植物保护香菇回交改良毕业论文.doc

香菇秋7菌株回交改良初步试验 本科毕业论文 题 目 香菇秋7菌株回交改良初步研究A preliminary study on improved backcross strains of Qiu 7 Lentinula edodes姓 名 学 号专 业 植物保护指导教师 职 称 中国武汉二一四年六月 分类号 密级 香菇秋7菌株回交改良初步研究A preliminary study on improved backcross strains of Qiu 7 Lentinula edodes学生姓名：学生学号：学生专业：指导教师： 植物科学技术学院 二一四年六月III目 录 摘要IIAbstractIII1前言11.1 香菇的概述11.1.1 香菇的命名与分类11.1.2 香菇的营养价值及药用价值11.1.4 香菇产业化发展和存在的问题21.2 食用菌育种技术31.2.1 回交育种31.2.2 杂交育种31.2.3 诱变育种41.2.4 原生质体技术育种41.2.5 基因工程育种技术41.3 香菇菌株鉴定方法和回交后代的筛选51.3.1 形态学鉴定51.3.2 拮抗分析61.3.3 菌丝长速测定61.3.4 农艺性状观察61.4 研究的目的与意义72材料与方法72.1 试验材料72.1.1 供试香菇菌种72.2 试验步骤与方法82.2.1 单孢分离和孢子单核体的制备82.2.2 单双配对82.2.3 拮抗试验82.2.4 菌丝长速测定92.2.5 出菇试验92.2.6 数据分析93结果与分析113.1 单双配对结果分析113.2 拮抗试验结果分析113.3 菌丝长速测定结果分析113.4 秋栽品种农艺性状分析123.4.1 秋栽品种主要农艺性状描述123.4.2 用灰色关联度分析法进行综合评价144讨论19参考文献20致 谢23 摘 要 本实验是以香菇秋7菌株和它的孢子单核体进行回交，对香菇菌种进行改良。先是选择性状优良的香菇秋7菌株子实体收集孢子单核体。秋7共获得孢子单核体216个，把收集来的孢子单核体与亲本的菌丝进行回交配对，形成回交子，单双配对获得双核体79个，通过拮抗试验，生长速度测定最后获得22个。对22个菌株进行了栽培试验。运用灰色关联度分析法对回交菌株的菌盖直径、菌盖厚度、菌柄长度、菌柄直径、平均单菇鲜重、单袋平均鲜菇产量、单袋平均菇数、出菇期等8个性状进行综合比较。结果表明，综合性状优良的回交菌株有QBC1-125、QBC1-212、QBC1-211、QBC1-194。本试验结果表明，对主栽香菇菌株进行回交改良，是一种获得优良菌株的有效方法。关键词：香菇； 孢子单核体； 回交； 拮抗试验； 菌丝生长速度I香菇秋7菌株回交改良初步试验 Abstract The experiment is based on the backcross of Q7 and its spores monokaryons, in order to make improvements of mushroom spawn. First o all,we select the Q7s fruit body with good traits to collect spores monokaryons,which we get 216 finally.And then we make a pair and backcross with the collected spores monokaryons and the parental hyphae to get backcoss child. We obtain 79 dual-core paired body by mono-paired , and finally we get 22 through antagonism test,and by measuring the mycelium growth rate . Against 22 strains of the cultivation experiment. Use gray correlation analysis method to comprehensive compare the cap diameter, cap thickness, stipe length, stipe diameter, the average weight of a lentinula edode, the average yield and quantity of a