孢子捕捉仪在苹果病虫测报的应用方法.docx

孢子捕捉仪在苹果病虫测报的应用方法对于气传性的植物真菌病害来说，空气中的病原菌数量与病害的发生程度有十分密切的关系。明确环境因子与空气中病原菌数量之间的动态关系，了解病害发生的初侵染菌量或再侵染菌量，对于认识病害的流行规律和提高病害的预测预报水平有十分重要的作用。同时，也能够有助于制定最佳的防治时机，有效地进行病害的控制和管理，减少化学农药的不合理使用及其带来的环境污染问题和延缓病原菌抗性的产生。当前，研究空气中的病原菌浓度及变化动态的方法主要有水平玻片法、垂直或倾斜玻片法或垂直圆柱体法降、孢子捕捉仪(吸入型孢子碰撞捕捉器)法141以及移动式孢子捕捉器法。但是前两种方法的孢子捕捉效率和效果容易受到气候变化特别是降雨和风速的影响；而移动式孢子捕捉器则主要用于病原菌的取样，不能实现对病原菌数量的连续监测。因此在对空气中病原菌的动态监测上，目前应用最多的是托普云农孢子捕捉仪。1.孢子捕捉仪的组成及特点大多数此类捕捉器是采用真空泵或其他空气驱动装置把孢子吸入捕捉器内，通过碰撞着落到一个运动的收集表面。通常由遮雨板、风向标、捕捉盘、定时钟、进气嘴、空气驱动装置如真空泵、捕捉仓、支架等组成。孢子捕捉器工作时，空气驱动装置使捕捉仓内形成负压，外面夹带着孢子的空气就由进气嘴吸入捕捉仓内，孢子就被吸附到捕捉盘上的勃性捕捉带上，这样就完成了对孢子的捕捉。研究表明，与以往的捕捉方法相比，利用托普云农孢子捕捉器的捕捉效率更高。和其他孢子捕捉设备相比托普云农孢子捕捉器主要有以下几个特点：由于安装了遮雨板、风向标以及在捕捉仓内进行孢子捕捉，能够减少气候变化对捕捉效果的影响；采用自带的空气驱动装置提供动力，因此可以保证任何时刻吸入的空气体积是一定的，而不随外界条件的变化而变化；进气嘴一般较小，可以避免一些个体较小的昆虫如蚜虫的进入；通过安装定时钟，能够确保一定的时间后替换捕捉盘，同时捕捉盘能够随时间的推移而移动，这样每一时段空中孢子的数据就记录在捕捉带不同的区域上，从而可以实现对病原菌数量的连续监测。2.托普云农孢子捕捉仪在植病流行学研究中的应用2.1空气中病原菌的空间动态及其影响因素病害流行的空间动态是病害流行过程中的一个侧面，反映了病害数量在空间中的发展规律，主要研究病害在距离菌源中心一定距离上的发生情况及传播规律问题。当传播条件(气流、风速、寄主植株密度等)相同时，流行速度愈高，传播距离也愈远，传播速度也愈快。另外，传播速度愈快，空间传播范围也愈大，流行速度潜能的发挥也愈大。利用托普云农孢子捕捉器来了解空气中病原菌的空间动态，将有助于对病害流行过程的研究。利用Hirst托普云农孢子捕捉器研究表明大风能够减少大麦白粉病菌分生孢子的捕捉量，当一天中最高温度超过19时捕捉量迅速增加，并且在24左右捕捉量达到最大值。用托普云农孢子捕捉器对葡萄白粉病菌分生孢子的飞散动态进行了研究，结果表明空气中分生孢子浓度与风速的变化一致，而与相对湿度的变化情况相反，但是轻微的降雨能够增大空气中分生孢子的浓度。研究了降雨对空气中柑橘黄斑病子囊孢子数量的影响，结果发现降雨2h后，就能够用托普云农定容式孢子捕捉器捕捉到空气中柑橘黄斑病菌的子囊孢子，16h之内子囊孢子的释放量达到最大值，没有降雨时，只能捕捉到少量的子囊孢子；同时还发现随着高度的增加和离侵染源距离的增大，捕捉量均减少。同样利用托普云农孢子捕捉器研究发现在降雨超过2几小时后油菜黑胫病菌的子囊孢子就达到释放高峰，同时释放时间能够持续3天，在同样地降雨条件下，分生孢子释放高峰的出现也只需要几个小时，并且与风向一致方向捕捉到的孢子数要多于其他方向。