肿瘤分子病理学研究进展.pdf

肿瘤分子病理学研究进展肿瘤分子病理学研究进展 陈忠陈忠 基因数量片断大小 基因数量片断大小 kb 片断大小 片断大小 Mb 人类基因组 人类基因组 40 0003 000 0003 000 染色体染色体2 000150 000150 中期染色体条带中期染色体条带 500 个个 806 0006 前中期染色体条带前中期染色体条带 1 000个个 403 0003 荧光原位杂交 荧光原位杂交 FISH 分辨率 分辨率11 10 PCR Southern blot1 1 基因组大小和分辨率基因组大小和分辨率 衡量学科发展的重要指标 主要领域 肿瘤 感染性疾病 遗传性疾病 分子病理学分子病理学 分子细胞遗传学技术 分子细胞遗传学技术 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 FISH 多色多色 FISH SKY 和和 M FISH 比较基因组杂交 比较基因组杂交 CGH 基因微阵列 基因微阵列 aCGH 荧光原位杂交 荧光原位杂交 荧光原位杂交 荧光原位杂交 Fluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ HybridizationFluorescence in situ Hybridization FISHFISHFISHFISH 基本原理 应用荧光染料标记探针DNA 变性成 单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交 在荧光显微镜下观察并记录结果 基本原理 应用荧光染料标记探针DNA 变性成 单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交 在荧光显微镜下观察并记录结果 生命科学中的生命科学中的 钓鱼钓鱼 技术技术 Cy3Cy3Cy3Cy3 Cy5Cy5Cy5 Cy5 比值比值比值比值 实验组实验组实验组实验组 实验组实验组实验组实验组对照组对照组对照组对照组对照组对照组对照组对照组 Cy3Cy3Cy3Cy3Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy5Cy3Cy3Cy3Cy3 实验实验实验实验2 2 2 2 样本制备及数据分析 检测样本检测样本 实验实验实验实验1 1 1 1 荧光交换实验 分子遗传学技术分子遗传学技术 PCR SSCP PCR RFLP REAL TIME PCR DHPLC DNA SEQUENCING 除常规的一对引物以外 PCR反应体系中另加有一条能与PCR产物杂交的 荧光双标记探针 该探针5 端标记荧光报告基团 3 端标记荧光淬灭基团 探针完整时5 端报告基团吸收能量后将能量转移给3 端淬灭基团 正 常情况下仪器检测不到5 端报告基团发出的荧光信号 当溶液中有模板时 模板变性后低温退火 引物与探针同时与模板结合 在引物的介导下 沿模板向前延伸至探针结合处 发生链的置换 激 活Taq酶的5 外切酶活性 将探针5 端连接的荧光报告基团从探针上切 割下来 游离于反应体系中 从而受光刺激激发出荧光 切割的荧光基 团数与PCR产物的数量成比例 根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初 始模板的数量 REAL TIME PCR 双脱氧末端终止测序法 利用大肠杆菌DNA聚合酶 以单链DNA为模板 以与模板 事先结合的寡聚核苷酸为引物 根据碱基配对原则将脱氧核 苷三磷酸 dNTP 底物的5 磷酸基团与引物的3 OH末端 生成3 5 磷酸二酯键 这种磷酸二酯键的不断形成 新的互补DNA得以从5 3 延伸 引入了双脱氧核苷三磷酸 ddTNP 作为链终止剂 ddTNP比普通的dNTP在3 位置缺少一个羟基 通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中 由于缺少3 OH 不能同后续的dNTP形成3 5 磷酸二酯键 正在增长的DNA链不再延伸 终止于这个异常的核苷酸处 在4组独立的酶反应体系中 分别终止于模板链的每一个A 每一个C 每个G和每一个T位置上 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 从放射自显影胶片上直 接读出DNA上的核苷酸顺序 DNA Sequencing 分子病理临床应用 分子病理临床应用 Application of Molecular Pathology in Oncology 1 诊断 诊断 Diagnosis 淋巴瘤分子诊断淋巴瘤分子诊断 淋巴瘤不同类型鉴别诊断淋巴瘤不同类型鉴别诊断 套细胞淋巴瘤 mantle cell lymphoma MCL 的母细胞亚型与其它大细胞性B细胞淋 巴瘤 尤其是CD5阳性的弥漫性大B细胞淋巴 瘤 diffuse large B cell lymphoma DLBCL 