手性农药对映异构体的拆分及在动物组织中的残留分析方法.doc

项目研究意义目的：以高效液相色谱手性固定相法建立6种手性农药对映异构体的拆分及在动物组织中的残留分析方法，手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、两种除草剂乳氟禾草灵和乙氧呋草黄及两种杀菌剂甲霜灵和己唑醇。通过口服和注射两种途径对大鼠和家兔进行手性农药对映体的选择性代谢行为研究。测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体的选择性代谢及残留行为，代谢产物通过质谱进行确证，探讨代谢机理。研究手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为能更加真实的反映相关农药污染对人类健康的影响，为其污染治理、指导合理用药、制定相关的分析方法及残留限量等标准提供依据，将农药污染等副作用对人类的影响减至最小。关键词手性农药；代谢；选择性；动物（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）农药是防治病、虫、草、鼠害不可缺少的重要手段，为农业的增收作出巨大贡献，但是由于农药的大量使用，对环境造成了严重的污染，直接或间接地威胁了人类的健康。绝大多数农药是有机化合物，普遍存在着手性现象。在以往的研究中，通常不区分手性农药的对映异构体，正因如此，对农药的风险评估所依据的数据是不完全真实的。由于立体化学的发展,手性现象已引起了人们的广泛关注，手性是指呈镜像而不重合的关系，如同人的左右手互为镜像但又不能重合。手性化合物中存在两种或以上不同构象的分子，这些分子以镜像关系成对的存在，互称为对映异构体。医药、农药等研究已深入到分子立体异构领域，尤其是在医药方面，主要表现在大量手性药物单一异构体的研究和使用上，很多手性药物对映体的性质已研究的比较清楚。在农药领域相关方面的研究相对滞后，手性农药的各种性质通常是以外消旋体的形式加以研究的，缺乏单一对映体的详细数据。手性农药对映异构具有完全相同的化学和物理性质，但在生物体系中可能存在截然不同的生物活性、毒性、毒理及代谢途径等，如具有一个手性中心的多虫畏、盖草能、敌草胺、甲霜灵等生物活性主要集中于其中的1/2对映体，而另一个对映体几乎无效；通常生产的氯菊酯、速灭杀丁等只有1/4是高效体,其余3个则为低效或无效成分；氯氰菊酯、溴氰菊酯和丙烯菊酯等,仅1/8是高效体,其余的7个异构体则相对低效或几乎无效。在目前通常使用的农药中，约25具有手性，其中只有少数品种具有光学纯的商品，而且主要集中于菊酯类杀虫剂，绝大部分是以外消旋体的形式销售和使用。投入使用的外消旋体中的低效或无效异构体不仅不能有效地防治作物病虫草害，浪费人力物力，而且污染环境、降低农产品质量，还可能产生毒副作用，引起药害，严重影响了人类的健康。目前，通常通过直接测定农药对高等动物的毒性、毒理及体内代谢途径等来评价对人类可能造成的影响，在这些研究中农药的手性特征往往被忽略，同时对映体间不同的毒性、毒理及代谢方式因而也被忽略。农药可以在使用过程中直接或残留于农产品、环境介质中间接的进入人体，由于人体内的很多酶、蛋白等都普遍存在着手性，是一个手性环境，因此手性农药对映体进入人体后可能存在着选择性的代谢行为。这种选择性表现在几个方面，一方面，农药外消旋体发生了构型转化，原本为1：1的两种对映异构体，经过代谢作用，某种对映异构体可能占有绝对优势；或者，光学纯异构体可能发生外消旋化或完全转化成另一种对映异构体；另一方面，其中一种优先被代谢成其它代谢产物，另一种则相对稳定而不被代谢或代谢较慢。目前在进行手性农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。这种对映体的代谢及转化行为使得对手性农药的研究变得更为复杂。研究手性农药对映异构体在动物体内构型转化或优先代谢等行为能够更真实的反映其对人类健康的影响情况，这种影响有几个方面的可能，第一，在以往认为毒性大、三致作用强、代谢缓慢的手性农药中，部分手性农药的副面作用可能是由非活性的对映体所造成的，而真正起作用或活性更高的异构体的副面影响相对要小的多，如早期使用的DDT及其类似物。针对这种情况通过合成、生产及使用单一异构体会克服以往的缺点。第二，非活性或活性低的对映体优先被代谢或转化，从而降低了副作用，这种可能是人们所希望的，而且若能探知导致这种优先代谢或转化的原因，将对指导手性农药的不对称合成和光学纯手性农药的生产具有非常重要的意义。