中枢神经系统的损伤与修复.doc

中枢神经系统的损伤与修复神经系统的功能主要是由亿万神经细胞的胞体及其突起组成复杂的网络来完成的。其中，神经元即神经细胞是神经系统结构和功能的基本单位，也是神经系统损伤修复研究的重要环节。由于中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的神经元损伤后极难再生，1906年诺贝尔医学生理学奖获得者、西班牙著名的神经组织学家Cajar就曾断言哺乳动物CNS不具备再生能力。直到1958年，Liu和Chambers第一次证实成年哺乳动物CNS损伤后仍具有可塑性后，才使人们重新将目光真正聚焦在CNS损伤后的再生修复问题上来。在各国医学家们的努力下，CNS的可塑性研究有了一些突破性进展，但是目前尚不能取得满意的临床疗效。中枢神经系统疾病是当今社会最具破坏力的疾病之一。美国每年有超过1万例新发偏瘫及四肢瘫患者，超过10万永久神经功能缺失病例。如何促进中枢神经再生提高损伤修复临床治疗效果，是神经科学研究者迫切需要回答的问题。因此，进行神经细胞的损伤修复研究具有十分重要的理论及现实意义。第一节 神经细胞损伤后的反应 尽管原发性机械损伤使部分神经元直接死亡，但48小时后的继发反应导致大量的神经元死亡，触发神经元死亡的最主要因素是损伤后继发缺血所致的一系列分子和细胞水平的级联反应，进而导致整个神经元直接发生不可逆的死亡崩解，树突、轴突溃变死亡；当轴突切断损伤后神经元形态的变化被描述为轴突反应、或逆行性反应（如图3-1）。轴突损伤后，急性期的逆行性反应的形态特征为整个神经细胞肿胀，细胞核从胞浆中央移向周围，尼氏体溶解消失。然而急性期后，能够恢复的神经元在轴突再生过程中始终保持肥大，游离核糖体以及内质网等细胞器增加，以合成与细胞代谢、修复相关的蛋白质。如果神经元不能恢复，许多细胞将缓慢萎缩或崩解死亡。轴突切断损伤后多种酶、神经递质、骨架蛋白、生长相关蛋白(GAP43)、神经营养因子受体等表达都发生了明显变化。 目前所报道的神经元损伤病理生理变化大多来自动物试验。细胞膜受损导致兴奋性氨基酸和与氧自由基的释放，以及由于Na+-Ca2+交换增加导致钙离子超载进一步使细胞肿胀，同时钙离子依赖的酶类释放并水解磷脂。Lehotsky J等研究认为，神经细胞损伤后内质网贮存Ca2+超载及细胞应激反应所造成的内质网功能紊乱是神经元死亡的重要原因之一。 Jordan J等研究发现，遗传或功能性线粒体改变能启动程序化细胞死亡。在急性神经元损伤过程中，线粒体被认为是激活细胞应激信号的主要环节，以线粒体渗透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore , MPTP）为代表的一些蛋白可以调节线粒体膜内外渗透性的增加，这个过程能触发线粒体释放介导细胞死亡的因子，如细胞色素C、凋亡介导因子（AIF）和Caspase等，它们能使线粒体跨膜电位改变，ATP损耗、氧自由基增加，故设计干预MPTP功能的药物可能对急慢性神经元损伤的治疗是一种新方法。另外，有研究者发现PARP-1（Poly(ADP-ribose) polymerase-1）的活化可以使NAD水解成为烟碱，并能将ADP核糖单位转移到包括组蛋白和PARP-1在内的很多核蛋白，这个过程可以促进受损DNA的修复，但氧自由基和兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤会使PARP-1过度活化，导致NAD、ATP耗竭和细胞死亡。原发性脑实质损伤后数小时可以观察到巨噬细胞、小胶质细胞迁移到损伤区产生大量毒性细胞因子和氧自由基，导致继发的兴奋性毒性脑损伤，而整合素CD11a可以调控小胶质细胞的迁移过程，由于PARP-1 可以调节CD11a的表达，因此，PARP-1下调可能减轻神经细胞继发性损伤。PARP-1还作为基本调制器参与了核因子kappaB及P53的转录程序，在细胞生存死亡过程中发挥重要作用。此外，CNS损伤后引起包括DNA降解和细胞膜磷脂酰丝氨酸残基的早期暴露在内的一系列程序性细胞死亡的病理过程，进而加重神经元继发损伤。钝性脑外伤剪切力导致神经元胞体细胞膜、血管床原发和继发性损伤；而缺血引起的神经损伤，主要表现为代谢应激、离子紊乱、生物化学及分子生物学瀑布样事件，最终导致神经元死亡。但两者发病机制有些相似性，使缺血后神经保护治疗策略对外伤所致神经细胞损伤也有效。上述所有这一系列自杀性事件都与损伤部位神经元的死亡和轴突的损毁有关，表现出相当复杂的病理生理变化过程。一、 轴突对损伤的反应 损伤后早期断端两侧的轴突发生变性崩解。断端远侧的轴突变性，称为Wallerian变性或顺行性变性；而发生在与胞体相连的近端轴突变性称为逆行性变性。后者通常只累及少数郎飞结。同时在轴突切断后的几小时内，髓鞘也开始收缩、肿胀、断裂，最后崩解为脂质颗粒。中枢神经髓鞘由少突胶质细胞构成，缺乏雪旺细胞的吞噬活性。周围神经系统（Peripheral Nervous System, PNS）损伤后13天可见巨噬细胞活化清理轴突和髓鞘崩解碎片，而CNS至损伤后20天才可见来源于单核巨噬细胞和小胶质细胞的巨噬细胞样的细胞。由于小胶质细胞向吞噬细胞转变的延迟不利于改善再生微环境。因此，CNS轴突再生远较PNS者困难。