重组DNA1技术课件.ppt

重组DNA技术 1 DNARecombinationtechnology 1 杨敏检验医学院临床生物化学教研室 临床分子诊断学 技术篇2 课前复习 1 核酸分离纯化的原则是什么 2 核酸分离纯化的基本步骤 核酸的分离与纯化 核酸分离 纯化原则保持核酸分子一级结构的完整性保证纯度分离提取核酸的主要步骤核酸的释放 细胞的破碎核蛋白的解聚 变性 蛋白质的去除核酸的浓缩 沉淀和洗涤核酸的浓度测定核酸的保存 DNA知识回顾 DNAandRNAarelargemacromoleculeswithseverallevelsofcomplexityNucleotidesformtherepeatingunitsPhosphodiesterbondslinknucleotidestoformastrandTwostrandsinteracttoformadoublehelixThedoublehelixinteractswithproteinsresultingin3 Dstructuresintheformofchromatin NUCLEICACIDSTRUCTURE 3Dstructure NucleotideComponents Base sugar nucleosideExampleAdenine ribose AdenosineAdenine deoxyribose DeoxyadenosineBase sugar phosphate s nucleotideExampleAdenosinemonophosphate AMP Adenosinediphosphate ADP Adenosinetriphosphate ATP Combiningalltheparts dATP DeoxythymidinediphospatedTDP DeoxyadenosinetriphospatedATP dNDP dNTP N oneoftheA T C GD diT tri A G CorT A G CorU dNMP NMP NucleotidePolymerizationReaction PhosphodiesterBondFormation Copyright TheMcGraw HillCompanies Inc Permissionrequiredforreproductionordisplay G CA TA U 碱基互补配对原则theprincipleofcomplementarybasepairing Writethestrandcomplementaryto 5 ACTAGCCTAAGTCG3 Answer 3 TGATCGGATTCAGC5 5 CGACTTAGGCTAGT3 3 GCTGAATCCGATCA5 Rotation 主要内容 DNA重组和分子克隆工具酶载体分子克隆的基本步骤 要求 掌握重组DNA技术 限制性内切酶 载体的概念 分子克隆的基本步骤 熟悉常用的DNA连接酶 DNA聚合酶等工具酶 常用载体的特点 了解重组DNA技术的应用 Digestion Fragmentrecovery Ligation Transformation Selection Amplification Plasmidpreparation Proteinexpression 重组DNA技术 RecombinantDNAtechnology是指用酶学的方法将目的DNA在体外重组于自我复制的载体DNA分子上 然后将重组DNA导入宿主细胞中进行扩增和繁殖 以获得大量的目的DNA片段 或以此为基础 通过基因的诱导表达 得到大量相应蛋白质产物的过程 常称作分子克隆 molecularcloning 技术或基因工程 geneengineering 技术 DNA克隆克隆 clone 细胞通过无性繁殖后产生的与亲代细胞完全相同的子代群体 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合 克隆化 cloning 获取同一拷贝的过程 即无性繁殖 分子克隆 DNA克隆 细胞克隆个体克隆 动物或植物 重要特点之一 在体外实现DNA分子的切割 重新连接 修饰及合成 工具酶 toolenzyme 重要特点之二 载体 vector 的设计和应用 DNA重组 工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I逆转录酶TaqDNA聚合酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶末端转移酶S1核酸酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 所有工具酶中最为重要 是一类识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列 并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的核酸内切酶 是细菌内存在的保护性酶 与对应的甲基化酶共同组成了细菌内的限制修饰系统 命名与分类 根据限制酶的结构和作用特点不同 分为I II III三类 p75表 EscherichiacoliR改为M时则为甲基化酶 RestrictionEndonucleases TypeII Therearehundredsofrestrictionenzymes Hydrolyze3 5 