2、蛋白翻译后修饰-泛素化(1).docx

分子机制研究套路（二）蛋白翻译后修饰-泛素化课题：蛋白A调节蛋白B泛素化和降解的研究1概念介绍：大多数蛋白均需进行翻译后修饰来扩增蛋白质组的数量，调节蛋白质的稳定性、分布和功能。翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、亚硝基化、氧化等等。泛素化是在蛋白质翻译后,通过将泛素分子结合到靶蛋白上,形成多聚泛素链,带有多聚泛素链的靶蛋白可被26 S蛋白酶体识别、降解。泛素是76个氨基酸的多肽片段，包含7个赖氨酸残基，允许同时发生聚泛素化反应。在赖氨酸-48聚泛素化会导致其通过28S蛋白酶体降解。然而赖氨酸-63可以改变细胞的功能，包括运输和DNA修复。可见，单一的泛素化会依据其作用位点的不同而产生不同的结果。它和泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和蛋白酶体组成了泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）。UPS是细胞内非溶酶体途径蛋白质降解通路，不仅降解变性、异常或起短暂作用的蛋白质，而且能降解转录因子、内膜蛋白和细胞周期蛋白等天然蛋白，对于维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡和控制细胞周期等过程有重要的作用。UPS还可作用于转录因子及体内的某些信号传导通路，并参与细胞凋亡、主要组织相容性复合体抗原递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等多个细胞生理活动，对维持细胞正常生理功能具有重要意义。2示意图：图1 UPS的发生依赖于三种酶的参与。E1通过硫酯键将E1酶半胱氨酸与泛素分子连接在一起，其能量来源于ATP水解作用；E2与泛素蛋白连接于激活的半胱氨酸位点；E3负责将泛素化蛋白与靶蛋白结合在一起，3研究思路：3.1 蛋白A降低蛋白B的表达量33.1.1 蛋白A介导蛋白B降解33.1.2 蛋白A降解蛋白B的特异性33.1.3 蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性33.1.4 蛋白A调节蛋白B稳定性43.2 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统43.2.2 蛋白B降解位于蛋白酶体系统43.2.3 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统53.3赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点53.3.1 蛋白A介导蛋白B泛素化53.3.2赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点53.4 蛋白A氨基端与羧基端在蛋白B降解中的作用63.4.1 蛋白A氨基端与蛋白B降解63.4.2 蛋白A羧基端与蛋白B降解63.4.3 蛋白A羧基端与蛋白B泛素化63.1 蛋白A降低蛋白B的表达量3.1.1 蛋白A介导蛋白B降解蛋白A是泛素蛋白酶体系统中的一个调节分子。前期研究结果显示，蛋白A可以调节蛋白B所在家族的某些分子的的泛素化和降解。为探讨蛋白A对于蛋白B的调节方式，构建质粒蛋白A-V5和蛋白A-HA，并将两种质粒分别转染HEK293细胞48小时后，收集细胞，采用Western blot方法检测其蛋白表达水平，结果如图3.1显示，两种质粒转染HEK293后，均可以下调HEK293细胞中内源性的蛋白B的表达。3.1.2 蛋白A降解蛋白B的特异性为探讨蛋白A介导蛋白B降解的特异性，我们将其他三种蛋白A的家族蛋白X、Y、Z转染HEK293细胞48小时，采用Western blot方法检测其蛋白B表达水平，结果如图3.2显示，X、Y、Z不能介导蛋白B的降解。3.1.3 蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性检测蛋白B在若干肿瘤细胞中的基础表达。选择无内源性蛋白B的表达的细胞系（Cell 1），采用该细胞系检测过表达蛋白B的稳定性。将蛋白B细胞共同转染蛋白A-V5/HA，结果显示，蛋白A介导蛋白B降解呈剂量依赖性。接下来为进一步检测蛋白A可以下调蛋白B的表达，我们设计了三种不同的蛋白A shRNA（#1、#2、#3），并将其转染Cell 1细胞48小时，结果显示，sh蛋白A可以增强蛋白B的表达，进一步验证了实验结果。3.1.4 蛋白A调节蛋白B稳定性为研究蛋白A介导蛋白B降解是否是因为其干预编码蛋白B的 分子的mRNA的表达，本实验采用RT-PCR方法，检测蛋白A对蛋白BmRNA表达量的影响。将HEK293细胞分别转染空质粒或者蛋白A-V5质粒，提取RNA，而后设计蛋白B引物行RT-PCR检测。结果显示，蛋白A对蛋白B的mRNA的表达无影响，证实蛋白A介导蛋白B降解是通过调整其蛋白质的稳定性。