广泛轴索损伤后轴突运输中断，引起受损轴突-淀粉前体蛋白及水解产物和神经丝蛋白大量堆积，轴突损伤端的钙内流还将激活磷酸酯酶A2，由磷酸酯酶A2介导轴突断端生长锥（growth cone）的形成，再生纤维的生长锥释放一种蛋白酶溶解基质，为介导断端近侧的轴突出芽创造一种微环境，生长锥还可以对轴突生长起导向作用。二、 神经细胞损伤后的炎症反应 中枢神经系统损伤后早期炎症反应主要由小胶质细胞和巨噬细胞介导，包括血管通透性增加，炎性细胞浸润，以及炎症介质的释放等。尽管最近有研究表明CNS炎症有利于神经损伤修复，但炎症介质的释放也导致了损伤，因此调控及减轻炎症反应有助于神经功能恢复。近年还发现，部分由星形胶质细胞和免疫细胞产生的细胞因子可介导神经营养因子诸如NGF在脑损伤后表达增加，从而参与免疫功能调节。中枢神经系统多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎等病中NGF及其它营养因子的产生亦明显增加，而NGF增加有利于抑制炎症反应。因此，在成年CNS，营养因子网络不仅保护损伤神经元和轴突髓鞘，而且还有利于维持大脑免疫豁免，控制炎症反应。而免疫系统细胞在中枢神经损伤后可以分泌许多神经营养素如NGF、NT3、NT4/5，并表达Trk受体家族如TrkA、TrkB、TrkC，在损伤区通过自分泌和旁分泌机制最终调节神经元功能。炎症因子、神经保护因子和神经毒性因子（NTFs、自由基、及其它）之间存在复杂的信号联系。而改善免疫细胞和神经细胞在中枢损伤后的平衡是新的神经保护治疗策略。补体活化对中枢神经损伤有正反两方面的作用，适当活化可以促进神经元存活和重塑，参与宿主对病原体的防御反应，补体调理素(C1q、C3b、iC3b)还可与效应细胞膜受体相互作用，吞噬细菌。而补体过敏素C3a、C5a能启动局部炎症反应，最终发挥神经保护效应。损伤部位延迟的小胶质细胞和巨噬细胞浸润可能导致髓鞘崩解产物不能及时清除，从而抑制神经再生。损伤灶局部的炎症因子、氧自由基、兴奋性氨基酸等也可造成继发性神经元胞体和轴突的损伤；但炎症反应中巨噬细胞也可分泌一些促神经再生的因子，如NGF、BDNF、NT-3等。此外，巨噬细胞不仅具有降解蛋白聚糖的功能，并且还能诱导其他细胞降解蛋白聚糖。因此有学者认为适度的炎症反应可能会有利于中枢神经系统的再生修复。第二节 胶质细胞对损伤的反应 近些年来，随着研究的不断深入，人们发现CNS损伤后之所以比PNS难以修复，原因之一是CNS有不利于神经再生的微环境，尤其胶质细胞在阻碍神经损伤修复的过程中扮演了重要角色。因此，许多科学家纷纷把目光集中到胶质细胞与CNS可塑性之间的关系上来。一、 少突胶质细胞对损伤的反应 中枢神经系统损伤后，少突胶质细胞有一过性的增殖反应，目前许多证据表明少突胶质细胞及其髓鞘是CNS难以再生的重要原因之一。20世纪80年代，David和Aguayo 发现中枢神经细胞的轴突可以长入周围神经之中，长度达23cm。由此推断CNS的微环境不利于轴突再生。以后许多学者研究了中枢神经系统阻碍轴突再生的因素，发现了许多重要的抑制性生物大分子。在神经元和少突胶质细胞共同培养的实验中，当神经元轴突接触到少突胶质细胞时就停止生长，提示中枢神经系统内可能存在抑制神经再生的物质。随后的研究发现，成年哺乳动物CNS髓鞘内能分离出一种抑制轴突生长的分子，称髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)。2000年Schwab研究小组分离纯化了 NI-250和NI-220(bNI-220)即NogoA，并利用NogoA克隆出Nogo基因。Nogo主要在中枢的少突胶质细胞表达，具有抑制中枢神经系统轴突生长锥的能力。目前，人类的Nogo基因已被分离并克隆表达出NogoA、NogoB、NogoC三种不同结构的蛋白，NogoA主要分布于少突胶质细胞的内质网、高尔基体和细胞表面。研究观察到NI250的抗体IN-1可中和NogoA抑制轴突生长的作用，明显诱导神经纤维在中枢神经系统白质内的生长。二、 星形胶质细胞对损伤的反应 神经系统在发育过程中，星形胶质细胞可以作为神经元迁移和轴突向靶细胞延伸的基质，并合成分泌多种细胞因子及基质分子促进轴突生长；在成体，星形胶质细胞不仅对神经元有营养支持作用，而且通过ATP和谷氨酸介导胶质-神经元的信息传递。但在中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞可起到一定的促进轴突再生的作用，它合成的载脂蛋白E(Apo E)不仅在神经元之间传输胆固醇和其它脂质类，还参与了神经损伤修复过程。但星形胶质细胞还对神经再生有以下方面的不利作用：首先损伤灶周围星形胶质细胞、小胶质细胞以及侵入的炎症细胞能产生IL-1、IL-6、CNTF、TNF等细胞因子，活化、引发胶质细胞反应，表现为星形胶质细胞肥大增生，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）合成增加，炎性细胞浸润，从而形成胶质瘢痕阻碍神经再生；此外星形胶质细胞也能合成一些抑制轴突再生的基质分子如蛋白聚糖、韧粘素等。巨噬细胞、小胶质细胞除了能介导星形胶质细胞合成蛋白聚糖之外，其本身也能产生蛋白聚糖。近期的研究显示, 硫酸软骨素蛋白聚糖在CNS损伤后表达持续增加，胶质细胞硫酸软骨素蛋白聚糖的合成增加与损伤部位血脑屏障破坏、巨噬细胞侵入有关。