bag,the time of fruit body growing, etc. 8 traits of backcross strains . The results show that backcross strains like QBC1-125, QBC1-212, QBC1-211 and QBC1-194 have excellent comprehensive properties . The results show to backcross and imprve the strains of mushrooms , is an effective method to obtain excellent strains.Keyword：Lentinula edodes； Spores monokaryons； Backcross； Antagonism test ； Mycelium growth rate I1前言1.1 香菇的概述1.1.1 香菇的命名与分类 香菇(Lentinulaedodes)是真菌中的皇后，又名香蕈在王祯农书、本草纲目、日用本草中提到，在本草求原中叫香信，在仙居县志中叫香椹，在赤城志中叫合蕈，在陈仁玉菌谱中叫台蕈，还有椎茸，厚菇，花菇，冬菇等。它是一种生长在木材上的真菌类，味道较香， 香气宜人，营养丰富，位列草菇、平菇、白蘑菇之上。香菇学名为Lentinula edodes(Berk.)Sing，1975年Pegler提议应另外设小香菇属Lentinula，将香菇的学名修改为Lentinula edodes (Berk)Pegler。根据真菌辞典(Ainsworth & Bisbys Dictionary of the fungi)第十版(D.L.Hawksworth，P.M.Kirk，B.C.Sutton and D.N.Pegler，2008)的分类体系，香菇属于真菌界(Mycota)，真核真菌亚界(Eukaryomycota)，真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，真担子菌纲(Eubasidiomycetes)，层菌亚纲(Hymenomycetiae)，伞菌目(Agarieales)，白蘑科(Ticholomataceae)，小香菇属(Lentinula)。香菇是一种主要的食用菌，为四极性异宗连系的担子菌，菌丝具备双核（杨新美，1998）。世界上最先人工种植的处所是我国的浙江省龙泉市，景宁县，庆元县三市县交壤地带。其香菇人工栽培技术历史上称为砍花法。在人类香菇的种植史上，留下了可查证的文献资料，最先、最完美的是公元1209年，即南宋嘉定二年何澹所编龙泉县志上的185个字。此中，有中国香菇城之称的是庆元。经过历代的不断发展，香菇手艺已非常成熟，产业也日趋完善。1.1.2 香菇的营养价值及药用价值 香菇有很高的营养价值，它体内含有很高的蛋白质和多糖含量，而且有多种人体所必须的氨基酸，脂肪含量极低，可以作为减肥佳品。香菇缺少维生素C和维生素A，但含有许多的维生素D原。香菇中一些核酸是鲜味的构成成分，香菇精是香味的主要来源。香菇有很高的药用价值，对肿瘤的防治也有很好的效果，起主要作用的是香菇多糖，而在降低血脂的过程中起主要作用的是香菇太生。香菇中还含有双链核糖核酸，是不可多得的保健品之一。香菇中还含大量的不饱和脂肪酸和可转变为维生素D的物质，能起到预防感冒的作用。而且对婴儿也是很有好处的，特别是鞥预防佝偻病的发生。香菇还可预防血管硬化，还有降血脂和降压的作用，总之，有很高的药用价值。1.1.4 香菇产业化发展和存在的问题 香菇的价值逐渐被人们所喜爱和熟知，这是由于科技的发展人们的生活水平在不断的进步，信息在很广泛的传播，香菇的产业化是一种时代的倾势。香菇的第一次和第二次飞跃使香菇产业得到很大的发展，随着栽培技术的不断跟进，尤其是代料栽培技术的使用，香菇的产量得到不断的提高和发展。经过几十年的不断努力，食用菌产业已成为优势产业，带动我国的农民走上富裕之路。而且现在的香菇产业不仅追求产量，更重要的是质量在不断的提升。给我国带来了很大的经济效益。我国的食用菌产业有三大优势，一是此产业在农业结构调整中占有很大的地位；二是我国是一个世界大国，有丰富的自然资源；三是科技在不断的进步，技术在不断的提高。但也存在着许多的问题，香菇的研究工作相对滞后。小家小户的生产方式制约着发展，而且流通体系很不规范，产量低、竞争力低的问题没有得以解决，产供销一体化不完善（潘迎捷，2011）。