猪血多肽亚铁螯合盐的体外抗氧化作用研究20110102.doc

猪血多肽亚铁螯合盐的体外抗氧化作用研究基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助；西南大学博士基金项目资助（09BSr07）。作者简介：汪学荣，男，1972年生，博士，副教授，长期从事畜禽副产品综合利用与开发工作。通讯作者：阚建全，男，1965年生，四川仪陇人，博士，教授，研究方向为食品化学与营养学。1汪学荣 2彭祥伟 3阚建全（1西南大学荣昌校区动物科学系 重庆 402460）（2重庆市畜牧科学研究院 重庆 402460）（3西南大学食品科学学院 重庆 400715）摘 要：本文研究了猪血多肽亚铁螯合盐对超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2）的清除作用，并比较了维生素C、猪血多肽亚铁和猪血多肽对二者的清除能力。实验结果表明：猪血多肽亚铁螯合盐能清除超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2），维生素C、猪血多肽亚铁和猪血多肽这三种物质对超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2）清除能力的强弱顺序为维生素C猪血多肽亚铁猪血多肽，故猪血多肽亚铁螯合盐具有较强的清除超氧阴离子自由基（O2-）和过氧化氢（H2O2）的能力。关键词：猪血多肽亚铁；抗氧化作用；超氧阴离子；过氧化氢The studies of antioxidant activity of chelated pig blood polypeptide ferrite in vitro1WangXuerong 2PengXiangwei 2KanJianquan (1Animal Science Department of Southwest University RongChang Campas ChongQing 402460)(2Chongqing Academy of Animal Science ChongQing 402460)(3Food Science Institute of Southwest University ChongQing 400715)Abstract: The elimination of chelated pig blood polypeptide ferrite on superoxide radical anion（O2-） and hydrogen peroxide (H2O2) was studied and the clearance abilities of vitamine C, pig blood polypeptide ferrite and pig blood polypeptide were compared in this article.The results showed that the chelated pig blood polypeptide ferrite could remove superoxide radical anion（O2-） and hydrogen peroxide (H2O2). The remove ability of the chelated pig blood polypeptide ferrite was weaker than that of vitamin C, but stronger than that of pig blood polypeptides, so the chelated pig blood polypeptide ferrite had relatively strong ability of removing superoxide radical anion（O2-） and hydrogen peroxide (H2O2).Key Words: Pig blood polypeptide ferrite; Antioxidant activity; Superoxide radical anion; Hydrogen peroxide多肽铁是将蛋白质酶解后得到的多肽与亚铁盐螯合形成的一种生物活性物质，可以直接被肠粘膜细胞吸收，不产生任何消化道刺激症状，生物利用率高，是理想的补铁剂1。国外关于多肽铁功能特性方面的研究报道较少。国内学者张亚丽等（2004）2以1398中性蛋白酶水解豆粕得到的多肽与亚铁盐络合制备了多肽络合亚铁，初步研究了其抗氧化作用，结果表明脱脂豆粕多肽络合亚铁对猪油具有抑制自动氧化的作用。刘安军等(2006)3采用不同方法研究了多肽-Fe的抗氧化功能,结果表明其对MDA的生成有一定的抑制作用,对氧自由基和双氧水均有很强的消除作用,证明了多肽-Fe具有较强的抗氧化作用。邓尚贵等（2006）4以南海低值鱼蛋白为原料,采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解得到多肽水解物(HP),并制备多肽-铁()螯合物,对螯合产物的抗氧化和抗菌功能特性进行了初步研究，结果表明多肽螯合铁具有明显的抗氧化活性和显著的抗枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性。