phosphodiesterbond Recognitionsite cuttingstyle endtypeofEcoRI CutDNAintheinterior 双轴对称回文结构 palindrome 5 5 3 3 G A A T T C G A A T T C N N N N 5 overhang 5 overhang Frequency 1 4 n wheren thenumberofbpsintherecognitionsequence P76改错 RestrictionEnzymes RestrictionEnzymes 部分常用限制性内切酶 特异识别 4或6个碱基回文结构 特异切割 5 突出黏末端5 overhangcohesiveend 3 突出黏末端3 overhangcohesiveend 平末端bluntend 同序同切酶 同序异切酶 同裂酶 同尾酶 Compatibleend可配伍的末端 制备可控特异片段 5 CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG 3 只写出了一条链的序列信息 找一找 5 CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG 3 只写出了一条链的序列信息 选取的是载体上的多克隆位点 正确答案 RestrictionenzymeanalysebyNEBCutter 举例说明限制性内切酶反应的设置 DNA1 g10 xNEBbuffer310 L100 xBSA1 LBamHI1unitH2O补充体积至100 L 最适反应温度下保温适当时间 100ul反应 限制性内切酶反应的影响因素 DNA的纯度和结构反应缓冲液的pH及离子浓度酶解温度和时间限制酶 限制性内切酶在DNA重组技术中的应用 改造和组建质粒组建基因组DNA物理图谱基因组DNA同源性研究DNA重组克隆及亚克隆DNA杂交与序列分析分析限制性片段长度多态性Restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP RestrictionEnzymeMapping 还有其它可能性 DNAligase DNA连接酶是一种封闭DNA链上切口的酶 它借助ATP或NAD 辅酶I 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 水解提供的能量催化一段DNA链上临近的5 磷酸末端和3 羟基末端生成磷酸二酯键 把两个DNA片段连接在一起 从而封闭双链DNA上的切口 3 5 磷酸二酯键 nick T4DNAligase rATP 互补的粘性末端 平末端E ColiDNAligase NAD 互补的粘性末端 平末端 两类常用DNA连接酶及其辅助因子 焦磷酸部分 AMP部分 AMP部分 NMN部分 rATP NAD 连接机制 3步骤 NAD NMN DNA 腺苷酸激活 赖氨酸的 氨基 切口 nick 与缺口 gap 的区别 GATTCCTTAG GAATTCCTTATG nick gap 可连接 不可连接 磷酸二酯键断裂 核苷酸缺失 效率高 效率低 粘性末端连接 LigationofRestrictionEnzymeDigestedDNA EcoRI EcoRI EcoRI BamHI BamHI 如何筛选我们想要的质粒 如何通过克隆策略设计增加获得想要质粒的机会 Question 影响连接酶效率的因素 rATP NADMg2 DTTpH7 2 7 4 DNAPolymerase 催化以DNA为模板合成DNA的反应 主要用于DNA的体外合成 共同特点 催化在带引物的双链DNA分子的3 羟基端加上脱氧核苷酸 合成方向对应于被合成链而言从5 端到3 端延伸 形成新的DNA链 反应需要4种脱氧核糖核苷酸和Mg2 5 3 聚合酶活性a5 3 外切酶活性b3 5 外切酶活性c 大肠埃希菌DNA聚合酶I abc 缺口平移法标记 3 黏性末端标记 平端化 cDNA合成大肠埃希菌DNA聚合酶IKlenow大片段 ac 补齐 3 末端标记 耐热TaqDNA聚合酶 ab 微弱的非模板依赖的末端转移酶活性 耐高温 PCR TA cloning逆转录酶 ab 以mRNA为模板合成cDNA 降解RNA DNA中的RNA 用于构建cDNA文库T4DNA聚合酶 ac 补齐末端 标记T7DNA聚合酶 ac 序列分析 测序酶 GAATTCCTTAAG CTGCAGGACGTC EcoRI PstI AATTCG CTGCAG EcoRI PstI Digestion EndBlutting AATTCTTAAG CG T4 DNApolymerase dNTP IdentifyingNaturalProductBiosyntheticGenesfromaSoilMetagenomebyUsingT7PhageSelectionZhangK HeJ YangM YenM YinJ Chembiochem 2009 10 16 2599 2606 反转录酶reversetranscriptase 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase催化去除DNA RNA dNTP或NTP上的5 端磷酸基团 方便5 端标记同位素 防止连接反应时载体的自身连接 细菌碱性磷酸酶BacterialAlkalinePhosphatase BAP牛小肠碱性磷酸酶CalfIntestinal