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YourText 第六章糖类药物 1 2 Text1 Text3 Text4 Txt5 Text6 植物 动物 微生物 海藻 多糖的分类 按照其来源不同来分 3 多糖在细胞内的存在方式 游离型结合型 糖蛋白 如人参多糖 黄芪多糖等脂多糖 如胎盘脂多糖 细菌脂多糖等 4 多糖类药物的药理活性 抗氧化 调节血糖血脂 抗辐射损伤 抗溃疡 调节免疫功能 抗病毒 抗突变 抗衰老 抗肿瘤 抗凝血 5 国内已经上市的部分多糖药物 6 粘多糖的特点 7 粘多糖的连接方式 8 甲壳素 软骨素 4 硫酸软骨素 6 硫酸软骨素 硫酸乙酰肝素 硫酸角质素 透明质酸 硫酸皮肤素 几种粘多糖的重复单位 9 四级结构 三级结构 二级结构 一级结构 空间结构 多糖的结构 10 多糖的结构 11 12 多糖的构效关系 13 第一节糖类药物制备的一般方法一 游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇 用水或在中性条件下以50 乙醇 也可以用82 乙醇 在70 78 下回流提取 溶剂用量一般为材料的20倍 需多次提取 植物材料磨碎经乙醚或石油醚脱脂 拌加碳酸钙 以50 乙醇温浸 浸液合并 于40 45 减压浓缩至适当体积 用中性醋酸铅去杂蛋白及其他杂质 铅离子可通H2S除去 再浓缩至粘稠状 以甲醇或乙醇温浸 去不溶物如无机盐或残留蛋白质等 14 醇液经活性炭脱色 浓缩 冷却 滴加乙醚 或置于硫酸干燥器中旋转 析出结晶 单糖或小分子寡糖也可以在提取后 用吸附层析法或离子交换法进行纯化 二 多糖的分离与纯化多糖可来自动物 植物和微生物 植物体内含有水解多糖衍生物的酶 必须抑制或破坏酶的作用后 才能制取天然存在形式的多糖 使多糖免受到内原酶的作用 速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法 15 昆布多糖 果聚糖 糖原易溶于水 壳多糖与纤维素溶于浓酸 直链淀粉易溶于稀碱 酸性粘多糖常与蛋白质结合在一起 提取分离时 通常先用蛋白酶或浓碱 浓中性盐解离蛋白质与糖的结合键后 用水提取 以乙醇或十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 沉淀酸性多糖 最后用离子交换色谱法进一步纯化 多糖的提取第一步脱脂 以便多糖释放 方法是将材料粉碎 用甲醇或1 1乙醇乙醚混合液 加热搅拌1 3小时 也可用石油醚脱脂 动物材料可用丙酮脱脂 脱水处理 16 第二步多糖的提取方法主要有以下几种 1 难溶于冷水 热水 可溶于稀碱液者这一类多糖主要是不溶性胶类 如木聚精 半乳聚糖等 用冷水浸润材料后用0 5mol LNaOH提取 提取液用盐酸中和 浓缩后 加乙醇沉淀得多糖 如在稀碱中仍不易溶出者 可加入硼砂 对甘露聚糖 半乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖 此法可得相当纯的物质 2 易溶于温水 难溶于冷水和乙醇者材料用冷水浸过 用热水提取 必要时可加热至80 90 搅拌提取 17 提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白 或用三氯乙酸除杂蛋白 离心除去杂蛋白后的清液 透析后用乙醇沉淀得多糖 3 粘多糖有些粘多糖可用水或盐溶液直接提取 但因大部粘多糖与蛋白质结合于细胞中 因此需用酶解法或碱解法使糖 