巧克力对心血管系统的影响.doc

探索性医学综合实验教学改革与实践（第四期）巧克力对心血管系统的影响孙海凤 王振华 徐月妹 赵晓丽指导老师姓名 何建成 （02中西医结合七年制，上海中医药大学）摘要目的：观察不同剂量巧克力对心血管系统的影响。方法：选择12月龄左右的雄性SD大鼠50只，称重并将其随机分为5组：巧克力大剂量组（n=10）,每天灌服0.8g/ml巧克力悬浊液4ml；巧克力中剂量组（n=10）每天灌服0.4g/ml巧克力悬浊液4ml；巧克力小剂量组（n=10）每天灌服0.2g/ml巧克力悬浊液4m；阿司匹林组（n=10），每天灌服0.5mg/ml阿司匹林溶液4ml；正常对照组（n=10），每天灌服生理盐水4ml。于灌服4周之后，麻醉处死，腹主动脉取血。用黄嘌呤氧化酶法检测血清中SOD，用硫代巴比妥比色法测定血清中的MDA，用凝固法测定FG，用酶法测定TC、TG、LDL、HDL其间每两周时间测量一次体重进行纪录。结果：50只SD大鼠除了对照组的4号没有进行血脂及抗氧化的测试外，其余都进入结果分析。对各组大鼠的体重未产生异常的影响；小剂量组与正常组、阿司匹林组对比，FG均有所下降；大剂量组与阿司匹林组比较，FG亦有下降；与正常组对比，小剂量组的TC有所下降.中剂量、大剂量组的TC无明显变化。在TG方面，各组与对照组之间均无明显改变。各组的HDL均有不同程度的下降，尤其以巧克力小剂量组最为明显。对于LDL水平，各组无明显差别。TC/HDL的值大剂量组较正常对照组明显升高，其余各组无明显差别。巧克力大、中、小剂量组的丙二醛含量均有所提高，阿司匹林组亦有轻度升高结论：本实验所使用的黑巧克力对SD大鼠：对体重无异常升高作用；食用小剂量及大剂量的巧克力均能增强抗凝血作用，且优于阿司匹林；能轻度降低TC,并降低HDL,使TC/HDL升高。对血脂的影响尚有待进一步深入研究；抗氧化作用尚有待进一步证实。关键词巧克力；抗氧化；抗血栓；血脂；阿司匹林 一项关于我国人口死亡原因的调查分析资料显示，近年国人死亡人员中心血管疾病已成为我国人口的第一死因。除了治疗之外，人们越发关注预防心血管疾病。在传统观念中，巧克力历来是作为一种垃圾食品，除心血管疾病外，诸如糖尿病、肥胖、牙齿龋烂等，似乎都与巧克力有着千丝万缕的联系，尤其是会导致发胖。但最新研究证明：巧克力具有抗氧化、免疫调节、不升高胆固醇、消除血小板性血栓、扩张血管的作用，因而能预防心血管疾病的发生。然而，关于巧克力的健康功效的实验皆为单项功效的研究，尚未见对巧克力从抗氧化，抗凝血，脂代谢三方面进行综合研究的报道，因此具有片面性，对公众易产生误导；而且尽管曾提及但也并未与阿司匹林的功效进行对比。本实验目的，旨在将巧克力与阿斯匹林进行比较，明确其对心血管系统的作用以及对体重有无影响。1 材料与方法1.1 实验动物SD大鼠，雄性，50只，清洁级，体重230300g,由上海中医药大学实验中心提供。合格证号SCXK(沪)20030003。1.2 实验药物及制作巧克力：购自上海申丰食品有限公司。根据体表面积（人与大鼠）药物剂量换算公式，分别将巧克力制成浓度为0.2g/ml、0.4g/ml、0.8g/ml的小、中、大剂量悬浊液，备用； 具体方法是：巧克力小剂量：称取10.63g巧克力粉末溶成50ml悬浊液（大鼠每日灌服量为0.85g/只）,则其浓度为0.2g/ml；巧克力中剂量：称取21.25g巧克力粉末溶成50ml悬浊液（大鼠每日灌服量为1.7g/只），则其浓度为0.4g/ml；巧克力大剂量：称取42.50g巧克力粉末溶成50ml悬浊液（大鼠每日灌服量为3.4g/只），则其浓度为0.8g/ml。阿司匹林：购自上海信谊制药厂，根据体表面积（人与大鼠）药物剂量换算公式，将阿司匹林制成浓度为0.5mg/ml的阿司匹林溶液，备用。即25mg阿司匹林溶成50ml溶液（大鼠每日灌服阿司匹林2mg）,则其浓度为0.5/ml。以上药物制作均在上海中医药大学实验室完成。1.3实验试剂SOD试剂盒，MDA试剂盒，冰醋酸，乌拉坦，Fg试剂盒： TG试剂盒： TC试剂盒1.4实验方法1.4.1分组和给药50只SD大鼠先适应性喂养三天，第四天起称重，并将大鼠随机分为5组：巧克力小、中、大剂量组、阿司匹林溶液组、正常对照组，每组10只。