课题3　血红蛋白的提取和分离

庖丁巧解牛知识巧学 一、凝胶色谱法凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。当一个含有各种分子的样品溶液缓慢通过凝胶时，相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。二、缓冲溶液缓冲溶液能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持溶液pH基本不变。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得在不同pH范围内使用的缓冲液。知识拓展 缓冲溶液由足够浓度的酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸，能对抗外来强酸的称为共轭碱，这一对共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系，常见的缓冲对主要有三种类型：弱酸及其对应的盐；多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐；弱碱及其对应的盐。三、电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的的。要点提示 电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单地说，这些带电粒子在电泳时的迁移率，与粒子所带的电荷量成正比，与分子量大小成反比。四、实验操作：蛋白质的提取和分离1.样品处理（1）红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色液体，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。要点提示 洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。（2）血红蛋白的释放红细胞在蒸馏水和40%的甲苯作用下破裂，释放血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液将混合液进行离心后会分层，第3层的红色透明液体是血红蛋白。（4）透析目的是除去样品中的分子量较小的杂质。2.凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作（2）凝胶色谱柱的装填装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现有，必须重装。装填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。（3）样品的加入和洗脱按正确方法加样，不能破坏凝胶面。进行洗脱时，等红色的蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。方法点拨 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤和红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。疑点突破 血红蛋白的分离是否成功如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选做)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。问题探究 问题1 凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？思路:凝胶色谱柱的高度、平整程度以及均匀与否都可能会影响样品的分离度。探究:（1）装填前为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内空气。（2）装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（3）装填后不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。问题2 蛋白质是如何分离的？思路:蛋白质是根据离心原理分离的。探究:当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用，使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。典题热题例1下列关于凝胶色谱法的原理及操作不正确的是（）A.是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法B.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，以致最后流出C.凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系D.一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来。解析：本题考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理。凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法，凝胶是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，小分子蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度快，因此在洗脱过程中分离。选用不同种凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离的分子大小也不同，故应相关。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来。这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。答案：C例2电泳技术可分离和解析氨基酸和核苷酸等有机物，下图是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果。据图分析该多肽由几种氨基酸组成（）A.6 B.4C.5 D.3解析：电泳分离方法主要就是