不管是在香菇的生产还是在香菇的产业化发展中，菌种一直是一个非常重要的因素，也是一个制约因素，在香菇产业中的地位是非常重要的。随着香菇生产的迅速发展，从事香菇基础研究，尤其是从事香菇遗传育种研究的专业科技人员数量极其少，现有的香菇菌种无法满足如此大的需求，一些不具备资格选育和保藏技术的单位和个人违规去选育和出售菌种，造成菌种混乱而且质量差、增加了农民的风险，甚至会出现绝收的现象。因此我们现在必须该做的就是规范香菇的市场，保护菌农的利益。食用菌在栽培方面有许多的优势，它占地面积少，优势仅仅几个菇棚就可以进行生产，时间相对较短，不用花费大量的人力物力，节约了不少成本，而且原料来源方面也很广泛，在贫困山区尤为适合栽种，可以使农民脱贫致富（吴迪，2006）。香菇产业的发展，对国家消灭贫困实现目标具有很深远的意义。近年来，在全国范围内的广大农户开始了大规模的种植，很多地区的农民利用自身的有力自然条件开始广泛的种植香菇，逐渐形成了一种规划化的生产。在全国最大的香菇种植和生产的地方是河南的西峡和卢氏，西峡是我国最大的香菇种植基地，而全国香菇品质最好的种植地是卢氏，卢氏得天独厚的自然条件使它不仅孕育了卢氏黑木耳，而且香菇的高品质也逐渐得到市场的广泛认可并朝海外出口，这生产的香菇产品已经出口韩国、日本等国家。1.2 食用菌育种技术 香菇的育种有许多的方法，比如说比较常规的育种方法有杂交育种、诱变育种、人工选择育种和野生食用菌驯化育种；新型的育种方法有基因工程技术、原生质体技术等。1.2.1 回交育种 回交育种在早期应用于动物育种中。1922年美国H.V.哈伦和M.N.波普运用这种方法将光芒性状转移到了优良大麦品种中。同年，F.N.布里格斯开始了非常著名的小麦抗腥黑穗病回交育种的工作，并成功选育出一系列的优良品种，在美国西部地区得以大面积的推广。后来回交育种就逐步发展成为国际上广泛应用的育种方法，经常被用作增强作物抗病虫性以及改进其他的农艺性状，也用于食用菌的育种中。 典型的回交育种是将某一二个有利性状缺失的优良品种重复用作亲本，称轮回亲本。又因为是有利性状的接受者，也称作受体。轮回亲本应该是综合性状比较好，有发展前途的品种。用另一个具有正缺少的这一二个有利性状的品种作亲本，只在开始回交时用1次，称作非轮回亲本。因其是有利性状的提供者，故称供体。它所提供的有利性状最好是显性单基因所控制的。回交育种法主要应用于：常规育种中有利性状的转育。选育近等基因系。即除了一个性状的基因型不同外，其他所有基因型都相同的一类品系。利用近等基因系可在同一遗传背景下比较某些基因的作用，并可把抵抗不同病菌生理小种的近等基因系混合成多系品种，以控制某些病害的流行。单体、缺体、三体的转育。细胞质雄性不育系及核不育系的转育。克服远缘杂种不育性。本实验采用的是回交育种的方法，是用亲本的孢子单核体与亲本进行回交获得回交子的过程。在育种工作中，常利用回交的方法来改良基因，用回交方法所产生的后代称为回交子。因此回交与其他方式相比也是有重要意义的。1.2.2 杂交育种 杂交育种是香菇育种中常用的方式，它是用一个亲本的优点去克服另一个亲本的缺点，这是一个互补的原则，它有很强的目的性和方向性（陈世通等，2012），大大减少了后期的工作。杂交育种的原理是基因发生重组，在子一代中可能出现个方面性状都优于双亲的个体，达到育种改良的最终目的。 杂交育种有两种方式，单单交配和单双交配（谭琦等，2000）。一般程序为选择优良的菌株作为亲本进行单孢分离、杂交配对、转管繁殖、初筛、复筛、试验和示范、推广。1.2.3 诱变育种诱变育种是用射线等物理因子处理目标细胞使其遗传物质发生突变而选择出我们需要的优良品种，用于诱变的物质还可以是化学因子。目前来看对食用菌育种较为有效的诱变方法包括60Co（夏志兰等，2004；张卉等，2003）、紫外线（张渊等，2003；李德舜等，2002）、卫星搭载利用自然射线进行物理诱变(贾建航等，1998；边银丙等，1999)、激光(陈五岭等，1997)、离子束、X射线、超声波、快中子、亚硝酸、亚硝酸胍、氮芥、硫酸二乙酯等。 最后突变而成的类型是多种多样的。诱变育种在食用菌的育种中也是一种常用的方法，但在选出的菌株中，只有少数发生了突变，高品质的菌株更是少，便给育种工作带来了不便。1.2.4 原生质体技术育种 原生质体最初是用来表示植物细胞壁内的原生质（Hanstein,1980），后来也包括微生物细胞去除细胞壁后的一种细胞结构。原生质体融合技术是先将两个亲本菌株的细胞壁通过酶解剥除，使它在高渗环境中释放出原生质体，后再将两个亲本菌株的原生质体在高渗的环境下混合，有聚乙二醇或者电融合仪帮助融合，在再生培养基上培养，使其生出细胞壁，最后筛选出需要的融合子。 