酶联免疫吸附试验.ppt

酶联免疫吸附试验 Enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA ELISA的基本原理 使抗原或抗体结合固相载体表面 并保持活性 使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原 在测定时 把受检抗体 或抗原 和酶标抗原 或抗体 按不同的步骤与固相载体表面的抗原 或抗体 起反应 用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原 或抗体 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例 加入酶反应的底物后 底物被酶催化变为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析 ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有三个必要的试剂 1 固相的抗原或抗体 2 酶标记的抗原或抗体 3 酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件 可设计出各种不同类型的检测方法 一 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 操作步骤如下 1 将抗体包被在固相载体上 2 如样品中含有抗原 则结合为抗原抗体复合物 3 再加入酶标记抗体 则结合为抗体 抗原 酶标记抗体复合物 4 酶催化底物并显色 二 间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法 操作步骤如下 1 将抗原包被在固相载体上 2 如样品中含有抗体 则结合为抗原抗体复合物 3 再加入酶标记抗抗体 则结合为抗原 抗体 酶标记抗抗体复合物 4 酶催化底物并显色 三 酶标抗原竞争法 竞争法可用于测定抗原 也可用于测定抗体 以测定抗原为例 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合 因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比 1 将抗体包被在固相载体上 2 如样品中含有抗原 则优先竞争结合抗体 结合为抗原抗体复合物 3 同时加入酶标记抗原 抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据 则结合为酶标记抗原 抗体复合物 4 酶催化底物并显色 间接ELISA方法的建立 1 抗原最佳包被液的选择 2 抗原 血清和酶标二抗工作浓度的确定 3 封闭液的选择 4 封闭时间的优化 5 血清稀释液的选择 6 抗原抗体反应时间的优化 ELISA操作步骤 以间接ELISA为例 1 包被抗原 用包被液将抗原稀释至合适浓度 加入到酶标板中 每孔100 l 4 过夜 2 洗涤 弃去孔内液体 用洗涤液洗3次 每次3min 最后用吸水纸拍干 3 封闭 各孔加入封闭液200ul 37 作用1h 4 洗涤 5 加被检血清 将血清样品稀释至最佳浓度 每孔100 L 每个样本两孔 每块板同时设阴性 阳性及空白对照各两孔 37 作用30min 6 洗涤 7 酶标二抗 稀释HRP标记羊抗猪IgG 每孔100 L 37 作用30min 8 洗涤 9 显色 加新鲜配制的TMB底物液每孔100 L 室温避光作用15min 10 加终止液 加50 L2mol L硫酸 11 读数 用酶标仪检测OD450值 血清学方法有很多种 如传统的琼脂扩散 AGID 血凝抑制 HA HI 乳胶凝集 试管凝集 补体结合等方法 但这些方法不是最合适的检测方法 EILSA技术与其有着不同的特点 1 灵敏度高 ELISA是通过酶促反应放大检测信号 从而提高检测的灵敏度 其检测限可达ng甚至pg水平 可做定量测定 2 特异性强 ELISA的每一步体的特异性识别过程 结构类似物 有色物质 荧光物质等对检测的影响很小 3 样品的预处理过程和ELISA的操作步骤简单快捷 有的试剂盒仅需1 2个小时即可得出检测结果 并且可同时检测数十甚至上百个样品 4 设备简单 适用于基层 ELISA的优点 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术 现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病 寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定 根据已经使用的结果 认为ELISA法具有灵敏 特异 简单 快速 稳定及易于自动化操作等特点 不仅适用于临床标本的检查 而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 因此 也适合于血清流