蛋白聚糖抑制神经再生的作用主要是由于它们形成了不适合轴突生长的微环境。第三节 中枢神经损伤修复策略 成年哺乳动物CNS轴突损伤后，由于不能进行有实质意义的再生形成功能性突触联系，往往导致永久的神经功能缺失。中枢神经系统再生困难的原因至少有以下几个方面：CNS损伤后神经元极易死亡；CNS神经细胞的外部微环境含有多种抑制因子，不允许轴突再生；有丝分裂后的神经细胞其内在生长能力减弱。神经损伤修复涉及神经元胞体、再生轴突、通道和靶之间的相互联系和作用，需具备两个基本条件：一是损伤区尚存有生长潜能的神经元，且存活的神经元可以提供轴突再生所需的结构和功能物质；二是有营养因素、细胞外基质等引导再生轴突延伸的神经再生微环境。再生的轴突必须穿越胶质瘢痕并沿正确途径延伸到达损伤区的远侧端与相应靶建立特异性功能联系。再生轴突与靶连接的正确性称为再生特异性，是功能修复的关键。因此，CNS损伤修复策略应包括多因素联合才能解决这个难题，包括使残留CNS神经元最大限度的存活及功能保存，促进神经保护和再生以及阻断抑制轴突再生的因素等。神经营养因子在脑室内、鞘内及局部应用后能被转运到损伤区域促进损伤神经元的存活再生。目前，科学家们正在研究将神经营养因子基因转导到病毒载体如单纯疱疹病毒、腺相关病毒、慢病毒和莫尼氏白血病毒，以寻求新的在中枢神经系统高效表达营养因子的方法。其优点在于体外转染NTFs基因的细胞移植可以替代损伤及死亡的神经元，局部持续表达的NTFs可以为神经再生提供营养支持并促进轴突再生。因此，转基因神经细胞移植在促进中枢神经损伤修复策略中是一个有前途的方向。 在神经损伤修复中，除了促进神经生长的因素外，还应考虑到抑制因素。抑制神经再生的因子称为神经生长抑制因子（nerve growth inhibitors，NGIs），成熟的少突胶质细胞能产生许多轴突生长抑制物质,包括NI-250、NI-35和MGA。最早发现的中枢抑制性因子是NI-250，Schwab等用NI-250的单克隆抗体IN-1治疗SCI大鼠，发现有少量的皮质脊髓束轴突能再生1cm左右，并恢复部分下肢主动活动功能，同时联合应用生长因子，可提高轴突再生的能力；为了研究阻断MAG对轴突生长的作用，敲除小鼠MAG基因后发现其皮质脊髓束损伤后的轴突再生能力较正常小鼠强。原始少突胶质细胞能产生一种抑制性的蛋白多糖NG2，可特异性地引起轴突生长锥萎缩并抑制轴突延伸。因此，CNS存在的多种轴突生长抑制因子进而形成不利于再生的微环境。 值得注意的是，轴突生长的导向因素和细胞外基质也是构成再生微环境的重要组成部分。导向因素可以引导再生轴突沿一定的方向生长，神经趋向因子由变性神经远段或靶细胞产生，对一定距离外生长的轴突具有吸引力，可吸引再生轴突逆浓度梯度生长。一些NTFs也可以起到轴突生长趋化的作用；细胞外基质（ECM）是沉积在细胞间的无定形大分子物质，主要有层粘蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）、IV型胶原和V型胶原、硫酸肝素糖蛋白等，可为基质提供适当的粘着性，使轴突适合沿基质桥生长、保持生长锥前进的稳定性、指导神经纤维定向生长。有研究表明，为了使受损CNS轴突获得最佳再生效果，再生鸡尾酒 治疗策略应包括增加整合素及促进神经轴突再生的蛋白多肽如层粘蛋白-1、纤维连接蛋白等。现已知CNS损伤后，有很多轴突抑制分子的表达。为克服神经再生的障碍，最近有研究应用软骨素酶-ABC治疗CNS损伤得到令人鼓舞的结果。通过降解星形胶质细胞瘢痕中的硫酸软骨素蛋白多糖链，可以恢复成年大鼠视皮质突触的可塑性。该发现在促进成年CNS可塑性和神经功能恢复方面有相当诱人的前景。然而，硫酸软骨素蛋白多糖(CS-PGS)也有神经保护作用，进一步探讨CNS病理条件下细胞外基质分子表达调控机制将为CNS损伤修复研究提供新的思路。CNS中的细胞粘附分子（CAM）主要有神经细胞粘附分子（N-CAM）、胶质细胞粘附分子（Ng-CAM）、LI-1、LI-2、LI-6等。这些物质使轴突与非神经细胞相识别，表现出对促进或抑制生长的信号更为广泛的应答。下面分别简要阐述神经营养因子、神经生长抑制因子、及神经干细胞、和其它细胞对神经损伤修复的作用。一、 神经营养因子与神经损伤修复 神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）是能促进神经元存活，诱导其分化，并对神经系统的发育及功能的维持起重要作用的一些小分子多肽。它的发现和研究开辟了一个崭新的领域，为神经系统损伤及退行性疾病治疗提供了一种新的思路。所有NTFs均不同程度地或各有侧重地支持发育期感觉、运动神经元的存活。NTFs在神经系统发育期表达水平较高，但成年后表达下降。神经损伤可以诱导NTFs的表达上调，通过靶源性、自分泌、旁分泌的方式与特定受体结合，激活各种信号转导通路，促进受损神经再生。例如脑损伤后，由星形胶质细胞和免疫细胞产生的细胞因子介导神经营养因子诸如NGF的表达增加。在中枢神经系统多发性硬化和自身免疫性脑脊髓炎等疾病时，NGF及其它营养因子的表达能减轻炎症反应，成年中枢神经系统营养因子网络不仅可以保护轴突髓鞘而且有利于维持脑组织的免疫豁免。二、 NTFs的作用模式（一） 靶源性作用模式 研究发现，神经元轴突支配的靶细胞及其周围的胶质细胞能合成分泌神经营养因子，这些神经营养因子可被轴突末梢摄取并通过轴浆运输逆向转运至胞体发挥生物学效应（如图3-2所示）。