每天于17:00准时按组分别给每只大鼠灌服相应浓度的巧克力、阿司匹林以及生理盐水。小剂量巧克力组：用灌胃针给该组每只大鼠灌服0.2g/ml巧克力悬浊液4ml；中剂量巧克力组：用灌胃针给该组每只大鼠灌服0.4g/ml巧克力悬浊液4ml；大剂量巧克力组：用灌胃针给该组每只大鼠灌服0.8g/ml巧克力悬浊液4ml；阿司匹林溶液组：用灌胃针给该组每只大鼠灌服0.5mg/ml阿司匹林溶液4ml；正常对照组：用灌胃针给该组每只大鼠灌服生理盐水4ml。以上均每天灌胃一次，连续28天。分别于灌胃的第两周和第四周称重。1.4.2取材和处理按每100g体重 0.5ml的注射量，腹腔注射20%乌拉坦溶液麻醉大鼠，打开腹腔，暴露腹主动脉，用10ml一次性注射器取血7ml，2ml注入抗凝管颠倒混匀，5ml注入离心管。两者均按3000转/min离心10分钟取血清，待测。1.5检测指标FG（采用凝固法）,TC、TG、LDL、HDL（以上四项均用酶法测定，采用日立7170A全自动生化分析仪）,均在曙光医院检验科完成。SOD的含量用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA的含量用硫代巴比妥比色法测定。1.6统计方法各指标数值以均数标准差（s）,SPSS13.0软件统计，采用单因素方差分析。2结果2.1体重原始平均体重：五组的平均体重经方差分析，差别均无统计学意义（F=0.12，p0.05）。第二周平均体重：经方差分析，五组间比较差别均无统计学意义（F=1.51，p0.05）。第四周平均体重：经方差分析和q检验，巧克力大剂量组与正常对照组比较差别有统计学意义（p0.05）。详见表1，图1-4。表1 各组平均体重的比较（s）组别n原始平均体重（g）第二周平均体重（g）第四周平均体重（g）巧克力小剂量组10267.0819.04330.1121.20387.8525.84巧克力中剂量组10268.3319.39324.3926.47379.9835.49巧克力大剂量组10264.8618.85329.0328.86363.6330.49*阿司匹林组10264.1820.54321.1920.42375.4025.96正常对照组10262.7121.17342.3720.96393.6626.38注：与第四周正常对照组平均体重比较：*p0.05）；巧克力中剂量组与大剂量组、阿司匹林组、正常对照组比较差别无统计学意义（p0.05）；巧克力大剂量组、阿司匹林组与正常对照组比较差别无统计学意义（p0.05）。见表2，图5。表2 各组FG的比较（s）组别nFG(g/l)巧克力小剂量组100.810.09*#巧克力中剂量组100.870.05巧克力大剂量组100.820.09阿司匹林组100.890.06正常对照组100.880.09注：与阿司匹林组比较：*p0.05；与正常对照组比较：#p=0.05；与阿司匹林组比较：p=0.05。图5：各组FG比较图2.3血脂指标2.3.1胆固醇（TC）巧克力小剂量组与中剂量组比较差别有统计学意义（p0.05）；巧克力小剂量组与正常对照组比较差别亦有统计学意义（p0.05）；巧克力中剂量组与大剂量组比较差别无统计学意义（p0.05）；巧克力中剂量组与正常对照组比较差别无统计学意义（p0.05）；巧克力大剂量组与正常对照组比较差别无统计学意义（p0.05）。见表3，图6。表3 各组TC的比较（s）组别nTC(mmol/L)巧克力小剂量组101.410.20*#巧克力中剂量组101.660.32巧克力大剂量组101.580.19正常对照组91.700.28注：与中剂量组比较：*p0.05；与正常对照组比较：#p0.05）；巧克力中剂量组与大剂量、正常对照组比较差别无统计学意义（p0.05）。见表4，图7。表4 各组TG的比较（s）组别nTG（mmol/l）巧克力小剂量组101.090.30*巧克力中剂量组101.200.18巧克力大剂量组101.100.30#正常对照组91.060.16注： 与正常对照组比较： p0.05.（n9，其原因是4号大鼠取血量不足，故未能进行该指标的测定）图7：各组TG比较图 2.3.3高密度脂蛋白（HDL）经方差分析和q检验，四组间差别有统计学意义（F=6.44，p0.01）。