此技术有五方面的特点，重组率较高、受结合型的限制较小、遗传物质传递更为完整、重组种类多和有助于外援基因的转化。 在遗传上，把用原生质体融合技术得到的单核体称为单核原生质体，而这一现象被称为原生质体单核化。 原生质体技术是食用菌的育种中的一种重要手段，但在香菇育种中的运用还存在不少问题，如原生质体难以获得，融合子不稳定等。1.2.5 基因工程育种技术 基因工程是人为的在供试生物体中截取一段目的基因，在离体的条件下用适当的限制性核酸内切酶进行切割，然后将它与载体DNA分子连接起来，一同导入受体细胞中，选育新品种。最早的担子菌的遗传转化是1986年Mufioz-Rivas等利用PEG法把同源的trpC基因导入裂褶菌色氨酸营养缺陷型突变株中，获得正常的裂褶菌菌株，为后来的食用菌转化育种奠定了基础。Chen et al.(2000)在前人的基础上对农杆菌介导的转化作了改进，子实体菌褶组织与农杆菌共培养在同源启动子的作用下实现了双孢蘑菇的高效转化。除了双孢蘑菇之外，目前仅有少数食用菌包括侧耳、香菇、金针菇(Kuo et al., 2004)进行过类似的遗传操作，但还没有建立起相对稳定的转化系统。基因工程技术在香菇育种方面的研究也没有太多的进展。但基因工程技术给微生物育种带来了新的革命，它创造的新物种是自然演化中不可能出现的，作为一种可控的育种手段，它必将在食用菌定向育种中发挥越来越重要的作用。1.3 香菇菌株鉴定方法和回交后代的筛选香菇菌株育种后，并不是每一个菌株都是我们所需要的，这时我们就需要进行挑选，选出成功育种、改良、性状优良的菌株。目前用于香菇菌种鉴定的方法主要有6种：形态学鉴定、拮抗反应、交配型因子分析、同工酶技术、分子生物学技术、荧光染色分析。这几种鉴定方法都有好处和坏处，但是他们结合起来运用缺失非常的准确（徐夙侠，2006）。1.3.1 形态学鉴定一般来说，形态标记(observation of morphology)指的是肉眼可见的外部形态和内部结构，是遗传学研究的基础。目前为止，人类已描述过的70000多个真菌物种中，绝大多数是通过形态学鉴定的（张瑞颖，2004）。日本实行的香菇品种登记中也把形态特征作为重要的鉴定指标，形态学鉴定(observation of morphology)的宏观方面指外部形态，其中主要包括A、菌盖形态(成熟的子实体)：菌盖直径，菌盖上表面颜色，菌盖厚度，菌盖肉质，菌盖的平面形态，侧面形态，菌盖纵切面形状：B、鳞片形态：鳞片的分布、颜色和大小；C、子实层形态：形状，宽度，密度，排列，颜色；D、菌柄形态：形状，长度，菌盖直径与菌柄长度的比例，菌柄表面的颜色，菌柄是否有毛，菌柄的肉质，菌柄粗细，菌盖直径与菌柄直径的比例。另外，细胞学性状等也可以作为分类的依据。该方法简便直观，容易操作，在食用菌品种鉴定中是一个重要的指标。目前，形态学特征虽然是种以上分类单元分类鉴定的重要依据，但在种以下分类鉴别(品种鉴定)中可能不稳定或引起分歧。一般认为形态特征在食用菌品种鉴定中可以作为一个辅助指标，但不能作为唯一的鉴定方法。主要原因如下（张瑞颖，2004）：一、鉴定耗时长。二、食用菌形态特征变化大。三、目前以形态学为依据的形态学种(morphological species)，经交配试验和分子系统学分析表明，每个形态学种里面可能包含几个生物学种(biological species)或系统学种(phylogenetic species)，形态学对种的分辨力不及生物学或系统学。1.3.2 拮抗分析一般来讲，拮抗作用是指一类微生物抑制或杀死其它类微生物的作用。拮抗作用是微生物界普遍存在的现象。然而本实验中所说的拮抗有所不同，是指一种真菌的不同个体之间的一种相互识别，相互排斥的现象。因为它所表现的外部形状与拮抗比较相似，所以也称作拮抗，其实确切来说可以叫做体细胞不亲和性(somatic incompatibility)，也可以叫做营养不亲和性(vegetative incompatibility)。 拮抗反应时用来鉴别菌株的一个重要标志，但却用肉眼无法准确的鉴别，因为这存在主观性。有拮抗反应的菌株可以断定是不同菌株，然而无拮抗反应的菌株却不能判定为相同菌株（石红霞等,2002)。并且无拮抗反应的菌株栽种后菇体形状大小也存在明显的差异(赵斌清等,2007）。因为通常异棕结合的菌株间拮抗线才明显，而同宗结合的菌株间拮抗线却不明显。但是虽然如此，拮抗反应仍然是鉴定菌株的一种重要方法，便于我们区别出不同的菌株。