6DNA的复制与修复.doc

第十四章 DNA的复制与修复从本章起，我们进入高级生化的内容，分子生物学。这几章的内容都是近代生化史上最耀眼的成果，它们都与中心法则有关。中心法则是50年代Creck提出的遗传信息流动之方向的假说，目前其最完善的形式是：转录 翻译 DNA - RNA - 蛋白质复制 逆转录 复制 逆翻译 1.DNA的复制一. DNA复制的一般规律1. 半保留复制由一个DNA分子（称亲代DNA）变成2个DNA分子（称子代DNA），这2个子代DNA分子的一级结构完全一样。在任何一个子代DNA分子中，一条DNA单链来源于亲代，另一条是新合成的，2条链仍然是碱基配对的。- - -+-亲代DNA 复制 子代DNA 实验证明：同位素（15N）示踪技术和密度梯度超离心（CsCl），排除了全保留式和弥散式，见P472或草图，证明了只有半保留方式。- - -+- - -+-2. 需要模板和引物，底物是dNTP，模板是亲代DNA，新链就是以老的DNA单链为模板，按照碱基配对原则合成的。引物一般是短的RNA，也有用蛋白质做引物的（29噬菌体），也有用DNA单链的（回折）。3. 复制的方向（新链延伸的方向）新链按5- 3方向合成的，见P138解释2种延伸方向。要求底物dNTP具有3-OH和5-PPP。证明：正常底物中掺予ddNTP，如果产物是具有3端ddNTP，则是按5- 3方向合成，如果产物中根本没有ddNTP则是按3- 5方向合成，见P138解释，结果是前者。4. 有固定的起始点，通常是双向复制，也有单向复制的见草图。5. 复制是在解链（局部）基础上进行的因此会形成复制泡（眼）或复制叉，见P4746. 复制是半不连续的从起始点开始一条新链是连续合成的，称为前导链。另一条新链是不连续合成的，称为后随链，后随链中的小片段叫岗崎片段，每合成一段岗崎片段都需要引物，见草图。一个复制泡合成一段岗崎片段，见讲义P33。二. 参与DNA复制的酶和有关蛋白质1. DNA拓扑异构酶引起DNA在正超螺旋、B-DNA、负超螺旋之间互变，以便解链。ToPo：消除负超螺旋（原核）、消除正超螺旋（真核），不需要能量。ToPo：引入负超螺旋，需要能量。2. DNA解链酶破坏DNA双链之间的氢键，使DNA解链，需要ATP供能。目前发现4种。解链酶、和Rep蛋白，其中解链酶与后随链之模板结合，Rep蛋白则与前导链之模板结合。3. 单链结合蛋白SSB：Single Strand Binding结合在模板DNA单链上，防止已解链的DNA重新形成双链。4. RNA引发酶负责合成一个小片段RNA，作为新链DNA的引物，此酶就是一种RNA聚合酶，受利福平抑制。5. DNA聚合酶：依赖于DNA的DNA聚合酶 DNA聚合酶是DNA复制最重要的酶，催化反应：模板/引物-3-OH + dNTP Mg2+-DNA聚合酶 模板/引物-dNMP-3-OH +PPi由上式可知底物是dNTP，复制方向是5- 3。在E.coli中，共发现了3种DNA聚合酶：DNA聚合酶、。DNA聚合酶，Kernberg发现，诺贝尔奖得主，该酶是个多功能酶，共具有：5- 3聚合； 3- 5外切，用于自我校对，即当聚合过程中出现碱基配对错误时，该酶聚合活性丧失，3- 5外切活性激活，但矫枉过正，多切除了10，然后又恢复聚合活性；5- 3外切，用于切除引物；水解PPi，加快聚合反应并使之不可逆。DNA聚合酶不是E.coliDNA复制中的最主要酶，这是因为。DNA聚合酶缺陷型的E.coli照样存活。DNA聚合酶：与DNA聚合酶功能相似，但没有5- 3外切。DNA聚合酶：与DNA聚合酶功能相同，其聚合活性比DNA聚合酶高1000倍，是E.coliDNA复制中的最主要酶。真核生物中的DNA聚合酶，共有5种：DNA聚合酶、，除了在线粒体中外，其余都在细胞核中。6. 