现已知NGF的靶源性作用机制如下：由靶组织合成、分泌的NGF与神经末梢受体结合后，激活trkA受体酪氨酸激酶，使其自身酪氨酸残基磷酸化，活化的trkA受体或NGF-trkA受体复合物或NGF-trkA-P75 复合物通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF，并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，由信使体系（第二、第三信使等）转导，进而启动一系列级联反应，对靶细胞的基因表达进行调控进而发挥其作用。发育神经生物学研究发现，神经细胞在发育期大量增殖，但如果没有与靶组织取得联系，则大部分神经细胞发生程序性死亡（Programmed cell death，PCD）,只有部分在竞争中获得靶细胞的神经元才得以存活下来。因为这些竞争到靶的细胞即可以从靶细胞获得神经营养因子，通过靶源性神经营养因子作用维持效应神经元的存活。未成熟的神经细胞，如果因轴突损伤后使神经元失去靶源性的营养因子将导致发育中的神经元死亡，而给予外源性的神经营养因子可促进神经细胞的存活，减少神经细胞的死亡。发育成熟的神经元对靶源性的营养因子的依赖较少，轴突切断引起的靶源性营养因子供给的中断，其直接效应是引起神经元胞体、树突的萎缩和蛋白质表达及代谢的变化，并使得神经元更易在其他不利的环境下死亡。（二） 自分泌和旁分泌作用模式 20世纪80年代末提出，神经营养因子除了靶源性作用模式外，还可能通过局部的自分泌或/和旁分泌方式发挥其生物活性（如图3-3，3-4所示）。例如，对背根节感觉神经元进行体外培养，发现这些成熟的背根节(DRG)感觉神经元不仅能表达BDNF且依赖自身合成的BDNF维持存活。成年大鼠坐骨神经损伤后，相应DRG的NGF mRNA和BDNF mRNA均明显增加，同时在损伤的整个期间都表达P75、trkA和trkB。表明DRG神经元仍具有对NGF和BDNF等因子的反应性，而这些神经营养因子又是来自背根节本身，是这些自身合成的神经营养因子在支持感觉神经元的存活，即NGF是以自分泌方式发挥作用的。另外，成体动物背根节免疫组化双标研究揭示许多表达BDNF mRNA的感觉神经元也表达NGF的高亲和力受体trkA，表明NGF可通过旁分泌机制调节BDNF的合成；有研究表明，成年哺乳动物神经系统可同时存在自分泌和旁分泌作用机制。 目前，已发现了20余种NTFs和某些细胞因子能促进损伤神经元的存活。一些NTFs兼有营养和导向两种作用。神经营养因子不仅对神经系统的发育及正常功能维持起着十分重要的作用，而且在中枢神经系统损伤、脑卒中、早老性痴呆（Alzheimers disease，AD）、帕金森氏病（Parkinsons disease，PD）等多种神经系统疾病中有明显的神经保护作用，因此应用NTFs进行神经损伤修复治疗有重要的理论及实践意义。NTFs局部注射等常规给药方式有药物作用持续时间短须反复给药，药物难以透过血脑屏障等缺陷，临床上难以实际应用。而将携带NTFs基因的神经干细胞移植替代破坏的神经元并诱导其向特定的细胞类型分化与宿主神经元形成突触联系，是一种有潜在应用价值的方法。尽管基因治疗在寻找安全有效的载体方面已取得一些进展，但仍有许多问题急需解决，如重组NTFs的生产和纯化、基因转移后的长期表达及免疫排斥反应等。三、 NTFs在神经损伤修复中的作用（一） 神经生长因子与神经损伤修复 神经生长因子（Nerve growth factor, NGF）是最早发现的神经营养活性物质，研究发现NGF受体分为高亲和力受体（high affinity NGF receptor, HNGFR或trkA）和低亲和力受体（low affinity NGF receptor, LNGFR或P75）。有证据提示，trkA 含有酪氨酸激酶（trkA），当NGF和trkA结合后，由于自身酪氨酸残基磷酸化，引起一系列细胞内信号传导，从而导致细胞生理功能改变，NGF对效应细胞功能的发挥依赖于与trkA的相互作用。通过对已消除了酪氨酸激酶区编码顺序的trkA突变大鼠研究发现，大多数此类大鼠生后即死亡，少数活到成年者均出现脊髓和三叉神经节中传递感觉的中小神经元丧失，因而动物对温痛觉均不敏感。此点表明，其神经营养功能由TrkA调节，失去TrkA其功能不能发挥。尽管NGF与P75结合并不能直接发挥生物学效应，但能通过提高HNGFR与NGF的结合位点率，从而间接影响HNGFR介导的信号传递。 NGF可以有促进神经元存活和诱导神经突起生长的作用，主要表现在以下几方面：维持交感神经元和胆碱能神经元的正常功能。细胞培养的研究已显示NGF能支持基底前脑胆碱能神经元的存活。应用外源性NGF能促进大多数交感神经节内神经细胞存活，甚至肥大；在横切海马伞以后，注入NGF亦可阻止切断轴突的海马胆碱能神经元的死亡。诱导离体培养的交感神经元和感觉神经元突起生长。NGF可诱导培养的鸡胚DRG和交感神经节神经元突起生长，并促进核仁、粗面内质网、高尔基复合体的蛋白质与DNA合成能力增加。对新生大鼠连续给NGF，其交感神经元的突起数目及长度比对照组增加3倍。但在成年哺乳动物中枢神经系统，NGF和NGF受体的水平明显下降，主要效应神经元对NGF的依赖性也显著降低。如新生大鼠用NGF抗体处理，DRG神经元减少20-35，而成年大鼠用NGF 抗体处理，DRG神经元则不死亡。