蛋白质间的结合键断裂 促使多糖释放 一般组织中存在多种粘多糖 需要对粘多糖进行分离纯化 18 1 碱解法多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定 故可用碱解法使糖与蛋白质分开 但若硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在C 3或C 6 此时易发生脱硫作用 这类多糖不宜用碱解法提取 2 酶解法理想的工具酶是专一性低的 具有广泛水解作用的蛋白酶 鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键 为除去长肽段 常可与碱解法合用 常用的酶制剂有胰蛋白酶 木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶 19 二 多糖的纯化 1 乙醇沉淀法乙醇沉淀法是制备粘多糖的最常用手段 乙醇的加人 改变了溶液的极性 导致糖溶解度下降 向溶液中加入一定浓度的盐 如醋酸钠 醋酸钾 醋酸铵或氯化钠有助于使粘多糖从溶液中析出 盐的最终浓度5 即足够 使用醋酸盐的优点是在乙醇中其溶解度更大 即使在乙醇过量时 也不会发生这类盐的共沉淀 可以使用多次乙醇沉淀法脱盐 也可以用超滤法或分子筛法 SephadexG 10或G 15 进行多糖脱盐 20 沉淀物可用无水乙醇 丙酮 乙醚脱水 真空干燥即可得疏松粉末状产品 2 分级沉淀法不同多糖在不同浓度的甲醇 乙醇或丙酮中的溶解度不同 因此可用不同浓度的有机溶剂分级沉淀分子大小不同的粘多糖 在Ca2 Zn2 等二价金属离子的存在下 采用乙醇分级分离粘多糖可以获得最佳效果 3 季胺盐络合法粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵 CTAB 和十六烷基氯化砒啶 CPC 等能形成季胺盐络合物 这些络合物在 在离子强度大时 这种络合物可以解离 溶解 释放 21 使其溶解度发生明显改变时的无机盐浓度 临界盐浓度 这主要取决于聚阴离子的电荷密度 粘多糖的硫酸化程度影响其电荷密度 根据其临界盐浓度的差异可以将粘多糖分离 降低pH可抑制羧基的电离 有利于增强硫酸粘多糖的选择性沉淀 季胺盐的沉淀能力受其烷基链中的 CH 基数的影响 还可以用不同种季胺盐的混合物作为酸性粘多糖的分离沉淀剂 应用季胺盐沉淀多糖是分级分离复杂粘多糖与从稀溶液中回收粘多糖的最有用方法之一 22 4 离子交换层析法粘多糖由于具有酸性基团如糖醛酸和各种硫酸基 在溶液中以聚阴离子形式存在 因而可用阴离子交换剂进行交换吸附 吸附时可以使用低盐浓度样液 洗脱时可以逐步提高盐浓度如梯度洗脱或分步阶梯洗脱 可以依次分离透明质酸 硫酸乙酰肝素 硫酸软骨素和硫酸皮肤素与硫酸角质素和肝素 此外 区带电泳法 超滤法及金属络合法等在多糖的分离纯化中也常采用 23 24 第二节重要糖类药物生产工艺一 D 甘露醇 D Mannitol 一 结构与性质甘露醇又名己六醇甘露醇为白色针状结晶 无臭 略有甜味 不潮解 易溶于水 溶于热乙醇 微溶于低级醇类 低级胺类 吡啶 不溶于有机溶剂 25 二 生产工艺甘露醇在海藻 海带中含量较高 以葡萄糖为原料 经电解 脱盐 精制即可制得也可以用发酵法生产 1 提取法 1 工艺路线 26 2 发酵法 1 工艺路线 2 工艺过程 菌种选育 种子培养 发酵混合柱脱盐 目的 思路 方法 27 原料斜面培养基种子培养基发酵培养基麦芽1kg琼脂2 1 淀粉糖化液2 2 玉米粉2 2 玉米浆0 