第三，一种异构体代谢转化为副面作用更强的另一种异构体，这种情况下其风险要比毒理毒性实验测得的结果高的多。但是目前有关手性农药的相关方面的研究还基本是空白，不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢就显得十分重要。大量的科学试验表明手性医药在人及动物体内的代谢确实存在着立体选择性，如Omeprazole 在人体内R-体比S-体更容易代谢； Carvedilol 经选择性代谢后在人的血浆中S-体的浓度比-R体高，人体对nisoldipine S体的代谢比R-体快8倍,相关方向的研究非常多。对手性农药在动物体的选择性代谢行为的研究非常少，只是很少数的几篇报道，而且相关的报道主要是有机氯农药在动物体及人体内的选择性的残留情况，Kallenborn R 测定挪威河乌蛋中有机氯农药的污染，发现-六六六的（+）异构体过剩；Ulrich E M研究-六六六在老鼠中的代谢并发现在脑、血、脂肪等组织中分别具有不同的选择性。Tanabe S曾检测-六六六在鲸鱼体内对映体的相对含量，发现（+）-/（-）-异构体比值在1.6-2.8之间，随个体不同而不同，原因是代谢能力的差异。Wakabayashi K 研究过从老鼠肝脏中提取的谷光甘肽S转移酶对杀冥硫磷具有立体选择性的去甲基代谢作用而产生S-体的去甲基杀冥硫磷。Skopp S 研究了四种毒杀芬类似物在老鼠中的选择性代谢，在肝脏等组织中发现了选择性的代谢。关于其他手性农药的相关研究基本未见报道。构成动物体的酶、蛋白、氨基酸、多糖等都具有手性，决定了动物体内的手性环境。当手性农药进入动物体内必定会受到酶系等很多生物因子的影响，对映异构体代谢等行为会发生复杂的变化。人们已认识到农药及残留农药的原体、代谢物对人类健康的影响，但由于手性农药的特殊性，其对映体的选择性的转化及代谢行为还是一个人们比较陌生的领域，对映体污染还未引起普遍的关注。研究手性农药在动物体内的选择性代谢行为具有非常重大的意义。本课题拟选择常用的6种手性农药，马拉硫磷、水胺硫磷、乳氟禾草灵、乙氧呋草黄、甲霜灵和己唑醇，首先基于高效液相色谱手性固定相法建立其对映体的手性拆分方法及在动物组织中的残留分析方法，进行其在动物体内的选择性代谢和残留行为的系统性研究。国际上至今尚未开展手性农药在动物体内的选择性代谢的系统研究，因此本项目的研究意义在于：（1）开展手性农药选择性转化、代谢、残留的系统研究工作，填补这一领域的许多研究空白；（2）发展相关农药的手性分离和代谢分析方法；（3）通过对手性农药在动物体内的选择性的代谢、残留行为研究及机理探讨，对相关手性农药的生产、使用、手性农药法规的制定提出建设性的意见；（4）为相关手性农药的风险评估和污染治理提供依据，指导合理用药，减少污染，降低对人类健康的影响。主要参考文献1 R. M. Orlando, P. S. Bonato. Journal of Chromatography B, 2003，795：2272352 M.P. Marques , N.A.G. Santos , E.B. Coelho , et al. Journal of Chromatography B, 2001，762 ：87953 F. Behn , S. Michels , S. Laer , et al. Journal of Chromatography B, 2001，755：1111174 K. Wakabayashi, M. Hizue, H. Nozaki, et al., Journal of Pesticide Science,1994, 19（4）：277-284 5 R.Kallenborn, S.Planting, J. E.Haugen, Chemosphere. 1998, 37: 2489-2499 6 S. Skopp, M. Oehme, H. Drenth, Chemsphere, 2002, 46: 7, 1083-10907 E. M. Ulrich, K. L. Willett, G. A. Caperell, et al. Environmental Scidence and Technology, 2001, 35: 8, 1604-1609, 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究内容（1） 基于以往对数十种手性农药的分离、分析基础，利用高效液相色谱手性固定相法建立并优化6种选定农药对映异构体的手性分离、分析方法。（2）建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法。