巧克力小剂量组与中剂量组比较差别有统计学意义（p0.01）；巧克力小剂量组与正常对照组比较差别有统计学意义（p0.05）；巧克力中剂量组与大剂量组比较差别无统计学意义（p0.05）；见表5，图8。表5 各组HDL的比较（s）组别nHDL(mmol/l)巧克力小剂量组100.670.08*#巧克力中剂量组100.790.12巧克力大剂量组100.720.06正常对照组90.860.10注：与巧克力中剂量组比较：*p0.01；与正常对照组比较：#p0.01；与正常对照组比较：p0.05。见表6，图9。表6 各组LDL的比较（s）组别nLDL(mmol/l)巧克力小剂量组100.330.12*巧克力中剂量组100.230.20巧克力大剂量组100.120.20#正常对照组90.250.19注：与巧克力大剂量组比较：*p0.05；（n9，其原因是4号大鼠取血量不足，故未能进行该指标的测定）图9：各组LDL比较图2.3.5 TC/HDL经方差分析和q检验得出：四组比较差别有统计学意义，F=3.08,p0.05。巧克力大剂量组与正常对照组比较差别有统计学意义（p0.05）。见表7，图10：表7 各组TC/HDL的比较（s）组别nTC/HDL巧克力小剂量组102.100.18巧克力中剂量组102.100.18巧克力大剂量组102.200.13*#正常对照组101.970.16注：与正常对照组比较：#p0.01。图10：各组TC/HDL比较图2.4 抗氧化指标2.4.1丙二醛(MDA)巧克力小剂量组、中剂量组、大剂量组与阿斯匹林组、正常对照组比较差别有统计学意义（p0.01）,巧克力小剂量组与中剂量组比较差别有统计学意义（p0.01），阿斯匹林组与正常对照组比较差别有统计学意义（p0.05）。见表9，图12：表9 各组MDA的比较 （s）组别nMDA(nmol/l)巧克力小剂量组103.500.88*#巧克力中剂量组104.501.21*巧克力大剂量组103.430.37*阿斯匹林组10-0.460.21正常对照组9-1.170.21注：与阿斯匹林组、正常对照组比较：*p0.01；与巧克力中剂量组比较：#p0.01；与正常对照组比较：p0.05。（n9，其原因是4号大鼠取血量不足，故未能进行该指标的测定） 图12：各组MDA比较图3讨论3.1 体重3.1.1测定意义体重是各类营养物质代谢在宏观层面上的综合反映，也是目前自我检测和评估健康指数的最简单直接的指标之一。3.1.2 结果分析通过实验前、中、后三个时段的称量结果表明，服用巧克力并未对各组大鼠的体重产生明显的影响。由此可见，人们不必过于担心吃巧克力导致肥胖。3.2抗凝血3.2.1测定意义血浆纤维蛋白原常沉积在小动脉内膜上，使管腔狭窄，弹性下降，血粘滞性升高，血流减慢，外周阻力升高。FG含量升高可见于急性心肌梗死，动脉粥样硬化等心血管系统的疾病。3.2.2 结果分析 从实验中得出，小剂量组与正常组、阿司匹林组对比， FG均有所下降。大剂量组与阿司匹林组比较，FG亦有下降。提示巧克力小剂量组优于阿司匹林组及其正常对照组，而巧克力大剂量组似优于阿司匹林组，但作用、机制尚有待进一步深入研究。3.3血脂代谢3.3.1研究意义美国NCEP（国家胆固醇教育计划）最新提出的ATP-III推荐，在筛查性危险评估中，把TC、LDL-C、HDL-C和TG四项指标作为主要动脉粥样硬化性心血管病危险因素指标。1TC与载脂蛋白结合，以可溶性脂蛋白形式存在。其3/4存在于LDL，1/4存在于HDL中。缺血性心、脑血管疾病和高血压等动脉粥样硬化时胆固醇常增高。TC升高是冠心病的危险因素之一。2 TG是脂肪酸和甘油缩合而成的酯。TG增高也是AS（动脉粥样硬化）和冠心病的危险因素，高脂血症除IIa型外，均有高TG血症。TG明显升高还可以使血液凝固性增强，并抑制纤维蛋白原溶解，促进血栓形成，是冠心病诱发心肌梗死的危险因素。3 HDL-c是机体从外周组织逆向转运胆固醇回肝脏的主要形式。血浆中的HDL-c水平反映机体从外周组织清除转运胆固醇的能力。因此，HDL-c水平与动脉粥样硬化的发病率呈正相关。 LDL是机体转运内源性胆固醇到全身组织的主要形式，流行病学调查和临床医学实践都提示和证明血浆LDL水平与动脉粥样硬化呈明显正相关。5 当TC、HDL变化不一致时，可用TC/HDL的值来综合说明对血脂的影响。