相鉴别 分子标记 t 11 14 FISH PCR 小细胞性B细胞淋巴瘤不同类型相鉴别 如 FL 黏膜相关淋巴组织 mucosa associated lymphoid tissue MALT 淋巴瘤与MCL 分子标记 t 14 18 t 11 18 t 11 14 FISH PCR 子宫颈癌检查 细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常 细胞癌变细胞癌变 阻止细胞正常凋亡阻止细胞正常凋亡 高危型高危型HPV持续性感染持续性感染 人类染色体端粒酶基因人类染色体端粒酶基因 hTERC 扩增扩增 致癌基因致癌基因E6 E7编码的原癌蛋白表达编码的原癌蛋白表达 TERC 人类染色体末端酶 基因定位在 人类染色体末端酶 基因定位在3q26 3 该基因的扩 增可阻止细胞凋亡 导致肿瘤产生 该基因的扩 增可阻止细胞凋亡 导致肿瘤产生 CIN2 and CIN3区分正常区分正常 ASCUS and CIN1的灵敏度和特异性达到的灵敏度和特异性达到90 预测从预测从 CIN1 CIN2 发展到发展到CIN3的风险 在 的风险 在 52 96 其预测灵敏度是 其预测灵敏度是100 特异性是 特异性是 70 7271例有组织病理学检查结果 组织病理学和hTERC基因异常扩增情况见下表7271例有组织病理学检查结果 组织病理学和hTERC基因异常扩增情况见下表 表 宫颈病理学分类与hTERC基因异常扩增的相关性表 宫颈病理学分类与hTERC基因异常扩增的相关性 病理学分 级 正常 炎症 湿 疣 宫颈上皮 内瘤变 CIN 1 CIN2CIN3浸润癌 hTERC基 因扩增率 6 6 10 6 26 8 65 4 83 0 93 5 病理学分 级 正常 炎症 湿 疣 宫颈上皮 内瘤变 CIN 1 CIN2CIN3浸润癌 hTERC基 因扩增率 6 6 10 6 26 8 65 4 83 0 93 5 除正常和炎症除正常和炎症 湿疣组外 其余各组间湿疣组外 其余各组间hTERC基因异常扩增率均有明显差异 基因异常扩增率均有明显差异 p 0 01 以上结果与国外文献报道相似 以上结果与国外文献报道相似 FDA 美国食品和药品管理局 批准的 无创伤性膀胱癌尿液检测方法 尿核基质蛋白22 NMP22 膀胱肿瘤抗原 BTA 免疫细胞检查法 ImmunoCyt 纤维素和纤维蛋白原降解产物 荧光原位杂交 FISH 具有诊断潜力的肿瘤标记物 如端粒酶 存活素 survivin 透明质酸和透明质酸酶 黏液素 7 核基质蛋白 BLCA 4 微卫星序列分析和单核苷 酸多态性分析等 其临床实用价值还有待于进一步 研究观察 FISH技术与其它非创伤性检查的比较 膀 胱 癌 的 尿 中 标 志 物膀 胱 癌 的 尿 中 标 志 物 Clin Chim Acta 2004 340 57 65 FISH技术与其它非创伤性检查的比较 FISH与尿细胞学检查比较与尿细胞学检查比较 报道者 病例数 敏感度报道者 病例数 敏感度 特异度特异度 尿细胞学检查尿细胞学检查 Glas et al 3444 55 94 Eissa et al 110 58 100 Melissourgos et al 274 44 96 Shariat et al 174 52 91 Shariat et al 191 54 90 卫生部课题 卫生部课题 31 9 94 1 FISH检查检查 Friedrich et al 103 68 89 Skacel et al 120 85 97 卫生部课题 卫生部课题 83 2 94 5 FISH 检查 灵敏度灵敏度远高 于尿细胞学 检查 而特 异度 特 异度接近尿 细胞学检查 Glas et al J Urol 2003 169 1975 1982 Eissa et al Anticancer Res 2003 23 4347 4356 Melissourgos et al Urology 2003 62 362 367 Shariat et al J Urol 2004 171 626 630 Shariat et al J Urol 2003 170 2244 2247 Friedrich et al BJU Int 2003 92 911 914 Skacel et al J Urol 2003 169 2101 2105 Note 卫生部课题卫生部课题 3999例 FISH 血尿鉴别诊断血尿鉴别诊断 移行上皮细胞肿瘤早期诊断移行上皮细胞肿瘤早期诊断 可考虑取代尿细胞学检查可考虑取代尿细胞学检查 移行上皮细胞肿瘤术后评估及治疗后病程监测 肾盂癌鉴别诊断 移行上皮细胞肿瘤术后评估及治疗后病程监测 肾盂癌鉴别诊断 2 治疗与预后 治疗与预后 Treatment and Prognosis 靶向治疗 靶向治疗 Target Therapy 1998 1998 年美国年美国FDA FDA 批批 准第一个专门针对准第一个专门针对 p185p185高表达乳腺癌高表达乳腺癌 