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第八届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛获奖作品瘦肉精在猪尿中的浓度与组织残留消除的相关性研究 *本作品获第八届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛三等奖李伟源 廖敬军 陈俏文 黎碧琳 麦倩莹 李郎平 指导教师：陈杖榴 黄显会(兽医学院，华南农业大学，广东广州，510642)摘 要： 15只健康猪(42.84.4kg)，随机分为3组，在饲料中添加5mg/kg盐酸克伦特罗，连续饲喂7天后，利用ELISA法监测猪只饲养过程中尿液和各种组织中盐酸克伦特罗，研究其残留的消除规律。试验结果表明：克伦特罗（瘦肉精）在猪体内各种组织有广泛的分布，在零休药期，按每g组织含克伦特罗的残留浓度，最高为肺和肝，分别达1497.7 ng/g和1428.2 ng/g，其他组织依次为肾脏 脾脏 心脏 肌肉，肌肉最低为98.1 ng/g，肺和肝的浓度约为肌肉的15倍；尿液和各种组织中盐酸克伦特罗的消除呈正相关关系，通过监测猪尿中瘦肉精的含量就可以真实的反映生猪各种组织中的瘦肉精残留情况；同时表明，开展生猪的瘦肉精残留监测时，尿中检测阳性判定限定在12 ng/mL是安全可行的。关键词： 瘦肉精；猪；残留；消除规律；安全瘦肉精，学名克伦特罗(Clenbuterol，CL) ，商品名称为平喘素、克喘素，是一种人工合成的肾上腺素能受体激动剂，化学名称为1-4 氨基 3，5 二氯苯基-2-叔丁氨基乙醇盐酸盐1。80年代初发现受体激动剂可促进动物机体生长并改变机体胴体组成。资料显示，在许多动物的研究中均发现这类物质对机体的营养起着重分配作用，从而调节机体的生长发育，能使肌肉增重和体脂下降2。1990年前在欧美畜牧业中曾应用作饲料添加剂，后因发现消费者食用含有此药残留物较多的肉品，导致多次集体中毒事件3，促使欧美国家明令禁止使用此药作为饲料添加剂饲喂家畜。在90年代中期，我国畜牧业生产特别是在生猪饲养中开始大量使用4，自1998年4月发生的香港“克伦特罗中毒事件”后，在我国发生多起集体中毒事件5,6,7,8。我国自1998年开始在全国范围内对非法生产、销售和使用盐酸克伦特罗等药品行为进行查处。农业部自1999年开始在全国部分地区进行生猪瘦肉精残留情况的监督抽查，取得了很大成效，但时至今日，部分地区的生猪瘦肉精残留问题仍然十分严重，威胁和危害着人民的身体健康。为了保障人民的健康，目前主要采用监测尿中有无克伦特罗来判定生猪是否有瘦肉精残留。但组织中瘦肉精残留与尿中浓度的关系尚未见报道，为什么通过检测尿中克伦特罗的含量就能确定猪的各种组织中的含量？它们的关系是怎样的？这种检测方法能否确保猪肉产品的安全？带着这几个问题，我们设计了本试验，在猪饲料中添加盐酸克伦特罗，通过检测停止给药前后不同时间中尿液和各种可食性组织中克伦特罗的含量，建立在模拟生猪饲养环境下尿液中盐酸克伦特罗的消除规律和各食用组织中的药物残留的关系，从而证实监测猪尿中瘦肉精的含量就可以反映出猪体内各食用组织的残留情况，并推算出尿液中的最合适的判定限。1 材料与方法1.1 动物 15头健康的杜洛克、长白、约克夏杂交公猪（已去势），体重42.84.4kg。按常规饲养，自由饮水，一天饲喂两顿，每顿给料量0.70.8kg/头，饲料为全价日粮，不含抗菌药物。临床观察两周表现健康。1.2 药品和试剂 盐酸克伦特罗原料药，含量99.9%。RIDASCREEN Clenbuterol FAST 克伦特罗Elisa检测试剂盒（Art NO.: R1701）及RIDA C18固相萃取小柱（Art NO.: R2002），德国R-Biopharma AG公司生产。1.3 给药和样品采集将盐酸克伦特罗按每kg饲料5mg的浓度添加，连续饲喂7d后停止给药。自给药后0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35d采集尿样，分别于停止给药后0、19、27d将猪只屠宰，每次随机取5只，分别采集肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏组织。所有样品采集后1h内置-18下保存，待测。1.3 ELISA测定程序 使用前将试剂盒室温(2025)放置12 h。按每个标准溶液和样品做2个重复测定计算所需酶联板条的数量，插入框架。向微孔中加入100 mL用缓冲液稀释的抗体，用封口膜封好，室温孵育15 min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水于酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。