新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究.doc

新型抗IgE人源化单克隆抗体的结构与功能研究钱卫珠 【摘要】：研究目的:I型超敏反应又称过敏反应,主要由特异性IgE抗体所介导,由于IgE处于变态反应炎症级联反应的最上游,在变态反应启动和发生过程中发挥着关键作用。1987年,首次提出应用抗IgE抗体治疗IgE介导的过敏性疾病,并描述了具有特异性结合能力的抗IgE单克隆抗体。1993年,Kolbinger等报道了一株鼠源性单抗(MaE11)的人源化过程,该抗体又称为Omalizumab或Xolair,包括大约5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月,美国FDA批准Xolair上市。上市伊始,2004年在美国的销售额即达到1.4亿美元,显示出良好的市场前景。然而Xolair抗体与IgE的亲和常数则仅有26nM左右,当抗IgE抗体的治疗浓度达到IgE基础水平的100倍时,才可结合99%的IgE分子,从而充分抑制IgE分子与FcR相结合。在过敏性哮喘患者体内,游离IgE水平可升高数倍,Xolair抗体的临床用量需要根据IgE的基础水平进行调整,往往需要数百毫克才能达到治疗效果。因此,Xolair的治疗费用十分昂贵,即使在美国也受到医疗保险的限制,目前仅用于吸入激素无法控制的严重病例。国外也有其它医药公司研制了抗IgE的人源化抗体(瑞士Novartis、美国Tanox公司),但由于其临床疗效尚不及Xolair,均于1996年终止了临床试验。 本研究利用哺乳动物表达系统,制备了含有关键的功能表位的IgE片段(Fc2-4),通过杂交瘤技术制备新型的高亲和力抗IgE单克隆抗体,筛选具有竞争抑制IgE与其受体FcR结合功能的克隆。为降低鼠源单抗的免疫原性,对筛选获得的抗体进行人源化改造,比较制备所获抗体及Xolair与IgE结合的亲和力及体外功能,以期从结构上阐明该抗体的作用机制。通过该课题的研究,以期获得亲和力更高的、可望用于过敏性疾病预防和治疗的新型抗IgE人源化单克隆抗体。 研究方法:本课题采用小鼠杂交瘤技术,利用IgE Fc2-4作为免疫原,免疫获得具有竞争抑制IgE与FcR结合功能的鼠源单克隆抗体。为进一步降低单抗的免疫原性,减轻用于人体时的HAMA反应,提高安全性,我们采用计算机辅助设计模拟抗体空间构象的方法,对鼠源抗体进行了人源化改造,对改造成功的人源化单克隆抗体体外功能进行了详细分析,并与Omalizumab的体外功能进行比较。我们应用噬菌体随机七肽库对人源化单克隆抗体的抗原表位进行亲和淘选,从而明确抗体识别的表位,通过分析IgE与其高亲和力受体FcRI的复合物结晶,与抗IgE抗体所识别表位进行比较,从空间结构上解释和阐明抗IgE人源化单克隆抗体的功能学基础。 结果:获得哺乳动物细胞表达的IgE Fc2-4以及FcRIA,通过杂交瘤技术筛选获得具有竞争抑制IgE与FcR结合的鼠源抗IgE单克隆抗体7A5。利用计算机辅助设计的手段,改造获得亲和力和特异性均较好的人源化抗IgE体Hu7A5m18。体外功能分析结果表明:Hu7A5m18可抑制IgE与可溶性及细胞表面FcRI结合,而对结合于细胞表面FcRI的IgE则无影响,Hu7A5m18可以抑制IgE与细胞表面FcRI结合导致的脱颗粒反应。Hu7A5m18介导上述体外功能的EC50仅为Omalizumab的1/10左右。SPR技术检测M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab与IgE的亲和力分别为1.9nM、1.7nM和23.8nM,因此Hu7A5m18人源化改造成功,而且该单抗的亲和力明显高于Omalizumab。 我们应用噬菌体随机七肽库对Hu7A5m18的抗原表位进行亲和淘选,通过对阳性噬菌体序列的分析比对,发现一个非常保守的序列被高度扩增,而这个序列与IgE恒定区C3片段内的391KQR393高度同源。通过分析IgE与其高亲和力受体FcRI的复合物结晶,发现IgE恒定区C3片段内的391KQR393序列在空间上临近IgE高亲和力受体FcRI在IgE分子上的结合位点,从而推论正是由于这种结合位点上的空间位置,使Hu7A5m18可以通过空间位阻抑制IgE分子同高亲和力受体FcRI结合。我们前期的研究结果显示,Omalizumab识别表位定位于IgE-Fc C3的424HLP426,该序列与高亲和力IgE受体结合位点重叠。由于Hu7A5m18识别表位391KQR393在空间上与Omalizumab识别表位424HLP426也临近,这也正是Hu7A5m18能够与Omalizumab竞争结合IgE的结构原因。 