此外用Hirst孢子捕捉器研究了空气中苹果黑星病菌、马铃薯晚疫病菌、大豆北方茎溃疡病菌以及甜菜褐斑病菌孢子数与气候、病害发生之间的关系。国内不少科研工作者在这方面也开展了工作，使用托普云农孢子捕捉器对苹果斑点落叶病分生孢子的飞散动态进行了研究，结果发现影响其分生孢子飞散的主要气象要素为降雨和风，一天中各小时孢子飞散是不均匀的，总的情况是白天多晚上少，绝大多数孢子飞散是在9：0022：00这段时间，最高峰出现在15：0016：00。采用托普云农孢子捕捉器对保护地番茄灰霉病分生孢子进行逐日、逐小时捕捉，发现出空气相对湿度和孢子飞散呈显著负相关，空气温度和孢子飞散呈显著正相关；一天中孢子飞散主要集中在白天，以14时的飞散量最多。2.2病原菌生活史中不同阶段及其他寄主在病害流行中的作用植物病原真菌的生活史一般分为有性阶段和无性阶段。其中无性阶段产生的无性孢子对病害的传播和再侵染起重要的作用；而有性阶段多出现在发病后期或经过休眠后，有性孢子一般一年产生一代，主要是为了度过不良环境，是许多病害的主要初侵染源。如根据捕捉器的结果研究了西班牙南部地区空气中鹰嘴豆蔓枯病菌子囊孢子的变化动态，结果发现子囊孢子是该地区鹰嘴豆蔓枯病的主要初侵染源，其中绝大多数的子囊孢子在1月初至2月末被捕捉到，这个时期与鹰嘴豆残枝上假囊壳的成熟时期是一致的；有雨的情况下大部分的子囊孢子在白天被捕捉到，其中70%是在12：oo18：00。通过孢子捕捉法，利用托普云农定容式孢子捕捉器研究表明小麦壳针抱叶枯病菌的有性阶段在英国全年都能产生，并且产生子囊孢子的高峰期不一定出现在秋季和早冬，因此有性阶段不仅是秋季病害发生的初侵染来源，同时还能够加重由分生孢子引起的再侵染。使用托普云农捕捉器研究了油菜白斑病子囊孢子在病害流行中的作用，认为子囊孢子能够在更远的距离内传播，而分生孢子只能通过雨水飞溅进行短距离的传播，并且在秋季一旦子囊孢子引起油菜发病，以后病害的流行和发生就仅仅依赖于分生孢子的传播，据此认为子囊孢子是油菜白斑病的初侵染来源，并对该病害在英国的侵染循环进行了修订，同时研究还表明白天捕捉到的子囊孢子数占绝大部分，湿度和降雨是影响子囊孢子释放的关键因子。采用天定容式孢子捕捉器对温室中的矮牵牛花和番茄晚疫病菌进行了动态监测，结果表明，温室中的矮牵牛花上的晚疫病菌可以成为其他牵牛花和番茄晚疫病的侵染源，只是番茄上的病情指数要高于矮牵牛花，与番茄相比，矮牵牛花释放的晚疫病菌数量少，但是持续释放的时间长。2.3病害发生情况与孢子浓度及环境条件之间的关系对于病害预测预报来说，与仅根据调查结果和环境条件建立的预测模型相比，结合了病原物数量的预测模型的结果更准确，在以后将成为病害预测中不可缺少的因子之一。采用定容式孢子捕捉器研究了大蒜叶枯病严重度与空气中孢子浓度及气候之间的关系，结果表明降雨是与空气中孢子浓度关系最直接的因子，其次是相对湿度，温度仅与分生孢子的释放有关，而与子囊孢子的释放无关；一天之中O一6h子囊孢子的浓度最高，而分生孢子的浓度则在1218h时达到最大值；病害严重度与10天前空气中的累计孢子数及气候条件尤其是降雨量、温度和蒸汽压有关。根据英国托普云农公司生产的7天定容式孢子捕捉器研究发现空气中草葛白粉病分生孢子浓度与温度有显著的正相关关系，而与相对湿度及降雨量之间存在显著的负相关性；白天捕捉到的孢子数比晚上多，并且捕捉高峰大约在13点到15点之间；另外病情指数与孢子浓度之间也存在极显著的正相关性。