3.2 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统3.2.1饥饿状态诱发蛋白B降解在研究蛋白A介导蛋白B降解的过程中，我们发现Cell 1细胞转染蛋白B-V5质粒后，将细胞处于饥饿状态（FBS-free培养基）会降低细胞中蛋白B-V5的表达，并且呈时间依赖性。3.2.2 蛋白B降解位于蛋白酶体系统为研究蛋白B降解旁路，我们将蛋白B-V5质粒转染后的CELL 1细胞培养液中分别加入蛋白体酶抑制剂（MG-132，20M）和溶酶体酶抑制剂（Leupeptin，100M），观察不同时间（0，1h，2h，4h）蛋白B的降解情况。结果显示，蛋白酶体抑制剂可以减弱蛋白B的降解，而溶酶体酶抑制剂对蛋白B的降解无影响，证实蛋白B降解位于蛋白酶体而非溶酶体。3.2.3 蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体系统为探讨蛋白A介导蛋白B降解旁路，我们将HEK293细胞转染蛋白A质粒48小时，细胞培养基中分别加入蛋白酶体酶抑制剂（MG-132，20M；Lactacystin，20M）、溶酶体酶抑制剂（Leupeptin，100M；NH4Cl，20M），培养4小时。采用Western blot方法检测其蛋白B表达水平，结果显示，蛋白酶体抑制剂可以减弱蛋白A介导的蛋白B的降解，而溶酶体酶抑制剂无作用。接下来，我们将CELL 1细胞转染蛋白B-V5和蛋白A shRNA，结果显示，蛋白A shRNA转染细胞减弱饥饿造成的蛋白B降解。结果证实蛋白A介导蛋白B降解位于蛋白酶体而非溶酶体3.3赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点3.3.1 蛋白A介导蛋白B泛素化为研究蛋白A与蛋白B的相互作用，将HEK293细胞共同转染蛋白B-Flag和蛋白A-V5质粒，应用Flag抗体进行免疫共沉淀分析，V5抗体进行Western blot检测。结果显示，蛋白A-V5与蛋白B-Flag相互关联。为进一步验证实验结果，将HEK293细胞转染蛋白A-V5质粒，为防止蛋白质降解，培养基中加入MG-132（20M），之后应用V5抗体进行免疫共沉淀分析，蛋白B抗体Western blot检测。结果显示，HEK293细胞中内源性蛋白B与蛋白A相互关联。接下来，为探讨蛋白A是否可以介导蛋白B的泛素化，将CELL 1细胞共同转染蛋白B-V5质粒和蛋白A-HA质粒，之后应用泛素（ubiquitin）抗体进行免疫共沉淀分析，V5抗体Western blot检测。结果显示，蛋白A过表达会增加蛋白B的泛素因子表达，表明蛋白A介导蛋白B的泛素化。3.3.2赖氨酸XXX位点为蛋白A介导蛋白B泛素化靶位点据研究报道，赖氨酸残基K与泛素化密切相关。为探讨蛋白A介导蛋白B泛素化的靶位点，本研究将蛋白B中赖氨酸三个位点的K分别突变为R，即蛋白BKXXX位点R,蛋白BK183R,蛋白BK184R,并且分别构建质粒蛋白BKXXX位点R-V5,蛋白BK183R-V5,蛋白BK184R-V5。将构建后的质粒分别和蛋白A-V5共同转染CELL 1细胞。结果显示，蛋白B赖氨酸XXX位点位点的突变阻断了蛋白A介导的蛋白B降解，说明赖氨酸残基XXX位点位点为蛋白A介导蛋白B降解的靶位点。接下来，我们探讨蛋白B赖氨酸残基XXX位点位点突变对蛋白A诱导蛋白B泛素化的影响。分别将蛋白B-V5质粒和蛋白BKXXX位点R-V5质粒转染CELL 1细胞，之后应用泛素（ubiquitin）抗体进行免疫共沉淀分析，V5抗体Western blot检测。结果显示，蛋白B赖氨酸XXX位点位点的突变降低了蛋白A介导的蛋白B泛素化，说明赖氨酸残基XXX位点位点为蛋白A介导蛋白B泛素化的靶位点。3.4 蛋白A氨基端与羧基端在蛋白B降解中的作用3.4.1 蛋白A氨基端与蛋白B降解为探讨蛋白A氨基端与蛋白B降解的关系，将蛋白A的氨基端进行切割为N111、N121，之后将蛋白A-V5、蛋白AN111-V5、蛋白AN121-V5质粒分别转染HEK293细胞。结果显示，蛋白A氨基端的切割增加了蛋白A介导的蛋白B蛋白降解。3.4.2 蛋白A羧基端与蛋白B降解为探讨蛋白A羧基端与蛋白B降解的关系，将蛋白A的羧基端进行切割为C450，之后将蛋白A-V5、蛋白AC450-V5质粒分别转染HEK293细胞。结果显示，蛋白A羧基端的切割阻断了蛋白A介导的蛋白B降解，说明蛋白B蛋白与蛋白A结合发生作用的位点位于蛋白A的羧基端。3.4.3 蛋白A羧基端与蛋白B泛素化为探讨蛋白A羧基端与蛋白B泛素化的关系，将蛋白A的羧基端切割的蛋白A C450-V5质粒与蛋白B-Flag质粒共同转染HEK293细胞，之后应用Flag抗体进行免疫共沉淀分析，V5抗体Western blot检测。结果显示，蛋白A羧基端的切割阻断了蛋白A介导的蛋白B泛素化，说明蛋白B与蛋白A结合发生泛素化的位点位于蛋白A的羧基端。4应用案例：Vaughan L, Tan CT, Chapman A,