王丽霞等（2006）5探讨了多肽-Fe预防和治疗缺铁性贫血的效果及其口服的安全性，结果表明多肽-Fe抗贫血效果优于NaFeEDTA。笔者在前期研究中利用2709碱性蛋白酶水解猪血制备了猪血多肽，并将其与氯化亚铁螯合制备了猪血多肽铁螯合盐6,7。本文以猪血多肽铁螯合盐为原料，主要研究了其体外抗氧化作用，以期为猪血多肽铁螯合盐的实际应用提供基础数据和有益参考。1 材料与方法1.1 原料与试剂猪血多肽、猪血多肽亚铁螯合盐：实验室自制；邻苯三酚、过氧化氢、乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、柠檬酸、磷酸、碘化钾、硫代硫酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、抗坏血酸(Vc)：分析纯；可溶性淀粉：食品级。1.2 主要仪器设备 UV755B紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DK-8D电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；78-1磁力加热搅拌器（杭州仪表电机厂）；PHS-3C+酸度计（上海雷磁仪器厂）；ESJ120-4型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；离心机（北京医用离心机厂）。1.3 实验方法1.3.1 猪血多肽亚铁螯合盐对超氧阴离子自由基(O2-)的清除作用1.3.1.1 邻苯三酚自氧化过程中吸光度随时间的变化关系8 采用测定样品对碱性邻苯三酚体系(非酶体系) 产生的O2-的抑制作用，即利用邻苯三酚自氧化反应测定自由基抑制剂对其产生的超氧阴离子自由基的抑制作用。在碱性条件下(磷酸盐缓冲溶液pH为8.2),邻苯三酚会迅速发生自氧化,同时释放出超氧阴离子,并且邻苯三酚的自氧化速率与超氧阴离子的浓度有关。取50mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5ml和不同浓度的样品溶液0.1ml , 置于25水浴中预热20min，加入2.5mmol/L的邻苯三酚0.4 ml ,迅速摇匀,倾入1cm 的比色杯中,在325nm处,每隔30s测吸光度1次,连续测定5min ,空白对照组以双蒸水代替样品,根据邻苯三酚吸光度随时间的变化曲线来表示。1.3.1.2 不同浓度样品对超氧阴离子的抑制率测定9 取50mmol/L pH 8.2 的Tris-HCl 缓冲溶液4.5mL和不同浓度的样品0.1mL , 置于25水浴中预热20min。加入2.5mmol/L的邻苯三酚0.4ml,混匀后置于25水浴中反应4min ,立即用2滴8mol/L的HCl中止反应。用去离子水调零,325nm 处测定吸光度值。空白组以0.1mL去离子水代替样品。每个样品平行测定3次，取平均值，按下式计算样品液的抑制率。 式中:E 样品对O2-的抑制率, %；S空白邻苯三酚的自氧化速率；S样品加入样品后的氧化速率。1.3.2 猪血多肽亚铁螯合盐对过氧化氢的清除试验10，11过氧化氢清除率采用碘量法进行测定：在模拟胃液条件下测定样品的过氧化氢清除率。pH3.0，0.1mol/L柠檬酸缓冲液5.0mL ,样品溶液适量,定容至25 mL ,加入浓度约0.015 mol/L过氧化氢(用时配制)1.0mL ,置37恒温水浴中保持20min ,取出,加入10 %KI溶液2mL ,2 mol/L H3PO4 1mL ,暗处反应120min ,用0.002mol/L Na2S2O3溶液滴定。以1%2%淀粉溶液指示终点，同时以双蒸水为空白。H2O2消除量测定采用碘量法，其原理如下：样品中还原性成分+H2O2(过量)氧化产物+H2O+H2O2(残留)H2O2 (残留)+2KI+2H3PO4I2+2H2O+2KH2PO4I2+2Na2S2O3Na2S4O6+2I-+2Na+V0表示空白所消耗Na2S2O3的体积(mL)；V1表示添加样品后消耗Na2S2O3的体积(mL)。2 结果与分析2.1 猪血多肽亚铁螯合盐对超氧阴离子自由基(O2-)的清除作用在生物体内的氧化还原反应体系中, 大致有2%5%的氧会产生O2-, O2-是活性氧的一种,是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基,可以经过一系列反应生成其他的氧自由基12。O2-也是机体内寿命最长的自由基, 通常作为自由基链式反应的引发剂, 产生活性更强的OH自由基, 进一步给机体造成更大的危害13,14。本试验通过邻苯三酚自氧化产生O2-, 研究了猪血多肽亚铁螯合盐在体外对 O2-的抑制作用, 结果见图1和图2。图1表明，随着反应时间的延长，溶液吸光度先增加后降低。当反应时间在050min之间时，随着时间的延长，溶液吸光度增加，表明氧化产物增加；未添加清除剂组的吸光度显著高于添加了猪血多肽亚铁螯合盐组，这说明猪血多肽亚铁螯合盐可以清除超氧阴离子自由基（O2-），抑制邻苯三酚自氧化过程产生的中间产物，因此具有较强的清除O2-的能力。