切除引物以及填补空白的酶当DNA复制达到一定程度之后，引物将被水解掉，由引物酶作用，这样前导链尤其是后随链（岗崎片段之间）就出现了空白，再由填补空白的酶以岗崎片段为引物，合成一段新链，见草图解释。在E.coli中，这2种酶都是由DNA聚合酶来充当的。7. DNA连接酶：将各片段之间形成3,5-磷酸二酯键，使新链都连续完整。三. DNA复制的过程：起始延伸终止1. 起始起始点的识别 引发酶：一种RNA聚合酶 解旋、解链 拓扑异构酶、解链酶、SSB，形成复制泡 引物合成 引发酶、NTP、碱基配对其过程参见讲义P35，注意：应该是双向复制，为了简单明了，只画了单向。2. 延伸：DNA聚合酶、模板、dNTP、碱基配对、3，5-磷酸二酯键、前导链、后随链（岗崎片段），占满一个复制泡，见讲义P35补页。继续解旋解链，继续合成前导链和后随链（每一段岗崎片段都需要引物），见讲义P35补页之反面。在E.coli中这个DNA聚合酶是。3. 终止：没有终止点，直到合成完毕。伴随着引物切除 引物酶：一种RNA外切酶 空白填补 DNA聚合酶，在E.coli中是 片段连接 连接酶见讲义P35补页之反面。注意：这一过程并不是要等到新链完全合成完毕后才进行，而是在延伸时就在进行。另一四. 复制的模型1. 复制模型：质粒、原核生物染色体DNA、真核生物细胞器DNA都是双链环状DNA，它们的复制符合复制模型。其特点是：由一个起始点开始，按照DNA复制的一般过程双向复制，复制过程中形成性状，复制完毕后，2个DNA分子相交，由拓扑异构酶来分开（先切开后连接），见P4752. 滚环复制模型：噬菌体174的DNA是单链环状的，它的复制见讲义P35首先借用宿主（E.coli）中的DNA复制系统（聚合酶、底物等），以自身的DNA为模板（+链），合成一条负链；再由病毒自身携带的A蛋白内切-链，A蛋白并与-链的5端之5-P共价结合，A蛋白又与质膜连接，这样就把+-DNA链悬挂在了质膜上。解下来发生的解链过程就好像是+链沿着-链滚动的过程，并以+链为模板，-链为引物合成前导链，而以-链为模板合成后随链，这样继续滚动，可以无止境的合成下去。五. 真核与原核生物DNA复制的比较1. 真核、原核生物DNA复制过程基本相同，都有起始、延伸、终止三个阶段。2. 真核生物的染色体DNA要与组蛋白组成核小体（串珠结构，见草图），要先解聚，裸露出DNA，因此，起始过程比原核生物复杂。3. 真核生物DNA复制时，有多个起始点，原核生物只有一个，虽然从每个起始点看真核的速度都慢于原核，但总速度却大于原核。4. 真核生物DNA复制时，只复制一代，而原核生物DNA可以多代同时复制，当第二代DNA尚未复制完毕时，第三代、第四代DNA就已经开始复制了，形成多重复制泡现象。见草图。5. 真核生物DNA复制时，组蛋白也同步合成，而且是全保留的合成，原核生物没有。6. 真核生物的DNA聚合酶有5种，原核生物只有3种。六. 2个难题的解决1. 前导链和后随链的齐头并进问题前导链连续合成，只有一个引物，而后随链不连续合成，有很多引物（每个岗崎片段都有一个引物），理论上讲应该合成得慢一些，但实际上是齐头并进的。？DNA聚合酶是个二聚体，后随链的模板链扭转180度。见草图。2. 末端的烦恼中途切除RNA引物后，可以以相邻的岗崎片段为引物来填补空白（见草图解释），但当合成完毕后，每个新链的5端切除RNA引物就再也没有相邻的任何东西做引物，那么，这个空白是如何填补的呢？首先在每个模板的3端连接一段寡聚脱氧核苷酸，然后自身折转做引物，合成一段前导链，直到把空白填满，最后将该段寡聚脱氧核苷酸切除。见草图。2.DNA的损伤和修复一. DNA的损伤：生物体在生长繁殖过程中要经历无数次DNA复制，生物体的细胞与环境也物时不在相互作用，这就难免DNA会出错。1. 