NGF对神经纤维的生长起一定的化学导向作用，诱导突起向NGF浓度高的方向生长。有研究表明，连续7-10天将NGF注入新生大鼠延髓，可见椎旁交感神经节细胞长出神经纤维并经脊神经节长入脊髓，再向上长至延髓。NGF还可以影响免疫系统的肥大细胞、巨噬细胞和胸腺细胞的功能。随着研究的深入，NGF与神经损伤修复的关系已倍受重视。有资料报道，在切断动物坐骨神经，局部应用NGF后发现它可明显减轻轴突切断后所致的神经元胞体萎缩和避免神经元死亡。成年大鼠单侧隔-海马背侧胆碱能通路损伤后可发现内隔核75的胆碱能神经元变性、死亡，隔核和海马内胆碱乙酰化酶的活力显著降低。同侧脑室内注入NGF可以防止隔核内胆碱能神经元的死亡，并明显减轻隔核、海马胆碱乙酰化酶降低的程度。另外，在人脊髓创伤后的尸检材料中观察到前角和侧角内运动神经元表达了神经生长因子受体，结果提示：创伤后神经元通过其胞体表达NGFR获得NGF支持，以维持细胞生存，进而有利于神经纤维的再生。大量实验结果表明，成年哺乳动物中枢神经系统损伤后，其轴突再生能力十分有限，其中一个重要因素是损伤部位缺乏神经营养因子，近年来，人们正在试图通过神经组织移植的方法，同时使用外源性NGF等神经营养因子，以改善CNS损伤部位的微环境，提供神经营养因子，促进移植组织的存活和进行再生修复。Houle等人在成年大鼠脊髓横断损伤模型中，损伤部位进行胚胎脊髓组织移植并植入浸有NGF的硝酸纤维素，六周后发现再生轴突的长度是对照的三倍，证明了外源性NGF可以明显促进神经再生，从而有利于损伤脊髓功能重建。（二） 脑源性神经营养因子与神经损伤修复 脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 是1982年德国神经生物学家Barde等从猪脑中分离出来的12.3kD小分子蛋白质，因BDNF的氨基酸序列与神经生长因子(nerve growth factor，NGF)有惊人的相似性，表现为二者约有55%60%的氨基酸序列同源，其中的6个恒定的半胱氨酸残基可形成维持BDNF、NGF生物活性所必需的三对二硫键,故被归属为神经生长因子家族(nerve growth factor family，NGFf)成员。从调节靶细胞的功能来讲，BDNF比NGF强，如在海马，BDNF的mRNA比NGF的mRNA多出50倍。CNS中BDNF主要在神经元合成，由轴突运输通过与其特异性膜受体trkB结合形成trkB同源二聚体，进而激活了trkB的酪氨酸激酶，诱导受体蛋白质磷酸化。活化的trkB再通过细胞质途径依次激活多种蛋白和酶，使信号从胞质传入核内，最后导致基因表达模式的改变，包括DNA、RNA、蛋白质等大分子的合成，进而引起效应细胞在生理学和形态学上的改变。 脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员，是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活、生长和分化并能保护以上受损的神经元，促进其再生的多肽，在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用。在体内，BDNF可阻止感觉神经元死亡，尤其是阻止神经板来源的睫状神经元死亡；BDNF还可以维持CNS基底前脑胆碱能神经元的存活，在培养16天的大鼠胚胎基底前脑胆碱能神经元中加入BDNF可发现胆碱能神经元数目极大的增加，表明BDNF具有促进基底前脑胆碱能神经元存活的作用。横切海马伞后，注入BDNF可阻止切断轴突的胆碱能神经元的死亡。Lowenstein DH等，研究发现外源性BDNF、FGF还可以促进体外培养的新生鼠海马颗粒细胞（DGCs）存活及分化，TrkB-IgG融合蛋白能阻断BDNF的效果，减少培养的DGCs分化，提示BDNF高亲和力受体TrkB可能介导DGCs的分化。该研究支持BDNF和FGF影响DGCs的发育及生长。体内、外研究表明，发育及成熟的运动神经元对BDNF亦有依赖作用，且BDNF可防止运动神经元的自然死亡，切断新生大鼠坐骨神经后，局部施予BDNF亦可营救92%的脊髓运动神经元。进一步研究还证实BDNF还可支持中脑多巴胺能神经元及GABA能神经元的分化。此外，BDNF可增强突触间经典递质的释放，如在体外实验显示出BDNF可上调胆碱能神经元的乙酰胆碱转移酶(CAT)表达从而加强突触联系。迄今为止，关于BDNF促进损伤神经再生的研究已有不少报道。Frideman B等发现，BDNF和NT-4/5可使轴索切断后的背后外侧核(retrodorsal lateral necleus, RDLN)运动神经元CHAT丢失减少，表明外源性BDNF和NT-4/5可以维持成体脊髓运动神经元神经递质CHAT的含量，将转染BDNF基因的成纤维细胞注入脊髓损伤部位可促进损伤脊髓的形态结构恢复等，提示BDNF在神经损伤后的修复中具有重要作用。 目前，大量体内外研究表明：BDNF可以作用于阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)的基底前脑胆碱能神经元、帕金森病(Parkinsons disease, PD)中脑的多巴胺能神经元，还可用于脊神经和脊神经根损伤的早期治疗。