结论:本研究制备的新型抗IgE人源化单克隆抗体,具有更好的亲和力以及体外功能,可望解决目前临床应用的IgE抗体活性不高,用量过大的瓶颈,成为过敏性疾病预防和治疗的候选药物。表位淘选获得该抗体识别的新的功能性表位391KQR393,由于其与Omalizumab识别表位424HLP426在空间上的接近,因此Hu7A5m18可以更有效的抑制IgE与靶细胞的结合而导致的脱颗粒反应,从而减轻过敏反应。【关键词】：IgE单克隆抗体表位噬菌体展示肽库【学位授予单位】：第二军医大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R392【目录】：摘要6-8 Abstract8-10 缩略词表10-12 前言12-16 第一部分 抗IgE 单克隆抗体的制备16-51 一、材料16-17 （一） 细胞株、菌株、实验动物16 （二） 试剂16-17 （三） 主要仪器设备17 二、方法17-25 （一） IgE Fc2-4 表达载体的构建17-18 （二） IgE Fc 高亲和力受体FcRIA 胞外区表达载体的构建18 （三） 蛋白表达、纯化和理化性质鉴定18-20 （四） 杂交瘤制备20-21 （五） 抗IgE 单克隆抗体的人源化21-25 三、结果25-48 （一） IgE Fc2-4 及IgE FcRIA 的构建、表达及鉴定25-34 （二） 抗IgE Fc 单克隆抗体的制备、纯化及鉴定34-36 （三） 抗IgE 鼠源单抗7A5 的人源化改造36-48 四、讨论48-51 第二部分 抗IgE 人源化单抗Hu7A5m18 的功能研究51-70 一、材料51-52 （一） 重组蛋白、抗体及细胞系51 （二） 试剂51-52 （三） 主要仪器设备52 二、方法52-57 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 与可溶性FcRI 的结合实验52-54 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 与细胞表面FcRI 的结合实验54-55 （三） Hu7A5m18 与结合于细胞表面FcRI 的IgE 的结合实验55-56 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 引起脱颗粒的功能学实验56-57 三、结果57-68 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 与可溶性FcRI 结合57-62 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 与细胞表面FcRI 结合62-66 （三） Hu7A5m18 不与结合于细胞表面FcRI 的IgE 的结合66-67 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 导致的脱颗粒67-68 四、讨论68-70 第三部分 抗IgE 人源化单抗Hu7A5m18 的结构研究70-85 一、材料70-72 （一） 菌株、噬菌体随机文库及抗体70 （二） 试剂配制70-72 （三） 实验设备、器材72 二、方法72-76 （一） 噬菌体随机肽库筛选Hu7A5m18 抗原表位72-76 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鉴定76 三、结果76-84 （一） 噬菌体随机肽库筛选Hu7A5m18 抗原表位76-80 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鉴定80-84 四、讨论84-85 参考文献85-89 综述89-109 参考文献104-109 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明109-112 致谢112专家共识：外用中成药在湿疹皮炎治疗中的应用2012-12-21 14:59 来源：爱爱医我要评论(热)导读中医中药作为我国传统医药，深受患者欢迎，且常被认为能够治本且不良反应少。外用中成药在湿疹皮炎治疗中应用非常广泛，有成功经验，也存在一些争议。 中医中药作为我国传统医药，深受患者欢迎，且常被认为能够治本且不良反应少。外用中成药在湿疹皮炎治疗中应用非常广泛，有成功经验，也存在一些争议。有鉴于此，以中国中西医结合学会皮肤性病专业委员环境与职业性皮肤病学组部分专家为基础，邀请部分知名中医专家参加制定本共识，旨在帮助全国广大皮肤科医生了解我国外用中成药在湿疹皮炎治疗过程中的使用现状，以便发现问题、总结经验，更好地发挥中医药在湿疹皮炎治疗中的作用。 一、外用中成药的定义和分类 中成药是指在中医药理论的指导下，以中药为原料，按规定的处方和标准制成具有一定规格的剂型，质量稳定、可控，经国家批准依法生产的成方中药制剂，可直接用于防治疾病。