xu等(2000)根据气候因子和托普云农捕捉器所捕捉到的空气中的孢子数，结合病害调查，分别建立了草墓花上灰霉病病情指数与气候因子、病情指数与孢子数以及病情指数与气候因子、孢子数的回归模型，经检验3个模型均达显著水平，其中结合了气候因子和孢子数的模型的预测效果最好，并且基于气候因子建立的模型的预测效果优于基于孢子数的模型。基于气候因子和空气中孢子浓度建立了草薄果实上的灰霉病病情指数的预测模型。3.存在的问题为了确定孢子的浓度，需要对孢子捕捉仪捕捉带上的孢子在显微镜下进行计数，首先要做的就是对所捕获的孢子进行鉴定，目前主要是根据在显微镜下观察到的形态特征来判断孢子的类型，这样就比较容易出现误计。在对孢子进行计数时，最准确的方法是在显微镜下对整个捕捉带观察计数，但是工作量太大，而且需要的时间也太长，一些不会降低准确性但能够减少工作量和检查时间的方法也己建立圈。其中常用的方法有两种：一种是检查单一的纵向移动；另外一种则需要检查12个横向移动，这两种方法都能够反应出空气中孢子浓度的变化动态。但是，无论是哪种方法，仍需要不少时间。虽然定容式孢子捕捉器的捕捉效率较高且不易受到外界环境因素的影响，但是成本较大，费用较高。4.展望随着现代技术特别是分子生物学技术的发展，对空气中植物病原菌的鉴定和定量已取得了一定的进展。通过研究，从托普云农孢子捕捉器(便携式)的收集胶带上的少量饱子中成功地提取了油菜上的2种主要病原菌的DNA，并可以用PCR技术对它们进行检测，其中检测的最低孢子数分别可达到1和10个左右。研究开发出了核果褐腐菌的检测技术，首先建立了RealtimePCR的Ct值与不同数量孢子DNA提取液浓度关系的标准曲线，通过测定来自托普云农孢子捕捉器的样品孢子的DNA浓度，定量估计空气中此病原菌的孢子浓度，它与传统显微镜孢子计数方法的结果一致。因此利用分子生物学技术，在病原菌的鉴定和定量上，不但节省了大量的时间和工作量，而且准确性也能够得到保证。将孢子捕捉技术和现代分子生物学手段结合起来，并根据其他环境条件，在了解植物病害的发生动态和流行规律、提高病害的预测预报水平等方面将具有广泛的应用前景。苹果斑点落叶病是由交链孢侵染而引起的一种世界性分布的气传强流行性病害，常造成严重危害。自20世纪70年代以来，我国一些苹果主要产区相继发生此病，其中以渤海湾和黄河故道两大苹果产区发病尤为严重。特别是近年来随着元帅系和富士系等优良品种在一些地区大面积种植和密植技术的推广，苹果斑点落叶病已成为我国苹果生产上的一种重要病害。该病主要危害叶片，也危害果实，在一个生长季中可以形成多次再侵染，造成大量早期落叶，严重影响树势和翌年产量。由于生长季中的再侵染是由分生孢子经空气传播而形成的，所以明确生长季果园冠层空气中斑点落叶病菌分生孢子的飞散动态及其影响因素，是进一步研究孢子飞散与病害流行的关系以及病害流行和预测的基础。对于该病原菌分生孢子飞散动态，国内外还缺少系统研究，本研究将以逐日和逐小时的孢子捕捉为手段，结合气象数据条件的连续记录，目的是研究明确生长季苹果园冠层空气中斑点落叶病菌分生袍子的发病方位分布及其影响因素，为进一步深入研究该病害的流行及预测奠定基础。1材料和方法1.1试验地点试验地点选在石油物探局安新基地果园，该园面积27.7h，其中苹果占16.7h，梨占1.4h，苹果与梨之间有50m的隔离带。种植的苹果品种主要有富士、红星、青香蕉、烟红蜜等，采取混合种植，往年都有斑点落叶病发生。