1.3.3 菌丝长速测定将回交后代定量接种于适宜的培养基上，最适温度下培养，实时观察测量，最后计算出菌丝的生长速度。同时观察菌丝的颜色，菌落形态，浓密程度等特征，选择生长速度快并且长势好的菌株进行吃料能力测定。通常吃料能力强，长速快的菌株，在栽培试验中，其菌丝满袋期、原基形成期、出菇期较短。但是否生长速度快的菌株，其性状就一定好，目前尚有许多争论。1.3.4 农艺性状观察 在菌丝生长速度测量的基础上，要进一步比较出菇性能。根据实际情况采用适当的栽培方法，如瓶栽、袋栽、段木栽培。通常试验按照生物统计的原理进行设计，各菌株的产量单收单计，同时对每个菌株的菇形、单菇鲜重、出菇期等都作了详细的观察和记录。通常只会重点考察某一个或几个性状，如单菇重、产量等，但往往产量高的菌株不一定性状都优良，要对杂种后代进行更接近实际、更科学的评价，则灰色关联度分析法显得尤为重要。香菇的产量大并不代表性状优良，是高品质的香菇。香菇只有兼顾个方面优良的性状才能说明是改良成功。所以这就需要用灰色关联度分析法进行分析。灰色关联度分析法是对新品种的一种综合评价，它在对优良品种的评价方面起到了指导意义，而且还有一定的应用价值，不仅在对各个新品种的评价中得到了广泛的应用，而且在工农业等各个领域也得到广泛应用（刘思峰等，2005）。1.4 研究的目的与意义 香菇不仅营养丰富，味道鲜美，而且还可以预防和治疗疾病。栽培十分广泛。但是主栽品种在商品性状和产量上不能完全满足市场的需要，而且由于多年长期使用，种性退化变异严重，产量低，抗性弱，不耐高温，致使感染率高，甚至绝收，给菇农造成很大的经济损失。为了解决这些问题，不断提高栽培品种的品质，本实验就对香菇秋7菌珠种进行回交改良，通过单双配对的方式实现基因重组，杂种优势互补，选育出适应性广、抗逆性强、具有杂种优势的新品种，起到提升竞争力的作用。2材料与方法2.1 试验材料2.1.1 供试香菇菌种香菇秋7栽培菌株：菇形好，易出菇，湖北品种，由华中农业大学的菌株实验中心提供。2.1.2 供试培养基表2-1 实验所用培养基 Table 2-1 media used in this study培养基Media 主要成分 Component 用途 Use forPDA马铃薯potato: 200g、葡萄糖glucose:20g、琼脂20g/1000ml蒸馏水菌丝保存CYM葡萄糖glucose:20g,酵母膏yeast extract:2g;蛋白胨peptone:2g; K2HPO4:1g,KH2PO4:0.46g,MgSO4:0.5g琼脂20g/1000ml蒸馏水菌丝长速测定木屑sawdust78%木屑sawdust;20%麸皮bran;1%糖white sugar; 1%石膏land plaster菌丝长速测定2.2 试验步骤与方法2.2.1 单孢分离和孢子单核体的制备采集亲本秋7菌株的子实体，要菇形完整、单生和开伞程度七八分的。先用75%的酒精进行表面消毒，用灭过菌的剪刀剪去菇柄，放在无菌培养皿内培养30个小时，等到无菌培养皿内有白色孢子印后移走菌盖。开始制作孢子悬浮液，挑取少量孢子于无菌水中进行梯度稀释，选择各浓度合适的孢子悬浮液200l涂布在PDA培养基上，放入25恒温箱中进行培养。把其他未稀释的孢子放入4摄氏度冰箱中备用。等到孢子长成微小的白色星芒状时移入PDA试管斜面培养基内进行培养，培养一段时间后待菌丝长到2-3cm后，在无菌条件下挑取菌丝制成玻片镜检，把没有锁状联合的单核菌株放进冰箱备用。2.2.2 单双配对 在PDA培养皿上接种一小块单核菌丝体，在距单核菌丝1cm处接种亲本的菌丝体，在25下培养一段时间后，当单、双核菌丝的菌落刚好交接时，挑取单核菌丝边缘较远离双核菌丝的不同部位进行扩大培养，并且镜检是否有锁状联合，若以双核化，即可转入试管斜面中进行继续培养。2.2.3 拮抗试验 当供试菌体活化后，挑取适宜大小的回交菌块，同时挑取同样大小的两个亲本菌株一起放入90mm的培养基内，品字形摆放，间隔30mm左右。在25培养箱内进行培养，一段时间后取出观察拮抗线是否明显，淘汰一批拮抗线不明显或没有拮抗线的供试菌株。2.2.4 菌丝长速测定 木屑试管培养基培养把挑选出来的菌株取长8mm左右的菌块放在试管中进行培养，到菌丝长到2cm后划一条生长初始线，等到菌丝快长到满管后划一条生长终止线，并记录两线之间距离和时间，两者之间的比值便是菌丝长速。以此来挑选出长速快的菌株，进而淘汰一批长速慢的菌株，以保证留下来的菌株性状优良。