其比值升高提示动脉粥样硬化的危险系数加大。3.3.2结果分析从实验中得出，与正常组对比，巧克力小剂量组的TC有所下降。巧克力中剂量、大剂量组的TC无明显变化。此可能与硬脂酸在机体内的代谢有关。硬脂酸是巧克力中主要的饱和脂肪酸，前人动物实验8表明硬脂酸的吸收率低于其他SFA，随着硬脂酸摄入量的增加，其经胆汁酸的排出量也增加，并可降低肝脏内胆固醇酯化。并且Emken等7发现硬脂酸主要存在于磷脂中，在体内经代谢后至卵磷脂中的比例却比软脂酸低30%-40%。另外，LDL-R调节胆固醇清除和LDL形成。软脂酸可抑制该受体的活性，从而导致血胆固醇升高，但硬脂酸不影响LDL-R表达和活性。本实验结果还表明，在TG方面，各组与对照组之间均无明显改变。说明这种黑巧克力对脂质的影响并不大。而在脂蛋白方面，可以看到，各组的HDL均有不同程度的下降，尤其以巧克力小剂量组最为明显。对于LDL水平，各组无明显差别。TC/HDL的值大剂量组较正常对照组明显升高，其余各组无明显差别。对于HDL-C降低的原因，可能（1）与目前巧克力的生产原料有关。目前，天然的可可脂是加工巧克力的最有代表性的油脂。但由于可可脂在使用时受价格昂贵的影响，人们很早开始用代可可取代。代可可在甘油酯组成多结晶性方面与可可脂极为相似，代可可中含GS2U,SOS,SOP,等可可脂的主要成分，因而结构上类似可可脂。代可可脂通过氢化、酯交换、分提等方法对油脂改性，目前使用的最多的方法是氢化。氢化的植物油中含反油酸，不能象油酸那样长链化和去饱和化。最近的研究表明，摄入富含反油酸饮食后，血中HDL-c水平降低，另外，大多数报道认为摄入反式脂肪酸增加了LP(a)的水平，而LP(a)水平与CVD危险性之间呈正相关。9（2）HDL-c降低的原因可能还与大鼠的高糖饮食存在着一定的联系3。 综上所述，服用黑巧克能在一定程度上降低大鼠TC以及HDL-c的水平，但巧克力大剂量组TC/HDL的值比正常水平稍高。因此无法得出黑巧克力能降低血脂的结论。3.4抗氧化3.4.1 研究意义超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤。因而SOD活力的高低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、心血管病、肾脏病、消化系统疾病、辐射、药物作用等有着密切的联系，对疾病的病因学探讨、诊断、治疗、术后的观察有着重要意义。机体中的SOD等抗氧化酶不但协同地防止活性氧的损伤效应，而且相互间还起着保护作用6。SOD活力的高低间接反应了机体清除自由基的能力，故作为抗氧化最重要检测指标之一。丙二醛（MDA）是氧化应激反应的产物。机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid PUFA）引发脂质过氧化作用，并因此形成脂氢过氧化物（LOOH），其分解产物较有代表性的是由环状过氧化物的断裂生成的MDA，MDA可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联。这交联物就是老年色素（fluorescent ceroid）6。MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。 3.4.2结果分析由于总SOD活性度测量时没有进行对照管加入样品量的摸索，使我们的实验结果无意义；在丙二醛含量测验实验中，与正常组对比，巧克力大、中、小剂量组的丙二醛含量均有所提高，阿司匹林组亦有轻度升高。因此黑巧克力的抗氧化作用尚有待进一步证实。3.4.3误差分析 （1）在T-SOD测量过程中，由于时间、经费所限，没有进行最佳取样量的摸索，致使测定管的吸光度大于对照管的吸光度，使对（照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度不是在0.15至0.55之间，而却小于0。 （2） 本实验所使用的722光栅分光光度仪可能存在性能不很稳定的问题，使结果存在一些偏差，这也会导致结果没有统计学意义。（3）分析前变异：血标本收集与处理。如 标本处理与储存。 （4）由于经验不足，实验进行时间比较紧张，且实验确实未完全参照