从图1还可看出，当反应时间在26min之间时，不论是否添加了清除剂，邻苯三酚自氧化过程中溶液吸光度与反应时间均成直线关系（图2），利用最小二乘法原理15得到方程y = 0.0593x + 0.1549，R2 = 0.997（未添加清除剂）；y = -0.0054x + 0.1766，R2 = 0.9711（含0.979mg/ml猪血多肽亚铁）。对回归方差进行方差分析（F检验法），结果见表1和表2。表1 回归方程方差分析表（未添加清除剂）Tab.1 Variance analysis of regression equation(scavenger unadded)方差来源平方和自由度均方F值临界值回归0.0527473510.052747353742.8429*F0.05=5.59F0.01=12.2剩余0.0000986570.00001409总和0.0528468表2 回归方程方差分析表（含0.979mg/mL猪血多肽铁）Tab.2 Variance analysis of regression equation(0.979mg/ml polypeptide-iron)方差来源平方和自由度均方F值临界值回归0.000437410.00043746.882*F0.05=5.59F0.01=12.2剩余0.000444970.00006356总和0.00088238 由回归方程方差分析表1和2可知，未添加清除剂时FF0.01，回归方程极显著，这说明吸光度与时间的线性相关关系极显著；当添加了猪血多肽亚铁时， F0.01FF0.05，回归方程显著，这说明吸光度与时间的线性相关关系显著。因此，在26min这段时间内可以认为邻苯三酚自氧化速率一定,超氧阴离子释放速率一定。从图2还可以看出，添加0.979mg/mL猪血多肽亚铁组的氧化曲线一直在未添加清除剂的氧化曲线以下, 这说明猪血多肽亚铁抑制了邻苯三酚的自氧化,减少了超氧阴离子的产生。2.2 几种物质对超氧阴离子清除作用的比较试验 分别配制不同浓度的样品液（猪血多肽、猪血多肽亚铁和Vc），取1mL，按上述方法测定不同浓度的样品对超氧阴离子自由基(O2-) 的抑制率，结果见图3和图4。从图3可看出，猪血多肽、猪血多肽亚铁螯合盐和维生素C对碱性邻苯三酚体系产生的超氧阴离子（O2-）均具有一定的清除作用，并且随着浓度的上升，溶液吸光度下降，清除作用增强。由图4可知，猪血多肽、猪血多肽亚铁螯合盐和维生素C对碱性邻苯三酚体系产生的超氧阴离子（O2-）均具有抑制作用，并且抑制率随着浓度的上升而上升。从图3和图4还可看出，三种物质对超氧阴离子（O2-）清除能力的强弱顺序为维生素C猪血多肽亚铁猪血多肽，在低浓度下维生素C对超氧阴离子（O2-）的清除作用最强，猪血多肽亚铁螯合盐稍弱于维生素C，但是随着浓度的增大，猪血多肽亚铁螯合盐对超氧阴离子（O2-）的清除能力越接近于维生素C，这说明猪血多肽亚铁螯合盐是一种较好的抗氧化剂。2.3 猪血多肽亚铁螯合盐对过氧化氢的清除试验所有能够产生超氧阴离子自由基的生物体系都能通过歧化反应产生过氧化氢，过氧化氢是一种强氧化剂, 具有良好的扩散性, 容易透过细胞膜, 并引起氧化损伤16,17。在有过渡金属离子存在时，便会发生典型的Feton 反应，生成羟自由基（OH）18,19。羟自由基（OH）是已知最活泼的活性氧自由基,也是危害最大的氧自由基。过量H2O2的毒害作用类似于氧自由基, 可导致人体遗传物质DNA损伤及基因突变，可能具有致癌的危险性，也可能加速人体的衰老进程。因此，在相关研究中也将其作为氧自由基对待20。如果体系中某种物质对过氧化氢清除率越高，则表明对活性氧清除作用越强。自由基产生过多或清除过慢, 它通过攻击生命大分子物质及各种细胞器, 会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤, 加速机体的衰老过程并诱发各种疾病21。由此可见，清除体内的过量过氧化氢有着非常重要的意义。本试验研究了猪血多肽、猪血多肽亚铁和维生素C对过氧化氢的清除作用，结果见图5。图5表明，在模拟胃液的条件下，猪血多肽、猪血多肽亚铁和维生素C均具有一定清除过氧化氢的能力，其强弱顺序为维生素C猪血多肽亚铁猪血多肽，并且三种物质的清除率随着浓度的升高而增加，如当猪血多肽亚铁的浓度为0.3914mg/mL时对过氧化氢的清除率为50.61%，在最高质量体积浓度（0.5872mg/mL）下，猪血多肽亚铁对过氧化氢的清除率为69.51%，这表明猪血多肽亚铁螯合盐具有较强的清除过氧化氢的能力。3 结论3.1 猪血多肽亚铁螯合盐能清除超氧阴离子自由基（O2-），抑制邻苯三酚自氧化过程产生的中间产物，具有较强的清除超氧阴离子自由基（O2-）的能力。3.2 维生素C、猪血多肽亚铁和猪血多肽这三种物质对超氧阴离子（O2-）清除能力的强弱顺序为维生素C猪血多肽亚铁猪血多肽，猪血多肽亚铁螯合盐是一种较好的抗氧化剂。3.3猪血多肽亚铁螯合盐能清除过氧化氢（H2O2），维生素C、猪血多肽亚铁和猪血多肽这三种物质对过氧化氢清除能力的强弱顺序为维生素C猪血多肽亚铁猪血多肽,说明猪血多肽亚铁螯合盐具有较强的清除过氧化氢的能力。参考文献：1Nancy C.Andrews. 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