CYM培养基培养在培养皿底部表面的中心画一个十字，用直径8mm的打孔器取菌块放在十字的中心，放入25恒温箱中进行培养，每天观察生长情况，菌落大小，并作上标记，测量和记录每天的生长距离。数天后，用每天记录下来的距离除以平均值便是菌丝长速。 2.2.5 出菇试验 把挑选出来的菌株制成菌种袋。首先准备试管种，在准备过程中药以防污染。再把试管种培养15天，开始制备原种，然后再把原种接种在栽培袋里，每个菌株15个栽培袋，待栽培袋转色后移入菇房进行管理，等待出菇。出菇后每2-3d采收一次，并对香菇的农艺性状进行观察和记录。最后用灰色关联度对测量出的各组数据进行分析。2.2.6 数据分析 本实验是用灰色关联度分析法对实验结果进行分析。灰色关联度分析法主要用于新品种的综合评价，能综合各品种的不同性状表现，对优良品种的评价具有一定的指导意义和应用价值，在多种农作物、经济作物和水果的新品种评价中已得到广泛应用。王卓仁等（2010）报道了灰色关联度在香菇优良杂交子筛选中的应用，其试验结果表明，灰色关联度的综合评估结果与试验的客观观测结果是一致的，这对优良杂种后代的筛选具有重要的参考价值。王秀萍等（2006）运用灰色关联度分析法对11个水稻新品系从产量、生育期、株高等10个主要农艺性状指标进行了定量分析与综合评价。邓穗生（2004）对选育的11个腰果品种从产量、品质、花期和果实形态等16个性状应用灰色关联度分析法进行了综合评估。灰色系统理论由邓聚龙教授1982年提出并创立，在工业、农业、社会、经济等众多科学领域得到广泛应用，成功地解决了生产、生活及科研中的大量实际问题，是一门横断面大、渗透性强的新兴边缘学科，能够将自然科学与社会科学有机结合起来（刘思峰等，2005）。灰色系统理论将“部分已知，部分未知”的“小样本”、“贫信息”不确定性系统作为研究对象，通过对“部分己知信息”的生成去认识现实世界，从而正确把握和描述系统运行行为和演化规律。根据灰色系统理论，将所有供试品种视为一个灰色系统，每个供试品种看成系统内的一个因素，具体计算步骤如下（李春生，2006）：第一步，设计一个“参考品种”X0作为理想品种，该品种的主要性状都应优于供试品种。以参考品种X0的n项性状指标所构成的数列作为参考数列X0(k)，即确定反映系统行为特征的参考数列：X0(k)=X0(l)、X0(2)X0(n)，再以供试品种的各项性状指标值所构成的数列为比较数列Xi (k)，即影响系统行为的比较数列：Xi(k)= Xi(1)、Xi(2)Xi(n)。参考数列X0(k)定量指标一般有正向指标、优化指标和负向指标三类。正向指标是取值越大越好的指标；负向指标是取值越小越好的指标；优化指标的取值有最优范围，太大或太小都不好。第二步，将参考数列X0(k)和比较数列Xi(k)进行无量纲化的数据处理，原因是系统中各因素的物理意义不同，导致数据的量纲也不相同，不利于比较，或在比较时难以得出正确的结论。正向指标以参考数列为分母，比较数列为分子，进行无量纲化处理Xi (k)=Xi (k)/X0(k)；逆向指标则相反，Xi (k) = X0(k) /Xi(k)；中性指标计算以数列数值较大的为分母，较小的为分子，使无量纲化处理后各个性状值在0,1之间，而参考数列处理结果X0(k)全为1。第三步，求比较数列与参考数列的灰色关联系数。关联程度是指曲线间几何形状的差别程度，差值大小可作为关联度的衡量尺度。先求出无量纲化处理后参考数列标准化值X0(k)与比较数列的标准化值Xi(k)的差异绝对值i(k)=|X0(k)-Xi(k)|，找出整个系统中的两级最小差mini(k)，两级最大差maxi(k)，根据下列公式(1)计算关联系数 i (k)： i (k)=（mini(k)+maxi(k)）/(i(k)+ maxi(k)） （1） 其中为分辨系数，取值为0-1，常取0.5。第四步，计算等权关联系数，这是视各性状指标同等重要的条件下计算的，见公式（2）。Ri=(1/n) i (k) （2） 第五步，求加权关联系数。实际上各性状指标在不同品种中的重要程度均不相同，应根据育种目标按性状的轻重程度赋予不同的权重指数 W(k)，计算加权关联系数，见公式（3）。 Ri= i (k) （3）第六步，排关联序。供试品种与参考品种间的关联程度，主要用关联度的大小次序描述，关联度越大说明供试品种与参考品种越接近，其综合性状表现越好。3.结果与分析3.1 单双配对结果分析 对香菇 秋7菌株的单孢进行收集，总共获得216个孢子单核体。每个孢子单核体均与相对应的亲本双核体进行单双配对，单双菌丝接触后即可挑取单核菌落远离交界处的菌块，转至试管培养，3-5天后镜检，淘汰单核菌丝，双核的即是目标菌株。