外用中成药即专用于外治疗法的中成药。 外用中成药可分为固体制剂如栓剂、膏剂、膜剂等；半固体剂型如乳膏、软膏剂、凝胶剂、糊剂等；液体制剂如溶液剂、酒剂、酊剂、洗剂、油剂等；气体剂型如气雾剂。 二、中医对湿疹皮炎的认识 湿疹皮炎归属中医的“湿疮”，其他也有“奶癣”、“旋耳疮”、“绣球风”、“浸淫疮”等等多种名称。中医学认为其乃因禀性不耐，风湿热客于肌肤而成；或因脾失健运或营血不足，湿热滞留，以致血虚风燥，肌肤失养所致。与现代医学提出的遗传性或获得性皮肤屏障功能障碍，免疫学紊乱等内在病因加上环境中的物理、化学、生物微生物和社会心理因素等造成的皮肤刺激、过敏、感染等外部因素的综合作用而致病的理论一致。 三、外用中成药在湿疹皮炎治疗中的应用现状 湿疹皮炎类皮肤病是皮肤科的常见病，由于病因非常复杂，许多患者不能明确病因，容易复发，因此长期维持治疗是预防复发的重要手段，也是采用中医治疗的优势病种之一。国内外研究均表明目前湿疹皮炎的预后较差。2008年李邻峰等对559例皮炎湿疹的预后研究表明，3年复发率高达85%（1）。国外对慢性手部湿疹的预后研究也有类似结果（2）。但是当前治疗湿疹的主要外用药物，糖皮质激素的常见不良反应使多数患者，尤其儿童和老年患者不能长期坚持用药，外用中成药是否可以代替糖皮质激素，改善湿疹预后值得研究。 外用中成药在临床上应用很广，2012年对南京、武汉、济南三地187位皮肤科主治医师以上人员进行的问卷调查表明：70%的医师（西医师43%，中医及中西医结合医师100%）在日常工作中经常开具中成药。87%的医师（西医师76%，中医及中西医结合师100%）相信中药可以有效治疗皮炎湿疹。同时也发现72%的医师（西医师100%，中医及中西医结合师40%）认为中药的疗效也应按照现代医学方法进行临床验证。有30%的医师（西医0，中医及中西医结合师64%）相信因为中药是天然药物，所以一定安全。 四、外用中成药临床使用原则 外用中成药治疗湿疹皮炎属于中医外治法，总的原则是对症治疗，同西药一样，应该针对不同皮损、病期、部位采用不同的外用中成药。其中止痒，阻断瘙痒搔抓瘙痒的恶性循环是关键。疗程要足够。 1常用治疗湿疹皮炎的外用中成药分类：根据剂型，也可以分为溶液类、洗剂类、软膏类等。 2. 使用方法：可以单独使用也可以与西药联合、序贯应用。急性期：治宜清热除湿、收敛止痒。皮损表现为潮红、红斑、丘疹、斑丘疹，无渗出者，以清热止痒类中药洗剂外涂或湿敷，常用有止痒消炎水、复方炉甘石洗剂等；皮损表现为丘疱疹、水疱、糜烂，渗出者，以清热燥湿止痒之溶液剂湿敷或冷湿敷，常用有皮肤康洗液、复方黄柏液、甘霖洗剂等。亚急性期：治宜除湿收敛、祛风止痒。皮损表现为少量渗出者，以清热收敛止痒的洗剂外搽或湿敷，常用有舒乐搽剂、儿肤康搽剂。皮损表现为潮红、鳞屑，无渗出者，以清热除湿，祛风止痒的洗剂、软膏先搽后涂，常用有舒乐搽剂、儿肤康搽剂、肤疾洗剂、青鹏软膏、消炎癣湿药膏、丹皮酚软膏、冰黄肤乐软膏等。慢性期：治宜清热、活血化瘀，润肤止痒。皮损表现为皮肤肥厚浸润，苔藓样变者，以清热、活血化瘀止痒的酊剂、软膏外用或封包，常用青鹏软膏、消炎癣湿药膏、冰黄肤乐软膏、蜈黛软膏等；皮损表现为皮肤干燥粗糙、有鳞屑者，以清热、润肤止痒的软膏外涂，常用有青鹏软膏、冰黄肤乐软膏、黑豆馏油软膏等。 3特殊部位用药：头面部：有渗出者，常以溶液剂或洗剂湿敷或外搽，常用有皮肤康洗剂、甘霖洗剂等；无渗出者，以丹皮酚软膏、冰黄肤乐软膏等外涂。涂药后，任其暴露，勿包扎；忌用刺激性强的药物，并注意勿误涂入口眼部。外阴部：以皮肤康洗液、复方黄柏液、甘霖洗剂等湿敷、坐浴；若皮肤肥厚、瘙痒剧烈者，以羌月软膏、冰黄肤乐软膏等外涂。忌用刺激性强的药物。有些药物如皮肤康洗液，需稀释后外用，切忌将原液直接涂抹于患处。肛门部：以百安洗液、甘霖洗剂等坐浴、熏洗，若皮肤干燥、皲裂者，以冰黄肤乐软膏、除湿止痒软膏等外涂。手足部：急性、亚急性者，常用皮肤康洗液、除湿止痒洗液、复方炉甘石洗剂等湿敷、溻渍、浸浴、外搽；慢性肥厚性者，以青鹏软膏、丹皮酚软膏、消炎癣湿药膏等外涂。乳部：糜烂渗出瘙痒者，常用皮肤康洗液、复方黄柏液等湿敷，若肥厚、皲裂者，可以用消炎癣湿药膏、冰黄肤乐软膏、奇正青鹏软膏、除湿止痒软膏等外涂。 4使用中成药注意事项：应交待外用药物的用法、用量、浓度和疗程。目前还缺乏外用中成药疗程的相关研究，但可以参照西药的方法，在症状完全消失后在原皮损处再间断外用（每周2天）3-6个月，以减少复发的可能。要考虑患者的部位、性别、年龄的差异，如头面、乳房及外阴部位湿疹忌用刺激性强的外用药物，儿童及老年患者忌用刺激性强的外用药物。注意勿涂入口眼等粘膜处。应注意观察药物治疗的不良反应，及时处置。如某些外用中药含有冰片等，长期大面积应用可能会引起中毒；樟脑、薄荷脑、肉桂醇