精密吸取20mL标准溶液或样品至微孔中，并在每孔内加入100mL用缓冲液稀释的酶结合物，在微型震荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30 min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水到酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。每孔加50 mL底物缓冲液和50 mL发色剂，在微型振荡器上充分混匀(也可先将底物和发色剂混匀，每孔加100 mL)，室温避光孵育15 min。每孔加100 mL终止液，混匀。于450 nm处测定吸光度值，60 min内完成读数。计算百分吸光度值，以标准溶液中克伦特罗浓度(ng/mL)的自然对数和百分吸光度值，绘制标准曲线。根据标准曲线计算出供试样品中克伦特罗的浓度(ng/mL)。本方法最低检测限为0.1ng/g，并在检测过程中部分样品用GC/MS方法进行了验证。1.5 尿样中盐酸克伦特罗浓度的测定 取20mL直接按照1.4进行测定。超出标准曲线的样品按照一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。1.6 肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏组织中盐酸克伦特罗浓度的测定将组织样品匀浆，取5g样品与25mL 0.05mol/L HCl溶液混合，振荡均质1.5h，称取6g均质物（相当于1g组织）离心，取上清液，加入300mL 1 mol/L NaOH溶液混合15min，加入4mL 0.5 mol/L KH2PO4缓冲液(pH3.0)，简单混合，置4下过夜，离心，取上清液在室温下用RIDA C18柱净化，收集甲醇洗脱液，在5060下用N2气流挥干溶剂，用0.4mL蒸馏水溶解残留物，取20mL按照1.4进行测定。超出标准曲线的样品按照一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。2 结果给药后尿中瘦肉精的浓度见表1及消除规律时间曲线见图1。零休药期尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表2、图2。休药19d后尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表3、图3。休药27d后尿及各种组织中瘦肉精的浓度见表4、图4。表1 ：连续7天通过饲料中添加5mg/kg瘦肉精后尿中药物浓度(ng/mL)时间猪 号SD(d)T01T04T05T06T15T02T03T09T12T14T07T08T10T11T1300000000000000000121.120.422.219.117.720.222.518.222.222.518.219.820.119.217.820.11.7325.725.925.624.123.625.425.526.426.325.626.725.425.626.124.625.50.8539.440.540.939.239.842.540.639.641.942.540.940.941.141.341.140.81.0762.560.462.561.563.759.662.762.961.562.261.362.561.360.661.161.81.1952.549.449.250.649.651.950.651.149.252.250.61.31148.846.843.246.145.949.646.448.846.547.847.01.91340.145.439.742.640.943.942.144.244.345.842.92.21536.135.133.234.733.730.134.635.934.737.534.61.991726.12725.128.328.627.427.831.431.126.227.92.11920.221.819.617.420.416.420.416.514.315.818.32.5218.910.47.98.69.18.37.98.28.38.18.60.8232.45.13.22.92.63.42.72.53.12.63.10.8252.12.51.91.82.11.51.11.91.61.61.80.4271.41.810.90.81.20.42911.20.70.80.60.90.2310.60.90.30.60.40.60.2330.40.80.30.40.30.40.2350.10.50.20.30.10.20.2 图1 给药后尿中瘦肉精排泄浓度时间曲线表2 ： 零休药期尿及各种组织中瘦肉精的残留量（ng/mL(g)）样品名称猪 号SDT07T08T10T11T13尿61.362.561.360.661.161.40.7肌肉102.493.795.2105.393.998.15.4心脏97.396.6103.5108.992.699.86.4肝脏1451.91435.11302.71465.41485.71428.272.5脾脏452.2387.6341.6428.4426.2407.243.4肺脏1547.71561.71351.11575.71452.51497.795.2肾脏675.5787.8742.7598.5592.2679.386.5表3 ： 休药19d后尿及各种组织中瘦肉精的残留量(ng/mL(g)样品名称猪 号SDT02T03T09T12T14尿1.51.11.91.61.61.50.3肌肉1.51.62.51.61.61.80.4心脏1.81.42.11.11.91.70.4肝脏4.36.57.76.35.36.01.3脾脏2.72.42.32.82.72.60.2肺脏4.15.85.74.94.85.10.7肾脏2.13.33.96.62.13.61.8图2 零休药期尿及各种组织中瘦肉精的浓度柱形图图3 休药19d后尿及各种组织中瘦肉精的平均浓度柱形图表4 休药27d后尿及各种组织中瘦肉精的残留量(ng/mL(g)样品名称猪 号SDT01T04T05T06T15尿0.10.50.20.30.10.20.2肌肉0.71.30.70.80.20.70.4心脏0.40.90.70.80.40.60.2肝脏3.55.23.52.72.43.51.1脾脏0.60.30.81.20.20.60.4肺脏1.12.82.61.61.21.90.8肾脏1.91.31.31.21.21.40.3 图4 休药27d后尿及各种组织中瘦肉精的平均浓度柱形图表5 ： 停止给药后0、19、27天尿和组织中瘦肉精平均浓度的相关性比较样品名称0d19d27d相关系数尿61.41.50.2肌肉98.11.80.70.99996心脏99.81.70.60.99996肝脏1428.26.03.50.99985脾脏407.22.60.60.99989肺脏1497.75.11.90.99986肾脏679.33.61.40.999873 讨论3.1 瘦肉精在猪体内各种组织的分布从试验结果（表2）可看出，瘦肉精在猪体内各种组织有广泛的分布，但不同组织的分布是不均匀的，在零休药期，按每g组织含瘦肉精的残留浓度，最高为肺和肝，分别达1497.7 ng/g和1428.2 ng/g，其他组织依次为肾脏 脾脏 心脏 肌肉，肌肉最低为98.1 ng/g，肺和肝的浓度约为肌肉的15倍。据近年来的报道6,7，许多发生瘦肉精中毒多是吃了猪肺、肝引起的，这和本试验的结果是一致的。据报道2,3，人食用含有克伦特罗500 ng/g的肉品50 g就可能发生中毒（实际摄入克伦特罗约25 mg），本试验中肺、肝含量约为1500 ng/g，只需要食用17.5 g就可能出现毒性反应。3.2 瘦肉精在猪体内各种组织和尿液中的消除试验结果（表3、4）表明，瘦肉精在猪体内的消除比较缓慢，停药19d后，尿液和各种组织中的瘦肉精残留浓度仍高于1 ng/mL(g)，其中含量最高的仍是肝和肺，分别为6.0 ng/g和5.1 ng/g，除肺组织的消除比肝略快外，其他组织的顺序与零休药期基本相同，即肾脏 脾脏 肌肉 心脏。瘦肉精在尿液中的消除也比较慢，尿液中瘦肉精的浓度与组织中的浓度呈正相关关系（表5），用检查尿液中的药物浓度的方法可以反映猪的各种组织的瘦肉精残留情况。休药27d，尿中瘦肉精浓度已低于1.0ng/g，但肝脏仍有3.5ng/g，其他组织已低于2.0ng/g。3.3 关于瘦肉精的最高残留限量与ELISA检测限标准为了监控瘦肉精在动物源性食品中的残留，保障人民健康，对瘦肉精在组织中的最高残留限量(MRLs)，我国规定为不得检出，欧盟的规定为0.5ng/g1。由于目前的快速筛选方法均是使用ELISA方法，而这种方法主要是定性，不可能做到精确的定量，往往还经常存在假阳性的情况，所以在不同地区或行业在实施制定标准时有些不同，有的以1 ng/mL为阳性判定限，有的以2 ng/mL或5 ng/mL为判定限。从本试验结果，可以认为都是安全的。如果以5 ng/mL为阳性判定限，假定尿中药物的消除与组织消除呈线性关系的话，肌肉、肝、肺中的瘦肉精浓度约分别为5.5 ng/g、20.0 ng/g、16.5 ng/g，如果成人以25 mg为中毒量，则需食入约5000g肌肉或1250g肝或1500g肺，才会引起中毒，这实际上是不可能的。但就儿童而言，存在一定程度的不安全性，成人按60kg平均体重计算，人出现毒性作用的剂量为0.42 mg/kg，则10kg体重的儿童食入含瘦肉精4.2 mg的肉品，就可能发生中毒，相当于200g以5 ng/mL为阳性判定限的猪肝中的量。如果以2 ng/mL为阳性判定限，则肉品中的含量又降低了2.5倍，这样就更安全了。但为了杜绝非法使用盐酸克伦特罗，检测阳性判定限越低越好，因为即使检测判定限定在2ng/mL，相对应的肝脏组织中浓度仍然是欧盟制定的组织中最高残留限量的8倍。4 结论从本试验可以得出结论：通过监测尿液中的盐酸克伦特罗的含量可以真实的反映生猪的瘦肉精残留情况；开展生猪的瘦肉精残留监测时，尿中检测阳性判定限定在12 ng/mL是可行的。参考文献1. Smith DJ.The pharmacokinetics, metabolism, and tissue residues of be