5 0 5 NaNO30 3 0 3 KH2PO40 1 0 1 MgSO40 05 0 05 KCl0 05 0 05 FeSO40 001 0 001 28 3 制剂取适量注射用水 按20 标示量 称取结晶甘露醇 加热90 搅拌溶解后 加入1 活性炭 加热5min 过滤 再补足注射用水至标示量 检测pH 4 5 6 5 和含量 合格后 经G3垂熔漏斗澄清过滤 分装于50ml 100ml 250ml安瓿瓶或输液瓶中 以1Kg cm2蒸汽灭菌40min 即得甘露醇注射液 20 甘露醇注射液是饱和溶液 为防止在温度过低时析出结晶 配制时需保温45 左右趁热过滤 5 07 甘露醇溶液为等渗溶液 含热原的注射液可通过阳树脂 H 型 与阴树脂 OH 处理 制得pH合适又不含热原的注射液 29 二 1 6 二磷酸果糖 结构与性质1 6 二磷酸果糖是果糖的1 6 二磷酸酯 其分子形式有游离酸FDPH4与钠盐如1 6 二磷酸果糖三钠盐 FDPNa3H 等 FDPNa3H为白色晶形粉末 有旋光 易溶于水 不溶于有机溶剂 4 时较稳定 久置空气中易吸潮结块 转为微黄色 30 二 生产工艺1 酶转化工艺 1 工艺路线 31 取经多代发酵应用过的酵母渣 悬浮于适量蒸馏水中 反复冻融3次 加入底物 8 蔗糖 4 NaH2PO4 30mmol LMgCl2 pH6 5 于30 反应6h 除杂蛋白煮沸5min 阴离子交换柱层析 转酸FDPCa沉淀悬浮于水中 732树脂转酸 NaOH调pH5 3 5 8 除菌过滤后 冻干 32 2 固定化细胞制备工艺 1 工艺路线 菌体用等体积生理盐水悬浮 预热至40 用4倍量生理盐水加热溶解卡拉胶 两者于45 混合搅拌10min 倒入成型器皿中 4 10 冷却30min 加入等量0 3moI LKCl浸泡硬化4h 33 活化固定化细胞用含底物的表面活性剂 于35 浸泡活化固定化细胞12h 用0 3mol LKCl洗涤后浸泡于生理盐水中备用 酶促转化以活化固定化细胞充填柱反应器 以上行法 通入30 底物溶液 内含8 蔗糖 4 NaH2PO4 5mmol LATP 30mmoI LMgC12 收集反应液 固定化的影响 1 构象改变 立体屏蔽 微扰2 分配效应和扩散限制效应3 酶作用的活力加强 稳定性提高 34 四 作用与用途FDP是葡萄糖代谢过程中的重要中间产物 是分子水平上的代谢调节剂 FDP具有促进细胞内高能基团的重建 保持红细胞的韧性及向组织释放氧气的能力 是糖代谢的重要促进剂 临床验证表明FDP是急性心肌梗塞 心功能不全 冠心病 心肌缺血发作 休克等症的急救药物 它有利于改善心力衰竭 肝肾功能衰竭等临床危象 在各类外科手术中可以作为重要辅助治疗药物 对各类肝炎引起的深度黄疽 转氨酶升高及低白蛋白血症者也有较好的治疗作用 35 三 肝素 一 结构与性质肝素是天然抗凝剂 是一种含有硫酸基的酸性粘多糖 肝素分子量不均一 由低 中 高三类不同分子量组成 分子量从3000到37500 肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末 无臭无味 有吸湿性 易溶于水 不溶于乙醇 丙酮 二氧六环等有机溶剂 其游离酸在乙醚中有一定溶解性 肝素分子中含有硫酸基与羧基 呈强酸性 为聚阴离子 能与阳离子反应成盐 硫酸化程度高的肝素具有较高的降脂和抗凝活性 小分子量肝素 分子量4000 5000 具有较低的抗凝活性和较高的抗血栓形成活性 36 肝素的结构 含硫酸基的酸性粘多糖三硫酸双糖与二硫酸双糖以2 1比例在分子中连结 