1.2孢子捕捉1.2.1逐日孢子捕捉采用玻片粘着法，将涂有凡士林的载玻片悬挂在苹果树行中，距地面1.5m，一次放两片，两个载玻片涂有凡士林的面相背，每日上午8：00用两片新片换下前1d的载片，自1999年4月12日至10月10日进行逐日孢子捕捉。将取回的载片用乳酚油作浮载剂盖上盖片，然后放到显微镜下计数斑点落叶病菌分生孢子，计数范围为整个盖片覆盖的部分，两个载片计数的孢子总和为该日的饱子捕捉量。1.2.2逐小时孢子捕捉采用自行研制的孢子捕捉器进行逐小时孢子捕捉，该孢子捕捉器采用透明胶带作捕捉载体，以微型风扇抽气所形成的负压为动力，使外部空气以很强的气流从进气孔进入并冲击胶带，从而使空气中的孢子粘着在胶带表面。此胶带被固定在一石英表的表盘上，该表每7d转1周，每小时转过的圆周长度为2mm。将胶带取回室内后，以乳酚油作浮载剂将其粘于载玻片上，即可放到显微镜下计数孢子。应用此孢子捕捉器可获得每小时的孢子捕捉数量。1.3气象数据的获得在果树行中的一块空地处放置百叶箱，箱体面北背南。在百叶箱中放置温度计、湿度计和干湿球温度表。每日上午8：00用干湿球温度表对温度计和毛发湿度计进行校对、调整。在生长季进行温、湿度的连续记录，每7d换1次记录纸。雨量器放置在果园中一空旷处，其缘口距地面0.7m，记录每次降雨的降雨量，记录标准按照有关文献中的规定。1.4数据分析处理软件一数据分析处理采用DPS软件。2结果与分析2.1生长季苹果园冠层空气中斑点落叶病菌分生孢子飞散动态1999年4月12日至10月10日，在所选果园进行了逐日孢子捕捉，将每天捕捉到的斑点落叶病菌分生孢子数量绘人图1，由图1可看出，自4月12日在园中放人玻片至10月10日调查结束期间，都有孢子飞散，而且每日飞散量各不相同。从总体上来看，生长季前期斑点落叶病菌分生孢子的数量要多于后期，7月份之前（包括7月份）的孢子捕捉量占整个调查期间的91.2%，而7月份以后的孢子捕捉量相对较少，只占调查期间的8.8%。在整个生长季出现了两次孢子飞散高峰，第1次在5月上旬，这次高峰比较小，第2次为6，7两个月份，这次高峰是整个生长季的最高峰。5月上旬之前和进人8月份以后孢子飞散都处于一个较低水平。2.1.1孢子飞散与气象因素的关系生长季苹果园冠层空气中斑点落叶病菌分生孢子的日飞散量与天气情况密切相关，由图1可以看出：在6至7月，每次降雨之后即出现一次孢子飞散的高峰；另外，只要有风，孢子飞散就较多，如6月9日、11日、13日和25日；如果是风雨天气，孢子飞散就更多，如6月17日和7月20日等风雨天的孢子捕捉量就分别达到了454和417个。2.1.2一天中逐小时孢子飞散动态图2是逐小时孢子捕捉情况，图中数值为5月25日至6月5日的平均值。5月25日和31日为降雨日，降雨量分别为0.9和4.5mm；6月1日和2日为多云天气；6月4日和5日有风；其余均为晴天。因此这段时间包括了各种天气类型。由图2可以看出，在一天中各小时袍子飞散是不均匀的。总的情况是昼多夜少，绝大多数孢子飞散是在9：00-22：00这段时间，占全天的87.2%，而9：00以前和22：00以后飞散量相对较少，只占全天的很小一部分，约12.8%。在一天中，15：00-16：00这段时间孢子飞散量最多，平均约占全天飞散量的12%；0：00-8：00的孢子飞散最少，这段时间的孢子飞散量总共占到了全天的6.8%。2.1.3影响一天中各小时孢子飞散的因素从全天动态来（图2）看，孢子的飞散与空气相对湿度的变化趋势呈反对称关系，而与空气温度的变化趋势大致相同。