的抗体治疗药物的抗体治疗药物 HerceptinHerceptin上市上市 在在 全世界开创了单抗全世界开创了单抗 类分子靶向药物治类分子靶向药物治 疗肿瘤的新时代 疗肿瘤的新时代 HERHER 2 2过表达与生物靶向治疗过表达与生物靶向治疗 免疫组化FISH阴性FISH阳性阳性率 0892565 9 1 51421129 1 2 32741555 9 3 7466089 9 总计1807134242 6 FISH 与与 IHC 相关性研究相关性研究 HER 2检测推荐方法检测推荐方法 免疫组化 免疫组化 IHC FISH 金标准金标准 Standard of Care in HER2 positive Stomach Cancer Approximately 22 of stomach cancer being HER2 Advanced stomach cancer associated with a poor prognosis median survival after diagnosis approximately 10 months Adding Herceptin to standard chemotherapy Xeloda or intravenous 5 FU and cisplatin in patients with inoperable locally advanced recurrent and or metastatic HER2 gastric cancer increased the median overall survival time by 2 7 months to 13 8 months increased the response rate by 34 5 to 47 3 high levels of HER2 associated with greater benefit Herceptin for HER2 positive Stomach Cancer American Society for Clinical Oncology Annual Meeting in Orlando Florida 2009 EGFR基因检测与 EGFR基因检测与 Iressa Tarceva 国外国外 突变型突变型NSCLC用用Iressa Tarceva有效率 有效率 80 无突变无突变NSCLC用用Iressa Tarceva有效率约有效率约10 国外国外 NSCLC病人病人EGFR基因拷贝数增加与基因拷贝数增加与Iressa Tarceva 用药相关性的研究目前正在进行 目前研究结果 用药相关性的研究目前正在进行 目前研究结果 用药有效率用药有效率 拷贝数增加拷贝数增加病人的用药有效率约在病人的用药有效率约在38 9 拷贝数不增加病人的用药有效率约在拷贝数不增加病人的用药有效率约在9 8 K RAS基因检测 与 基因检测 与Cetuxamab 西妥昔单抗 和 西妥昔单抗 和Panitumumab 相关药物及疗效相关药物及疗效 PR 少量少量CR Ref drugsptsWT K RASM K RAS 56panitumumab20817 0 57cetuximab2753 10 58cetuximab10841 0 59cetuximab5927 9 0 60cetuximab3138 1 20 61P C4831 25 6 25 63cetuximab11443 6 0 与与EGFR单抗治疗有关的其它发现单抗治疗有关的其它发现 KRAS BRAF W KRAS BRAF V600E 无效无效 KRAS EGFR配体 EGFR配体 表皮调节素 双调蛋白 W KRAS EREG or AREG高表达 更有效更有效 PIK3CA基因突变 PTEN蛋白表达缺失 耐药耐药 TS DNA合成所需嘧啶核苷合成的关键酶 含氟尿嘧啶类药物 如5 FU 作用的靶酶 TS表达与预后 TS高表达高表达的组织增殖较快 恶性度较高 TS高表达高表达是化疗疗效差 预后差的指标 如TS的表达与结直肠癌 膀胱癌的分期成正相关 TS表达与5 FU类的化疗相关性 低表达低表达大肠癌对5 Fu的敏感性优于高表达高表达组 预后也明显 优于高表达组 有待进一步研究 表达检测 RT PCR IHC TS 胸苷酸合成酶胸苷酸合成酶 与肿瘤靶向药物治疗与肿瘤靶向药物治疗 肿瘤药物敏感 性肿瘤药物敏感 性 Drug Sensitivity 紫杉类和长春碱类化疗药物 作用于微管蛋白异二聚体形成的微管 破坏肿瘤细 胞的有丝分裂 耐药机制 tubulin 表达增加 微管的动态不稳定性增 加 表达增加 微管的动态不稳定性增 加 tubulin变异变异 Beta tubulin与紫杉类和长春碱类化疗药物与紫杉类和长春碱类化疗药物 微管蛋白与耐药 tubulin 的表达程度表达程度影响肺癌肺癌对紫杉醇和长春瑞 滨的敏感性 表达水平的增高与对紫杉醇的耐药性呈正相关 低表达者对紫杉醇敏感性较