三硫酸双糖中是L 艾杜糖醛酸 二硫酸双糖中是D 葡萄糖醛酸 37 二 生产工艺肝素系广泛分布于哺乳动物的肝 肺 心 脾 肾 胸腺 肠粘膜 肌肉和血液里 因此肝素可由猪肠粘膜 牛肺 猪肺提取 其生产工艺主要有盐解 季胺盐沉淀法 盐解 离子交换法和酶解 离子交换法 肝素在组织内和其他粘多糖一起与蛋白质结合成复合物 因此肝素制备过程包括肝素蛋白质复合物的提取 解离和肝素的分离纯化两个步骤 38 1 盐解 离子交换生产工艺 1 工艺路线 继续升温至95 维持10min 95 乙醇沉淀过夜NaOH调PH11 按3 量加入H2O2 H2O2浓度30 浓度30 共48小时 去热原 杂质 39 2 酶解 离子交换生产工艺 1 工艺路线 2 工艺过程加入4 KMnO4 预热至80 保温2 5h 40 三 检验方法 四 作用与用途肝素是典型的抗凝血药 能阻止血液的凝结过程 用于防止血栓的形成 41 四 硫酸软骨素 一 结构与性质硫酸软骨素 CS 的药用商品名为康得灵 是从动物软骨中提取制备的酸性粘多糖 主要是硫酸软骨素A C及各种硫酸软骨素的混合物 硫酸软骨素为白色粉末 无臭 无味 吸水性强 易溶于水而成粘度大的溶液 不溶于乙醇 丙酮和乙醚等有机溶剂中 其盐对热较稳定 受热80 亦不破坏 游离硫酸软骨素水溶液 遇较高温度或酸即不稳定 主要是脱乙酰基或降解成单糖或分子量较小的多糖 42 43 二 生产工艺硫酸软骨素广泛存在于动物的软骨 喉骨 鼻骨 猪含41 牛 马鼻中膈和气管 含36 39 中 在骨腱 韧带 皮肤 角膜等组织中也有 鱼类软骨中含量也很高 如鲨鱼骨中含50 60 在软骨中 硫酸软骨素与蛋白质结合成蛋白多糖 并与胶原蛋白结合在一起 其提取分离方法有稀碱 酶解法 浓碱水解法 稀碱 浓盐法 酶解 树脂法 44 1 稀碱 浓盐法 1 工艺路线 2 工艺过程 乙醇浓度为60 沉淀60 65 真空干燥 45 2 稀碱 酶解法 1 工艺路线 2 工艺过程 酶解pH8 8 8 9 加人胰酶 于53 54 保温水解6 7h 46 3 制剂按配方含2 硫酸软骨素 0 85 NaCl 称取标示量107 的硫酸软骨素干粉 以纯品计 撒入注射用水中 使其溶胀 搅拌溶解 再加入NaCl 调pH5 5 加热煮沸 用布氏漏斗过滤 滤液加入0 3 0 5 活性炭 加热至微沸 保持15min 用砂棒包扎滤纸乘热过滤 滤液冷却后 补加注射用水至全量 用3号垂熔漏斗过滤至瞪明 按每支2ml灌封 灭菌 即得硫酸软骨素注射液 47 四 作用与用途硫酸软骨素 尤其硫酸软骨素A能增强脂肪酶的活性 使乳糜微粒中的甘油三酯分解 使血中乳糜微粒减少而澄清 还具有抗凝和抗血栓作用 可用于冠状动脉硬化 血脂和胆固醇增高 心绞痛 心肌缺血和心肌梗塞等症 硫酸软骨素还用于防治链霉素所引起的听觉障碍症以及偏头痛 神经痛 老年肩痛 腰痛 关节炎与肝炎等 还用作皮肤化妆品等 48 一 结构与性质透明质酸是由 1 3 2 乙酰氨基 2 脱氧 D 葡萄糖 1 4 O D 葡萄糖醛酸的双糖重复单位所组成的酸性多糖 分子量50 200万 49 透明质酸为白色 无定形固体 无臭无味 有吸湿性 溶于水 不溶于有机溶剂 有旋光 具有较高的粘度特性 下述因素会影响透明质酸溶液的粘度 如pH值低于或高于pH7 0 或有透明质酸酶存在时会引起分子中糖苷键的水解 许多还原性物质如半胱氨酸 焦性没食子酸 抗坏血酸 重金属离子和紫外线 电离辐射等也能引起分子间的解聚而造成粘度下降 二 生产工艺制备透明质酸的常用原料有公鸡冠 眼球玻璃体 人脐带 猪皮 兔皮等 50 1 工艺路