得到的回交一代菌株79个。3.2 拮抗试验结果分析 拮抗试验出现三种现象：有明显拮抗线、拮抗线不明显、无拮抗线。结果显示，双核的有79个，拮抗明显的有46个，拮抗线不明显的有19个，无拮抗线的有14个。没有出现拮抗线可能是因为在挑取菌块的时候，菌块太大，挑有亲本的菌丝；单核菌株长速太慢。3.3 菌丝长速测定结果分析 以0.3cm/d为界限划分，淘汰长速慢的菌株，则目标菌株秋7有23个。长速可作为一个性状参与菌株农艺性状的品比。结果如下： 表3-1 菌丝长速测定结果（mm/d） Table 3-1 Hyphae grow fast measurement resultsCYM平板长速菌株平均长速菌株平均长速QBC1-1520.559QBC1-940.173QBC1-1070.557QBC1-180.150秋70.537QBC1-1790.144QBC1-10.536QBC1-1490.143QBC1-1010.529QBC1-840.143QBC1-1460.525QBC1-2020.143QBC1-140.525QBC1-490.140QBC1-1120.523QBC1-410.133QBC1-1250.523QBC1-550.127QBC1-1190.519QBC1-580.123QBC1-1940.518QBC1-570.112QBC1-1750.516QBC1-1740.111QBC1-2120.514QBC1-1920.107QBC1-2110.511QBC1-1390.092QBC1-220.511QBC1-390.090QBC1-510.510QBC1-1980.075QBC1-110.509QBC1-450.074QBC1-280.505QBC1-720.073QBC1-1950.504QBC1-690.073QBC1-1030.499QBC1-1810.068QBC1-850.497QBC1-20.064QBC1-1320.491QBC1-60.059QBC1-900.329QBC1-230.058QBC1-1840.0393.4 秋栽品种农艺性状分析农艺性状分析是评判香菇品种好坏的一项重要指标。用灰色关联度分析法对其进行分析。3.4.1 秋栽品种主要农艺性状描述表3-2 菇形较正常的回交菌株及其亲本的农艺性状Table 3-2 Agronomic characters of part hybrid and its parental strains菌株编号菌盖直径/mm菌盖厚度/mm菌柄长度/mm菌柄直径/mm单袋出菇数/个单袋产量 /g出菇期/d单菇重/g秋755.7615.2347.6314.527.44148.6908718.53QBC1-1160.0616.5651.9116.644.20124.5388723.86QBC1-1455.2612.3046.3814.4812.60208.25710014.06QBC1-2245.4515.3041.6312.278.10137.4269122.58QBC1-2852.1915.2243.7915.3910.00202.2988723.40QBC1-8552.7210.5839.9812.885.8090.64310313.96QBC1-10354.3211.6244.7115.284.90137.6168920.61QBC1-10756.8917.2349.9513.5710.60216.76715019.63QBC1-11248.919.4541.0212.4513.00136.3081006.68QBC1-11963.1519.7053.7815.872.5085.3219630.58QBC1-12550.3913.2143.9114.8713.30244.2559116.34QBC1-17554.3111.5945.1315.4110.60236.8608719.35QBC1-19451.9115.8446.7615.209.80175.5178720.16QBC1-19554.7518.2250.9417.698.20196.6298720.13QBC1-21149.2216.3243.3913.578.90141.0239120.97QBC1-21250.7113.6940.4411.978.80182.4418722.77 表3-3 香菇15个回交菌株农艺性状特征Table3-3 Agronomic characters of 20 hybrid strains