（3）对试验动物进行饲养， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药的浓度进行试验筛选。（4）测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。（5）通过质谱确证代谢产物。（6）进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究，加以比较，探讨代谢机理。研究目标：（1） 建立所选定的6种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体在动物组织中的残留分析方法；（3） 测定手性农药对映异构体在动物体内的变化趋势，研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及残留行为；（4） 通过对不同的手性农药对映体在不同动物体内及不同的组织中的选择性代谢行为差异的比较，探讨选择性转化、代谢及残留机理；（5） 为制定手性农药相关的法规提供依据，指导合理用药，提高安全性，减少污染。拟解决的关键问题： (1) 手性农药光学对映体的分离。由于对映体具有相同的物理化学性质，将其分离一直是相关研究的难题。结合以前手性农药的拆分基础，建立选定手性农药的分析方法，即ER值的测定方法，是进行手性农药对映体残留行为研究的基础。 (2)手性农药使用浓度的确定、测定样本的收集。由于研究对象是活体的动物，农药使用的浓度若太高会导致死亡，若太低则检测困难；其尿液、粪便、血样的收集相对较麻烦。(3) 动物组织中的手性农药的提取、净化和检测。本项目检测残留于动物组织的手性农药要依赖于高效液相色谱法，与传统主要用于残留农药分析的气相色谱法（GC）相比，对提取、净化尤其是检测方法的要求要高的多。(4)机理讨论。3、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）（1） 在以往研究和文献的基础上，合成并优化合适的手性固定相，利用高效液相色谱法发展建立所选手性农药对映体的分离分析方法；至目前为止，已用纤维素、淀粉等衍生物手性固定相直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道，我们已经成功的拆分了20余种手性农药并建立了相应的分离分析方法。（2） 参考传统农药的残留分析方法，发展手性农药在动物组织中残留的提取、净化方法。我们所在的实验室是国内最早开展农药残留研究的单位。在几十年的相关研究中，已经积累了大量的农药残留采样、制备、保存、提取、净化、检测和确证方法。本研究的重点分析数据是手性农药对映异构体的相对比值（ER），试验中可通过样本富集、高效液相色谱法检测等手段获得蔬菜中残留手性农药的ER值。（3） 饲养试验动物，待达到一定重量以后选择健康状态良好的个体进行试验。参照已有的相关农药的毒性数据及试验确定用药的浓度，对于水溶性差的农药辅助于乳化剂饲喂或注射。将试验动物分组，喂药的老鼠每组6只，包括两个平行重复，每个平行重复3只（考虑到通过口服方式进入所研究的样本中农药的浓度较低，将平行中3只动物的待测组织分别合并，提高农药的含量），注射农药的老鼠和家兔每组3只，即3个平行重复，每个平行1只，这样可以考察个体之间的差异性。饲养喂药和静脉注射都设6组试验动物，同时设空白对照，喂药后选择适宜的6个时间间隔点收集待测样本，包括尿液，粪便，血样，肌肉，脂肪，心脏，肝脏，脑。（4） 依据建立的样本处理方法及分析方法检测对映体的绝对和相对含量，从而测定对映体的代谢动态及其在各个组织中的对映体的立体选择性，据此来进行手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及其它残留特性的研究。（5） 通过质谱测定所产生的代谢产物，进行定性分析，从而探讨手性农药的代谢机理。4、本项目的特色与创新之处。（1） 部分选定手性农药的对映异构体拆分研究目前尚未见报道；（2） 手性农药对映体的代谢研究目前国内外还未见有系统的研究，其用药、样品收集、样品中手性农药的提取、净化和检测分析还未建立完善的方法；（3） 研究手性农药对映体在动物体内的转化、选择性代谢及选择性的残留行为的新颖性；（4） 动物对手性农药对映体的选择性的代谢、转化等研究是一崭新的领域，缺乏成熟的试验方法，许多假设、理论都需要更多的相关实验研究来验证和发展。