而且BDNF已进入治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)的临床试验阶段。因此，BDNF在以上神经系统疾病的治疗中具有潜在的临床应用价值。尽管研究表明BDNF对CNS疾病治疗有重要作用，但由于其难以通过血脑屏障，故直接通过全身给药，在靶区的有效药物浓度很低。目前为了提高CNS局部的药物浓度，可以通过脑内给药方式，如用微泵装置或缓释微囊将BDNF直接注入脑内，或直接将BDNF基因导入移植细胞内以增加其表达水平；利用载体增加BDNF透过血脑屏障的能力等。如Pardridge等将BDNF与能穿越血脑屏障的载体(如NLA-OX26)结合使其穿过血脑屏障而进入脑内发挥生物学作用；此外，寻找调控内源性BDNF及其受体表达的小分子物质亦是一个新的途径如糖皮质激素可刺激海马内BDNF表达增加。BDNF与其它NTFs联用，可以产生协同作用并减少副作用，如BDNF和CNTF联用可明显减缓ALS中运动神经元的退行性改变，又可减少CNTF的副作用。（三） 神经营养因子-3与神经损伤修复 神经营养因子-3（NT-3）是Ernfors等人于1990年发现的一种分子量13.6KD的碱性蛋白质，根据来源及生物活性首先命名为海马源性神经营养因子（hippocumpus derived neurotrophic factor，HDNF）。因其与NGF和BDNF等NTFs家族成员有相似的一级结构和生化特点，并具有维持神经元存活和促进神经突起生长的生物活性，故把它归属为NTFs家族的成员。但NT-3在一级结构上既有与NTFs家族其它成员一致的保守区又有自己的可变区，故其生物活性既与NTFs家族其它成员相似又有其自身特点。 在神经系统，NT-3主要分布于背根节、脊髓、脑干、小脑和海马等。在非神经系统，NT-3主要分布于脾、肾、肠等处。NT-3的生理功能主要是维持多种神经元存活，体外培养研究表明，NT-3可维持交感、感觉、基底前脑胆碱能和运动神经元的存活。如新生大鼠面神经切断后，局部应用NT-3与对照组相比可防止30%的面神经核运动神经元死亡。而在NT-3基因突变的新生小鼠，由于缺乏NT-3而导致颈上节神经元数目比正常减少50%，这些结果均为NT-3支持神经元存活提供了有力的形态学证据。需要注意的是，NT-3对背根节有独特的作用。 Airaksinen MS等发现，发育期NT-3缺乏不仅使DRG本体感觉神经元丢失，而且使包含降钙素基因相关肽、P物质和硫胺素一磷酸酶活性的小细胞丢失，提示NT-3在调控以上细胞的发育中有重要作用。 NT-3的另一个主要作用是促进神经细胞分化和诱导轴突生长。体外研究表明，NT-3能上调胆碱能神经元乙酰胆碱转移酶的表达、支持中脑多巴胺能神经元分化，以及促进发育和损伤的皮质脊髓束(CST)侧枝出芽。Ringstedt T等发现，过度表达 NT-3的转基因小鼠出生时，其DRG中神经元和轴突的数目增加。 现有的研究表明，NT-3在神经损伤修复中的作用可能至少涉及营养和镇痛两个方面。脊髓损伤后应用NT-3可使3/4萎缩的神经细胞恢复而且存活细胞的数目也明显增加，提示NT-3可以防止继发性神经细胞丢失。McTigue DM等将转移NT-3、BDNF、NGF基因的成纤维细胞移植到脊髓损伤处，发现损伤后第10周，所有移植物中都有轴突生长，NT-3和BDNF者尤其明显且含有更多的髓磷脂碱性蛋白阳性纤维丝，表明在这些移植物中生长的轴突髓鞘形成增加。由此推测能够分泌NT-3的移植物可用于治疗SCI后慢性脱髓鞘病变。另外， Schnell L等发现成体大鼠胸段横断皮质脊髓束（corticospinal tract，CST）后，局部应用NT-3治疗5d后，该束有侧枝出芽，而联合髓鞘相关糖蛋白（MAG）抗体和NT-3一同注入，可见CST的侧枝出芽长度增加。 提示联合应用NT-3和MAG抗体可增加横切的CST再生出芽长度。 Zhou XF等用原位杂交和免疫组化技术研究NTFs与周围神经系统（Peripheral Nervous System，PNS）损伤引起的慢性疼痛综合征之间的关系，发现神经损伤后48h，损伤侧DRG中损伤神经元的卫星细胞表达NGF和NT-3mRNA水平就明显上调。另外，经受损的L5脊神经注入特异性NGF和NT-3抗体，交感神经出芽明显减少。而PNS损伤后慢性疼痛综合征是损伤DRG大神经元周围的交感神经和肽能神经末梢出芽所致，从而提示卫星细胞源性NT-3可能通过减少交感神经出芽发挥镇痛作用。 Malcangio M等研究NGF和NT-3诱导痛阈和P物质释放变化的实验结果也提示，NT-3可能通过抑制P物质样免疫活性物质释放从而发挥镇痛效应。 随着对NT-3神经保护作用的研究日益深入，一些学者已试图将NT-3应用于临床实验，由于NT-3不能透过血脑屏障，只能局部给药，而在损伤局部持续给药必须通过反复鞘内、室管膜内注射或借助于侵袭性微管装置，不利于临床应用。近年，Sterne GD等用浸过NT-3的纤维连接蛋白材料（可结合并释放生物活性NT-3）植入成鼠坐骨神经缺损处，释放NT-3获得成功，为解决NT-3给药途径问题带来了希望。最近，Dijkhuizen PA等观察发现NT-3转基因豚鼠因NT-3合成增多而致培养中的DRG轴突过度生长，此效果持续20d，它可以使NT-3在损伤局部持续稳定表达，为神经损伤治疗提供了一个有用方法。可以推论，在不远的将来，NT-3作为一种促进神经再生的NTFs会有较好的临床应用前景。