Rt-PCR实验步骤和反应体系优化.doc

RT-PCR实验步骤一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l 2、吸头：1ml、200l、20l 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20l吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20l 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） 三、试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？ pH8.0 蒸溜水 1000ml 5TBE （贮存液） 再将5TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水-500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6缓冲液，4保存 五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml溴化乙锭2.5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为1.5g 六、需购置的Rt-PCR材料： （生工. Tel. 2236106.） Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 - -20 DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies - 4 Marker: 10g 0.2g/ml 150.00 科威 （1543. 994. 697. 515. 377. 231） 七、引物合成 正义：5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3 反义：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3 2、par-4: 正义：5-GGGACCTCGGAACTCAAC-3 反义：5-TGTATCTGCCTGGGACTG-3 3、退火温度计算 2（A T） 4（G C） 正反义平均数，再上下波动度（4，或5） 4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好 5、引物稀释： 加DEPC水量为（l） = ? nmol / OD 管上所标OD数100 是为10p mol / l 浓度的引物溶液 八、PCR产物电泳 先将1-10l左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。 九、几个注意点： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？ 2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前，打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 细胞1107 组织100mg 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管） 颠倒混匀10下，室温5分钟 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） 颠倒混匀10下，室温5分钟 4，离心12000g，15分钟 转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中 加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟 4，离心12000g，10分钟 弃上清 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml 4离心7500g，5分钟 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20l（10l-20l） （可在55-60水中，10分钟助溶） 注： 1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年 两步法RT-PCR （第一步：逆转录反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23l(11.5l) Oligo(dT)15 0.05g/l 4l(2l) 0.005g/l （稀释10倍后用） 混匀，离心，70 5min 立即冰水浴，稍离心 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5 8l (4l) 1 dNTP 10mM 2l (1l) 0.5mM RNasin 40U/l 1l (0.5l) 20 M-MLV 200U/l 2l (1l) 200U 总体积40l（20l） 混匀，离心，42 60min 95 10min（破坏MLV） 4保存 两步法RT-PCR （第二步：PCR反应） 总体积20l(50l) 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10 2l (5l_) 1 MgCl2 25mM 1.2l (3l) 1.5mM dNTP 10mM 0.2l (0.5l) 200uM 上游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol 下游引物 10pmol/l 0.3l (1l) 10pmol cDNA模板 X (?) (1-10l) DEPC水 20l-4.3l-XTaq酶 2.5U/l 0.3l (1l) 2.5U/l 混匀 97，5分钟 立即冰水浴 混匀 95 5分 预变性 94 30秒 变性 X 40秒 退火 72 30秒 延伸 72 7分 终末延伸 28-36循环，4保温 三、电泳： 加1-10l PCR产物 溴芬兰（1-2.5l）混匀，加样，电泳。 注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20保存，操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。RT-PCR反应体系的优化增加反应体系的灵敏度：1. 分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000g离心5分钟。2. 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶：在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。 SuperScript逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScrip显著提高了长RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10Ci的-PdCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。3. 提高逆转录保温温度：较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。4. 促进逆转录的添加剂：包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20的甘油或10的DMSO而不影响SuperScript或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在SuperScript逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4，这不足以抑制PCR。5. RNaseH处理：在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScript或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。6. 小量RNA检测方法的提高：当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250g/ml。在使用SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScript的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。增加RT-PCR特异性1. CNDA合成：第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能