糖醇还原成抗坏血酸，通过还原前后吸光值的差值对两种物质定量。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机3电子天平（二）材料1. 偏磷酸2磷酸氢二钠3磷酸二氢钠4. 三氯乙酸5正磷酸6红菲罗啉7氯化铁81ml移液枪9陶瓷小研钵102ml 离心管115ml、100ml、1000ml容量瓶（三）试剂1. 5%的偏磷酸：称取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml容量瓶中。2 150mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。3. 10% TCA：称取0.5g三氯乙酸，用蒸馏水定容于5ml容量瓶中。444%正磷酸：称取2.2g偏磷酸（H3PO4），用蒸馏水定容于5ml容量瓶中。50.5%BP-乙醇：称取1.5g红菲罗啉（BP），用无水乙醇定容于5ml容量瓶中。60.3%FeCl3：98L称取0.3g氯化铁，用蒸馏水定容于100ml容量瓶中。【实验步骤】1称取1g植物材料置于研钵中，加入5mL的5%的偏磷酸，在4下下研磨，所得匀浆于22000g离心15 min。2. 收集上清液用于测定(AsA+DHA)和AsA的含量。取0.3 mL上清液，加入0.75 mL含5 mmol.L-1EDTA的磷酸缓冲液(150 m mmol.L-1，pH 7.4)和0.15 mL 10 mmol.L-1的二硫苏糖醇溶液（DTT）。3. 室温下放置10 min后，加入0.15 mL 0.5% N-乙基马来酰亚胺以消除多余的DTT。4加入0.6 mL的10%三氯乙酸(TCA)、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6mL的0.5%BP-乙醇溶液和0.15 mL的0.3%(W/V)FeCl3溶液。混匀后40水浴40 min，测525 nm处的吸光值。5 AsA的测定过程中以0.3 mL水代替DTT和N-乙基马来酰亚胺,其余操作步骤如上所述。DHA为总抗坏血酸与AsA的差值。【参考文献】Zhang J, Kirkham M BAntioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seedlingsNew Phytologist,1996,( 132): 361-373十 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性的测定【实验原理】谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)可使过氧化物(如H2O2,ROOH等)还原为相应的氧化物： GPx的活力可用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)反应生成黄色的5-硫-2-2硝基苯甲酸阴离子,在412 nm处有最大光吸收,测定该离子的浓度,即可计算出GSH减少的量。由于上述反应在非酶条件下仍能进行,故计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机3电子天平4. 水浴锅（二）材料1谷胱甘肽（GSH）2磷酸氢二钠3磷酸二氢钠4. 三氯乙酸55，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）6过氧化氢（H2O2）7柠檬酸8移液枪9陶瓷小研钵10离心管115ml、100ml、1000ml容量瓶（三）试剂1pH7.8磷酸缓冲液A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。0.05M pH7.8A母液 228.75ml+ B母液21.25ml定容至1000ml21.0mmol/LGSH（当日配制） 3.07mgGSH用PBS溶解至10ml.31.5 mmol/L H2O2（当日配制）取30% H2O215ul,以双蒸水定容至100ml40.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA）50.32mol/L Na2HPO465，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液：DTNB20mg加1%柠檬酸三钠50mL溶解【实验步骤】加入酶提取液1.6mL，冰浴研磨匀浆，4000rpm,离心10min,取上清液再12000rpm，离心5min，上清液供酶活性测定用。取上述酶液0.4ml，分别注入酶管与非酶管，并将非酶管加热失活，分别加入1.0 mmol/LGSH 0.4mL和经37预热的H2O20.2mL，立即记时3min,再在2支试管中加入0.61 mmol/L的三氯乙酸（TCA）4mL，3000rpm,离心10min,保留上清液，另取2支试管分别加入上述上清液2.0mL；再取1支试管加入蒸馏水1mL和TCA1.6mL作空白管，并在以上3支试管中分别加入0.32mol/L的Na2HPO4 2.5 mL和5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液0.5 mL（显色液内含有0.04%DTNB和1%柠檬酸三钠），反应5min,在412nm处比色读取光密度值。活性单位为umol-1g-1FW。标准曲线制作:取1mrnol/LGSH溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，以双蒸水稀释至10ml，即得到浓度为0、20、40、60、80、100umol/L的GSH标准液，取标准液各2.00ml，移入试管中，加0.32mol/LNa2HPO4溶液2.5ml和DTNB显色液0.5ml，反应5min于412nnl波长读取光密度(双蒸水调零)。以扣除非酶促反应后，在37反应每分钟每克蛋白使GSH降低1umol为一个酶活力单位，单位为umol/mg蛋白质min。5.计算方法：A=标准GSH（um）/标准GSH（OD412）即标准曲线的斜率【参考文献】Leopold F lohe，Wolfang AG.Assay of glutathione peroxidase in methods of Enzymology.1984,105:104-121.十一MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定（Mustafa Erkan and Wen-Chi Hou ,2008,1999 ）1. MDAR提取： 一般取0.2g材料于预冷的研钵中，分三次加入0.05mol/L（PH7.3）的磷酸钾缓冲液（预冷）1.8ml（难磨的材料可以加入适量的石英砂），在冰浴上研磨至匀浆，然后移到2.0ml的离心管（冲洗），于412000r/min下离心20min，上清液即为MDAR粗提液，将其放入冰箱中备用（-20或-80，在液氮中迅速冷却）。