（四） 神经营养因子-4与神经损伤修复 神经营养因子-4(Neurotrophin-4, NT-4)是于1991年在蝰蛇和非洲蟾蜍中发现的低分子量碱性蛋白，含有130个氨基酸，分子量为14KD，属于神经生长因子家族的成员。随后发现的NT-5，经分析鉴定被认为就是NT-4。因此，NT-4也被称为NT-4/5。研究表明，NT-4生物学作用的发挥是通过与细胞膜表面特异性酪氨酸激酶受体trkB结合从而启动细胞内一系列反应来实现的。trkB还可分为高亲和性trkB145和低亲和性trkB95两类。富含激酶长片段的trkB145在中枢神经系统大多数神经元表达。与之相比，缺乏酪氨酸激酶短片段的trkB95主要定位于中枢神经系统非神经元。 NT-4在CNS中分布很广，在运动神经元、脑皮质、基底前脑胆碱神经元与海马、背侧丘脑核、橄榄核、下丘、延髓及小脑Purkinje细胞等均有表达。NT-4对神经系统的主要作用：(1)维持感觉神经元存活。PNS的体内外研究显示，神经营养因子可以促进感觉神经元和交感神经元的存活；在CNS损伤动物模型中，神经营养因子可以促进CNS神经元存活，但单一神经营养因子缺乏或BDNF和NT-4共同缺乏未显示出明显CNS神经元丢失。有研究人员用BDNF/NT-3和NT-4三种神经营养因子缺陷小鼠研究PNS和CNS神经元。结果显示三种营养因子突变小鼠PNS大多数感觉神经元丢失，一些运动神经核中运动神经元减少。提示胚胎发生时，神经营养因子对大多数外周感觉神经元存活是必需的，并可以影响小部分运动神经元的生存。Memberg等研究NT-4对发育期大鼠腰部背根神经节（DRG）神经元的作用，将NT-4加入12.5天的胚胎后发现能增加DRG神经元的存活。有实验表明NT-4可以逆转轴突切断后DRG神经元的变性。(2)促进运动神经元存活，陈彦红等对猫脊髓L6节段免疫组织化学研究表明脊髓神经元有NT-4分布,提示NT-4可能与脊髓神经元的生理功能有关。Vassilis等发现，在新生大鼠面神经切断后，局部应用NT-4可防止45%面神经核的神经元死亡，Junger等发现在体外培养中皮质脊髓运动神经元存活的数量亦依赖于在培养基中加入NT-4的含量。Friedman等切断大鼠坐骨神经，应用外源性NT-4也发现，NT-4可保护因神经损伤而引起的ChAT神经元丢失，且促进背后外侧核（RDLN）神经元重新表达神经营养因子低亲和力受体P75。Piehl等也发现在坐骨神经切断后NT-4能诱导脊髓神经元trkB mRNA表达增加，但其水平在3周内就恢复正常。这些结果提示应用外源性NT-4治疗脊髓损伤有一定效果。(3)促进前脑胆碱能神经元和纹状体GABA能神经元的存活，Averbuch-Heller等在培养16天大鼠的胚胎基底前脑胆碱能神经元中加入NT-4后，发现胆碱能神经元数量明显增多。表明NT-4对基底前脑胆碱能神经元存活和分化关系密切。体外实验发现NT-4可以保护培养的胎鼠海马和皮质神经元免受由葡萄糖缺少引起的损伤，在培养物基内加入NT-4,神经元对由钙离子载体23187诱导产生的毒性有很强的耐受力,说明NT-4可以减轻钙离子介导的神经元损伤,从而发挥神经元保护作用。Ardelt等用生后3-4天Swiss-Webster大鼠的纹状体切片进行培养，在培养第一天和第五天向培养基中加入人重组体NT-4，在培养一周后发现，NT-4培养组的神经元数量是对照组的近四倍，而NT-3和BDNF则没有明显作用。有学者认为NT-4可能是通过调节钙离子水平从而挽救神经元变性坏死。之外，最近Hughes等在实验中还发现纹状体投射神经元轴突切断后，NT-4能减少导致神经元变性凋亡的c-jun基因的表达。提示NT-4的作用机制还可能涉及第三信使。(4) 促进多巴胺能神经元的存活。Human.C等研究发现NT-4在无神经胶质细胞的培养物中能促进黑质多巴胺能神经元存活与分化, NT-4很可能是与黑质神经元trkB受体结合而不是通过支持细胞发挥这种效应的。(5)NT-4还可以促进神经细胞的分化和调节突触可塑性。Braun等发现NT-4能诱导移植脊髓神经元轴突数量和长度增长、每个肌纤维终板数目的增加和围绕在脊髓移植物周围的神经支配纤维面积的扩大。提示NT-4可增强脊髓运动神经支配潜能。由于NT-4在体内外具有促进多种神经元存活的功能，因此，如何提高损伤后内源性NT-4的表达，以促进神经损伤修复可能是新的研究方向。 NT-4作为NGFs家族中的一员，其作用越来越受到重视。目前已有了一些关于NT-4在动物中枢神经系统退行性疾病模型（如Alzheimers disease， Parkinsons Disease等）中对神经元的变性有保护作用的报道，且一些研究者也探索了将NT-4作为治疗应用于动物周围运动神经元损伤模型和培养胎儿脊髓神经元的生长中，并获得了一些有益资料。但在制成纯化因子、解决给药途径，通过血脑屏障等方面尚需进行探索和研究。随着对NT-4在神经系统中的作用了解的不断深入，NT-4有可能在神经系统的损伤修复治疗中发挥其重要作用。 大量研究表明NT-4对中枢神经系统损伤及退行性疾病模型中对变性的神经元有保护作用，最新发现，NT-4可以调节突触可塑性促进神经肌接头的形成，并能诱导正常运动神经元侧枝出芽，因而NT-4对肌萎缩性脊髓侧束硬化症等运动神经元疾病有潜在的治疗作用，但由于NT-4有不能通过血脑屏障和生物利用度低等问题尚未解决，因此有必要进行更深入的研究使NT-4得到更广泛的应用。