由托普云农孢子捕捉仪的数据相关性分析得出，各个小时的孢子飞散量与空气相对湿度呈显着负相关（r=-0.9309），而与空气温度呈显着正相关（r=0.9294）。由此得到各小时斑点落叶病菌分生孢子飞散量占全天的比例（%）与相对湿度的相关方程：Y=14.920.142X，其中Y为该小时斑点落叶病菌分生孢子飞散量占全天的比（%），X为该小时的空气相对湿度（%）。该方程的相关系数R=0.9309，F=142.8，达到极显着水平（P0.01）。3讨论1）病组织产生的病菌孢子进人空气，除需克服其与产抱器官的联结外，还要突破寄主体表面的一个很薄的空气静止层，突破静止层的方式有两种，一是依靠自身动力（弹射能力），二是借助外力。通过本研究的结果可以看出，对于斑点落叶病菌来讲，其分生孢子主要是通过第二种方式即借助外力，突破静止层而进人上部空气的，这种外力主要是风和降雨。2）本研究结果表明一天中各小时孢子的飞散与空气的温度呈正相关而与其相对湿度呈负相关，实际这是各小时空气流动速度不同的结果，在凌晨至中午这段时间，随着空气温度逐渐上升，空气流动加快，孢子飞散量也逐渐增大；在下午情况正好相反。当然还有另外的原因，凌晨和夜间空气湿度较白天高，这样孢子易附着在病斑上而不易飞散出去。3）在有风的条件下，斑点落叶病菌分生孢子飞散量特别大，然而大风天空气非常干燥，是不利于孢子萌发和侵人的，但是该病原菌的孢子对干燥条件的适应性极强，有研究指出该孢子在干燥的环境中可存活2-3个月，这也体现了生物本身的一种适应。4）降雨时，空气相对湿度很大，叶片表面有水存在，这不利于孢子随空气流动飞散，在这种情况下，雨前一段时间的空气流动加剧以及降雨过程中雨滴的冲击和飞溅所造成的孢子传播可能成为主要形式。如果遇风雨天气，孢子飞散量更大，传播的距离也更远，同时这种雨天又为病菌侵人创造了合适的湿度条件，因此这种传播方式对生长季中病害的再侵染过程更为重要，对病害的流行也更为有利。今后将进一步对生长季苹果园冠层空气中斑点落叶病菌分生孢子飞散动态、气象因素与病害流行之间的关系，明确导致生长季苹果斑点落叶病流行的主导因素，并进而研究该病害的预测预报。一体化智能孢子捕捉鉴别系统介绍托普云农一体化智能孢子捕捉鉴别系统内含高倍显微镜，采用了条形码识别追溯技术、精度限位技术、自动智能化聚焦技术、3G无线传输控制技术等高科技手段，全天候实时采集分析，节省时间，更加人性化，方便人为操作自动模式增加精准定位功能，提高了拍照的清晰度对平台进行优化。 托普云农一体化智能孢子捕捉鉴别系统技术参数1）额定工作电压：DC12V；2）额定功率：60瓦特；3）净重：43Kg；5）防护等级：IP256）数据传输方式：3G网络（可选）、有线网络、GMS；7）气体采样：采集流量120L/分钟，采集时间1160分钟（设置范围）8）电子显微镜放大倍数：物理放大倍数101.5（物镜参数PLL10/0.25160/0，扩展物镜调节范围0.75.5），电子放大倍数约40倍（参考13.3寸显示器）；9）图片采集方式：远程网络平台手动控制采集、设备定时自动采集；10)载玻片可视面积：长*宽（Cm）5.2*0.7设置范围：定时启动，24时制，可以任意设置24小时开启时间；拍照数量：1-255张；抽气时间：1-9600秒载玻片：一次可以添加200片，最长可以使用200天，每天一张；其他植保仪器：自动/太阳能虫情测报灯、孢子捕捉仪、线虫分离器、太阳能杀虫灯、点滴仪、诱虫黄板、养虫板托普云农一体化智能孢子捕捉鉴别系统功能特点：孢子自动捕捉自动拍照24小时无间断自动