碱基错配在DNA复制过程中，新链中的个别碱基逃避了DNA聚合酶的校正作用，没有遵循碱基配对原则与模板严格配对，这就是DNA的碱基错配损伤。其后果是不能正常复制和转录，造成1/2子代变异。见草图2. 嘧啶二聚体DNA受紫外线照射，相邻的两个嘧啶碱基会形成共价键，叫嘧啶二聚体，最常见的是TT导致DNA变形，不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则），常常致死，这就是紫外线杀菌的道理。同样也会造成1/2子代变异。见草图。3. 甲基化烷化剂如化学武器（芥子气，二战中）、煤焦油可导致DNA上碱基的甲基化，例如将GmG，不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则）。4. 脱氨据估计，人的DNA每天脱氨1000次以上，可使CU、AI，导致DNA不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则）。二. DNA的修复：DNA的损伤都会造成DNA该处碱基不严格配对，使DNA分子变形，为修复酶提供了识别依据。1. 直接修复：仅需要一种酶的作用就可以一次性将DNA损伤修复。光复活作用微生物在紫外线照射后，暴露在强烈的可见光下，其存活率明显提高（比放在暗处）。微生物细胞内存在一种光复活酶，能识别嘧啶二聚体，并切开其共价键，使DNA恢复正常，该酶受可见光激活。平时该酶在DNA上滑动（象火车），识别并附着在嘧啶二聚体处，有可见光即被激活，切开共价键，使DNA恢复正常。人和哺乳动物没有此酶。甲基转移作用甲基转移酶能够识别甲基化的碱基，如mG，它将甲基转移到自己身上（-SH），修复了DNA但牺牲了自己-自杀性底物又一例子。2. 间接修复：需要多种酶的共同作用才能将DNA损伤修复，这些酶包括DNA内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等，修复过程是切除错误部位、填空、连接。碱基切除修复针对脱氨的碱基，由DNA糖苷酶先把错误的碱基切除，使该处成为无碱基位点（AP位点），再由AP核酸内切酶和外切酶共同作用，将AP位点切除，然后由DNA聚合酶填空，DNA连接酶连接。脱氧核苷酸切除修复由DNA内切酶、外切酶共同作用切除损伤部位的脱氧核苷酸，然后由DNA聚合酶填空，DNA连接酶连接。3. 重组修复这是一种通过复制来修复损伤的方式。见讲义P38草图。3.逆转录与RNA的复制一. 逆转录：以RNA为模板合成DNA的过程，只有RNA病毒（如艾滋病毒）具有此种现象。1. 逆转录酶：由RNA病毒自身携带的酶，是个多功能酶，具有三种功能依赖于RNA的DNA聚合酶：以RNA为模板合成DNA，叫互补DNA（cDNA）RnaseH：水解杂交分子中的RNA依赖于DNA的DNA聚合酶2. 逆转录过程：RNA病毒自身携带有逆转录酶以及引物tRNA，注入到宿主细胞后，发挥第一种功能，以RNA为模板、tRNA为引物，合成cDNA；接着发挥第二种功能，水解杂交分子中的RNA；最后发挥第二种功能，再合成一条DNA单链。这样就把RNA上的遗传信息传递给了DNA，这个DNA可以整合到宿主细胞的DNA中，到时候转录出病毒的RNA、tRNA，翻译出病毒的逆转录酶和蛋白质外壳，包装成完整的病毒。二. RNA的复制仅出现在RNA病毒中，需要由病毒RNA编码的RNA复制酶，即依赖于RNA的RNA聚合酶，由于病毒的结构不同，RNA的自我复制也有区别。1. 正链RNA病毒这种病毒只含有一条RNA单链，具有RNA复制酶和壳蛋白的编码信息，称为正链，注入到宿主细胞后，它可以充当mRNA，翻译出RNA复制酶，又可以充当模板合成一条互补的RNA单链，称为负链，再以负链为模板合成正链。适当的时候翻译出壳蛋白，组装成完整的病毒。2. 负链RNA病毒这种病毒只含有一条RNA单链和