第四节 轴突生长抑制因子与神经损伤修复 成年哺乳动物CNS外伤后，由于轴突不能自发再生，在临床上引起毁灭性的后果。20多年前，神经科学家们的前期工作证实：CNS髓鞘不允许轴突生长的特性使神经再生失败，过去几年人们对CNS髓鞘抑制成分的认识有了巨大的进步，轴突受体对线索的反应和细胞内信号级联反应介导了轴突生长抑制。自1988年首次证实轴突生长抑制性蛋白NI-35/250的存在至今，已发现了髓鞘相关糖蛋白（MAG）、勿动蛋白（Nogo）和崩溃素（Collapsin）等多种抑制蛋白。MAG等抑制性蛋白在发育早期中主要参与引导轴突生长,调控轴突生长方向，协助构建精确的神经网络。而在成体，损伤可以诱导它们重新表达或表达增加，对CNS再生造成不利的影响。Nogo仅由中枢神经的少突胶质细胞表达，可以引起生长锥崩溃，抑制神经突起生长。目前，人类的Nogo基因已被分离并克隆表达出NogoA、NogoB、NogoC三种不同结构的蛋白。NogoA主要分布于少突胶质细胞的内质网、高尔基体和细胞表面。目前很多研究者认为，NogoA与先前发现的轴突抑制蛋白NI-250/bNI-220相对应，研究观察到NI-250的抗体IN1可中和NogoA的抑制轴突生长的作用，明显诱导神经纤维在中枢神经系统白质内生长。 令人惊奇的是，Nogo和OMgp（少突胶质细胞髓鞘糖蛋白）在包括新皮质投射神经元在内的许多神经元中也强烈表达，CNS损伤区边缘的神经元Nogo表达增加。在发育期，生长的轴突也表达Nogo，提示Nogo可能有介导轴突生长的作用。尽管Nogo、MAG、OMgp缺乏序列同源性，它们均结合Nogo受体NgR，NgR在大脑皮质神经元强烈表达，其它神经元只表达很少或几乎不表达。神经系统损伤后NgR表达不受影响，其表达和神经再生之间似乎无明显相关性，损伤脊髓的NgR和它的配体相互作用对皮质脊髓束等下行传导束可能是重要的，Nogo抗体IN-1和它的衍生物可以增加部分脊髓切断后功能的恢复，它们使损伤轴突可塑性增加：包括轴突出芽越过中线和损伤区域有限再生。但脊髓完全横断及顿挫伤后未显示出Nogo抗体可以引起皮质脊髓束再生，说明CNS再生需要多因素协同作用，仅拮抗Nogo 其促进CNS损伤后再生的效果是有限的。关于轴突生长抑制因子在神经损伤修复中的作用，还有待更深入的研究。在中枢神经损伤修复策略中，轴突抑制因子的作用不容忽视。第五节 神经干细胞与神经损伤修复 神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是指分布于神经系统的具有自我更新和分化潜能的细胞群。它可以分化成特定细胞参与正常死亡细胞的更新或神经系统损伤修复。近年来研究发现成年哺乳动物和灵长类动物中枢神经系统存在干细胞。由于神经干细胞可以诱导分化成神经元或胶质细胞，移植后能在宿主的神经组织中存活、迁移、分化及整合，并且通过将外源基因导入神经干细胞后可表达特定基因产物促进CNS损伤修复，故神经干细胞研究成为21世纪神经科学研究的热点之一，有极其诱人的应用前景。一、 神经干细胞概述 中枢神经系统的神经干细胞来源于囊胚期的内细胞群，根据NSC对丝裂原反应性的不同，可将其分为两类即神经上皮干细胞（EGF依赖神经上皮干细胞）和神经球干细胞（FGF依赖神经球干细胞），前者依赖表皮生长因子（epithilia growth factor, EGF）发育分化，后者依赖成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)发育分化。1992年，Reynolds首先报导神经球干细胞的存在，之后在许多动物和人类的某些脑区发现有神经球干细胞。两类干细胞均可进一步分化过渡形成多种中间型限制性前体细胞，包括限制性神经前体细（Neuroal-restricted precusors，NRPs），限制性胶质前体细胞(Glia-restricted precusors，GRPs)，少突胶质细胞2型星型细胞（Oligodentrocyte-type 2 astrocytes，O2AS），星形胶质前体细胞（Astrocyte precusor cells，APCs）以及周围神经系统的前体细胞即神经嵴干细胞（Neural crest stern cells，NCSCs）。而后，各类限制性前体细胞分别形成相应的靶细胞群。目前，人们已普遍接受了成体哺乳动物脑内不断有内源性的神经前体细胞衍生而来的新生神经元补充，这种贮备可能会对成体神经损伤或退行性改变有潜在的修复作用。然而，Chen ZJ等研究发现，少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cells ，OPCs）对轴突生长和再生起抑制作用。他们用NG2硫酸软骨素蛋白多糖抗体识别鉴定组织中的OPCs，发现损伤启动OPCs 再次进入细胞周期，并且分化聚集在损伤区域，OPCs 与小胶质细胞及星形胶质细胞共同组成胶质瘢痕。反应性OPCs通过合成生长抑制硫酸软骨素蛋白多糖特别是NG2抑制轴突再生。在CNS发育期，表达NG2的OPCs 使发育中的视交叉和视束与中脑分隔开，表达NG2的细胞还可以抑制再生神经元轴突生长。 细胞因子和微环境可以调控诱导NSC向特定细胞类型分化。研究发现，转录因子N-myc基因转染神经嵴细胞后加速神经嵴细胞的迁移及细胞分化，