2. MDAR的测定： 酶活性的测定的反应体系包括： 2.7ml的预冷磷酸钾缓冲液（0.05mol/L，pH7.3）+0.1ml的NADH（0.2mmol/L）+0.1ml的ASA（1.0mmol/L）+0.001ml的AAO（1.0U）+0.1ml的酶提取液，以不加酶液的体系为对照，在340nm下测OD值的变化。 参考文献： Wen-Chi Hou, Hsien-Jung Chen, Yaw-Huei Lin，Dioscorins, the major tuber storage proteins of yam (Dioscorea batatas Decne), with dehydroascorbate reductase and monodehydroascorbate reductase activities，Plant Science,Volume 149, Issue 2,3 December 1999, Pages 151-156Mustafa Erkan, Shiow Y. Wang, Chien Y. Wang ，Effect of UV treatment on antioxidant capacity, antioxidant enzyme activity and decay in strawberry fruit，Postharvest Biology and Technology, Volume 48, Issue 2, May 2008, Pages 163-171十二.可溶性总糖的测定【实验原理】 实验采用蒽酮比色法测定可溶性总糖的含量。糖在硫酸作用下生成糖醛，糖醛与蒽酮作用形成绿色络合物，在一定范围内，颜色深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。方法简单，但没有专一性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 恒温水浴锅3. 分析天平4. 烘箱 5. 刻度试管（二）材料1. 活性炭2. 刻度试管、3. 漏斗4. 酒精（20%）5. 植物叶片或种子6. 滤纸（三）试剂1. 葡萄糖标准液：80烘箱烘至恒重的葡萄糖100mg，配成500ml溶液，即为200g/ml的标准液，2. 蒽酮试剂：100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸加30ml水中）。3. 酒精（20%）：20ml酒精溶解至100ml。【实验步骤】1. 可溶性糖的提取 各种植物叶片或种子在110烘箱中烘15min，然后调至70过夜。干叶片磨碎后称取50mg样品倒入10ml刻度试管内，加入4ml80%酒精，置于80水浴中不断搅拌40min，离心，收集上清液，残渣加2mll80%酒精重复提取2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80脱色30min，定容至10ml，过滤后取滤液测定。2. 显色及比色吸取上述酒精提取液1ml，加5ml蒽酮试剂混合，沸水浴煮10min，取出冷却。在625nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。3. 绘制标准曲线取标准糖溶液将其稀释成一系列0-100g/ml的不同浓度的溶液。按上述方法分别测定OD值，然后绘制标准曲线。【参考文献】1. Fairbairn N J. A modified anthrone reagent J.Chem.and Ind., 1953(4):862. 中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会. 现代植物生理学实验指南M. 北京：科学出版社， 1999. 127十三. 葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖的测定【实验原理】糖类的测定方法种类甚多，常规的化学反应法只能测定总糖和还原糖，运用乙腈作为流动相，当其中所含的混合物（包含糖类）经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于混合物中各糖类组分在性质和结构上的差异，在流动相的作用下，不同糖类组分在固定相中的保留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出，实现分离。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 高效液相色谱仪2. 高压泵3. 示差折光检测器4. 电子分析天平5. 离心机（二）材料1. 研钵2. 10ml离心管3. 100ml容量瓶4. 0.45m微孔滤膜（三）试剂1. 果糖2. 葡萄糖3. 蔗糖4. 乳糖 以上均为分析纯5. 乙睛为进口色谱纯6. 超纯水【实验步骤】1. 将样品洗净、擦干、切碎、混匀。2. 称取5.00g 于研钵中,加入5ml 的蒸馏水研磨匀浆，用10ml蒸馏水将匀浆全部移入离心管中,3000r/ min 离心5 min。3. 离心液倒入干净试管中,再向盛有沉淀的离心管加入10ml蒸馏水并搅拌沉淀物,离心,合并离心液于100ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。4. 稀释液再用微孔滤膜(0.45m)过滤,备 HPLC 分析用。5. 标准曲线的制定：精密配制4种糖组分的混合标准溶液,按上述操作条件分离检测,以质量浓度(X ,g/L)为横坐标,色谱峰峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,得4种糖组分标准曲线的回归方程及相关系数。【注意事项】1. 色谱分析时，折光示差检测器对环境的温度比较敏感 ,温度变化明显 ,基线会出现漂移或波浪起伏。故实验室的温度控制在 251,尽量避免大的变化。2. 色谱条件根据具体实验情况设定。【参考文献】1. AOAC (Association of Official Analytical Chemists). Official methods of analysis of the AOAC (14th edition)R，AOAC，Arlington VA，19842. W.Schwald，R.Concin, G.Bonn，O.Bobleter. Analysis of oligomeric and monomeric carbohyd-rates from hydrothermal degradation of coton- wastematerials using HPLC and GPC J. Chromato