不同种手性农药在不同动物体内及不同组织中的选择性的代谢、转化、残留行为的系统研究、差异比较、机理探讨，目前在国内外尚未见报道；（5） 依据手性农药对映体的代谢数据，重新认识相关农药的特性，提供更真实的手性农药毒性毒理数据以及有利于人类健康的用药策略。5、年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）（1）2005年度：查阅有关资料，在以往研究和文献的基础上，发展、建立、优化8种选定手性农药对映体的分离、分析方法；（2）2006年度：完成手性农药对映体在分析样品中的残留分析方法的建立，进行6种手性农药对映异构体在老鼠体内和2种农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等的研究；（3）2007年度：完成另外4种手性农药在家兔体内的选择性代谢及残留行为等研究，比较在各个组织中对映体的代谢动态及ER值，探讨代谢机理。进行项目报告总结，发表相关研究论文。预期研究成果（1） 建立多种手性农药对映体的分离分析方法；（2） 建立手性农药对映体的代谢分析方法；（3） 测定手性农药对映体在所选动物体内的选择性的转化、代谢、残留行为；（4） 探讨手性农药对映体在动物中的选择性代谢机理；（5） 为相关手性农药的风险评估及其污染治理提供真实可靠的依据，为其生产提出建设性的意见，减少相关手性农药对人类健康的影响；（6） 在国内外重要学术刊物上发表相关研究论文812篇，完成博士论文2篇，硕士论文1篇。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础本项目申请者多年来一直从事手性化合物的分离分析及农药残留分析的研究工作，在以往的研究中，合成并制备了多种手性固定相，其性能以基本达到国外同类产品水平，利用这些自制手性柱已成功的直接拆分了百余种外消旋体化合物，而其中近50种化合物的拆分此前尚未见报道。特别是近几年来，从事了大量的手性农药分离及农药残留分析的工作，主持并参与了多项研究项目，这些项目涉及农药质量控制、农药残留分析等内容。申请者在近5年内发表相关研究论文60余篇。 项目申请者所在的中国农业大学理学院设有农药学科点，本学科点1988年被评为国家级重点学科，1996年被列入“211工程”重点建设学科，2002年再次被评为国家级重点学科。本专业拥有“农药化学及农药使用技术农业部重点开放实验室”，为本项目的完成提供了强有力的保障。农药分析与环境毒理教研室几十年来一直从事农药残留分析的研究工作，多年来承担了与农药残留分析有关的国家自然基金项目、国际合作项目以及横向开发项目数十项，发表相关研究论文百余篇。多年的研究工作使得本教研室在农药残留分析方面积累了丰富的经验。这些农药残留分析工作既涉及到了环境（如土壤、水、大气）中的农药残留分析，也涉及动植物等农产品（如蔬菜、水果、粮食、肉、脂肪等）中的农药残留分析。 本项目的参加者均为本室的工作人员，多年从事手性农药分析及农药残留分析的工作，这是本项目能够顺利实施的重要保证。手性农药对映体在动物体内的选择性代谢行为研究立项依据 手性农药对映体具有几乎相同的物理化学性质，但生物活性、毒性、毒理及代谢方式等往往差别较大。目前在进行手性农药的毒性毒理评价时，是将含有两种或两种以上对映异构体的外消旋体农药当作一种农药来处理，没有考虑到对映异构体的构型转化或优先代谢的特性，因此使得传统上对手性农药的风险评估是不可靠的，即在进行手性农药的毒性毒理评价时所得的数据是不真实的。 对映体的选择性代谢及转化行为使得以往手性农药的研究数据不能反映其对人类潜在的影响，因此进行手性农药在动物体的选择性代谢具有重要意义。 n研究内容 n 以高效液相色谱手性固定相法建立8种手性农药对映异构体的拆分方法n 手性农药分别包括两种杀虫剂马拉硫磷和水胺硫磷、三种除草剂乳氟禾草灵、吡氟禾草灵和乙氧呋草黄及三种杀菌剂甲霜灵、三唑酮和己唑醇。 n 建立选定手性农药对映体残留于动物组织中的提取、净化及检测方法 n 饲养试验动物， 通过饲喂和静脉注射两种途径进行所选农药的代谢研究，对喂养和注射农药的浓度进行试验筛选。 n 进行同一种动物对不同手性农药及同一种手性农药在不同动物中的选择性代谢行为的系统研究。 n 测定排泄物包括尿液和粪便、血样中对映体的含量及相对比值（ER值）随时间的变化情况，最终检测肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑等组织中农药对映体的含量及ER值并确定对映体间的转化、选择性代谢及残留行为。 n 通过质谱确证代谢产物，探讨代谢机理。 n 通过各个组织中ER值的比较，确定选择性代谢产生的部位，探讨选择