of L.edodes菌株编号农艺性状描述QBC1-11 个体适中，出菇较少，产量不高QBC1-14个体适中，出菇较多，产量高QBC1-22 个体适中，产量较低QBC1-28个体较大，菌柄较粗，产量高QBC1-85菌肉较薄，产量低QBC1-103菌肉较薄，菌柄较粗QBC1-107菌肉较厚，产量高QBC1-112个体较小，产量较低QBC1-119个体大，菌柄粗，产量低QBC1-125个体适中，产量高QBC1-175菌肉较薄，产量高QBC1-194个体较大，产量较高，出菇较少QBC1-195菌肉较厚，产量较高QBC1-211菌肉较厚，出菇较少QBC1-212个体适中，出菇较少3.4.2 用灰色关联度分析法进行综合评价构造参考品种构造一个参考品种X0，各方面的指标都优于供试品种，作为理想中的品种。 表3-4 供试菌株与参考菌株主要性状值 Table 3-4 Main characteristics of tested strains and ideal strain in L.edodes菌株编号菌盖直径/mm菌盖厚度/mm菌柄长度/mm菌柄直径/mm单袋出菇数/个单袋产量 /g出菇期/d单菇重/g秋755.7615.2347.6314.527.44148.6908718.53QBC1-1160.0616.5651.9116.644.20124.5388723.86QBC1-1455.2612.3046.3814.4812.60208.25710014.06QBC1-2245.4515.3041.6312.278.10137.4269122.58QBC1-2852.1915.2243.7915.3910.00202.2988723.40QBC1-8552.7210.5839.9812.885.8090.64310313.96QBC1-10354.3211.6244.7115.284.90137.6168920.61QBC1-10756.8917.2349.9513.5710.60216.76715019.63QBC1-11248.919.4541.0212.4513.00136.3081006.68QBC1-11963.1519.7053.7815.872.5085.3219630.58QBC1-12550.3913.2143.9114.8713.30244.2559116.34QBC1-17554.3111.5945.1315.4110.60236.8608719.35QBC1-19451.9115.8446.7615.209.80175.5178720.16QBC1-19554.7518.2250.9417.698.20196.6298720.13QBC1-21149.2216.3243.3913.578.90141.0239120.97QBC1-21250.7113.6940.4411.978.80182.4418722.77参考品种50.0020.0025.0012.0014.00245.0075.0020.00Wk0.160.180.120.110.20.150.050.03无量纲化处理 由于系统中的各因素物理意义不相同，以至于数据的量纲也不相同，不利于我们进行比较或是难以得出正确结论。结果见表3-5表 3-5 无量纲化处理Table 3-5 Treatment of immeasurable outline of tested strains and ideal strain in L.edodes 菌株编号菌盖直径/mm菌盖厚度/mm菌柄长度/mm菌柄直径/mm单袋出菇数/个单袋产量/g出菇期/d单菇重/g秋70.8967 0.7615 0.5249 0.8264 0.5314 0.6069 0.8621 0.9265 QBC1-110.8325 0.8280 0.4816 0.7212 0.3000 0.5083 0.8621 0.8382 QBC1-140.9048 0.6150 0.5390 0.8287 0.9000 0.8500 0.7500 0.7030 QBC1-220.9090 0.7650 0.6005 0.9780 0.5786 0.5609 0.8242 0.8857 QBC1-280.9580 0.7610 0.5709 0.7797 0.7143 0.8257 0.8621 0.8547 QBC1-850.9484 0.5290 0.6253 0.9317 0.4143 0.3700 0.7282 0.6980 QBC1-1030.9205 0.