12基因工程的基本操作程序(刘).ppt

1 2基因工程的基本操作程序 1 基因的结构 1 原核生物基因结构 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 编码区下游 编码蛋白质 调控遗传信息的表达 调控程序 A ATGTGCACGTAGTTA G T TACACGTGCATCAAT C 启动子 终止子 编码区 非编码区 非编码区 启动子 终止子 ATGTGCACGTAGTTA TACACGTGCATCAAT RNA聚合酶 AUGUGCACGUAGUUA 启动子 位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列 没有启动子 基因就不能转录 RNA聚合酶 能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质 终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 它能阻碍RNA聚合酶的移动 并使其从DNA模板链上脱离下来 使转录终止 编码区 非编码区 非编码区 能编码蛋白质 启动子 终止子 外显子 内含子 编码蛋白质 不能编码蛋白质 真核生物基因结构 外显子 真核细胞基因DNA中的编码序列 这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质 内含子 真核细胞基因DNA中的间插序列 这些序列被转录成RNA 但随即被剪除而不翻译 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质 原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗 连续 不连续 编码区 非编码 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 基因工程基本操作的四个步骤 有了目的基因 我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可进行遗传 表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达 才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达 一 目的基因的获取 一 目的基因主要是 也可以是一些具有调控作用的因子 编码蛋白质的结构基因 请举出三个以上的例子 二 获取目的基因的常用方法有哪些 1 从基因文库中获取 2 利用PCR技术扩增 3 人工合成 请阅读P9第一和二两段 一 目的基因的获取 一 从基因文库中直接获取 1 基因文库 概念见P9 2 基因文库的分类 按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 3 基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下 便于获得所需的目的基因 4 获取目的基因的根据 见课本P9 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 5 基因文库的构建方法之一 1 直接分离法 鸟枪法 某种生物的单链mRNA 单链互补DNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与载体连接 cDNA文库 反 逆 转录酶 DNA聚合酶 反转录法 cDNA的合成流程图解 5 基因文库的构建方法之二 基因组文库和cDNA文库的主要区别 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 可以 部分基因可以 2 PCR技术扩增目的基因 PCR 多聚酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 通过此技术 可获取大量的目的基因 请根据课本P10画出PCR反应的流程图 看一看 比一比 2 利用PCR技术扩增目的基因具体过程 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 等 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提条件 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在热稳定DNA聚合酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 已知目的基因序列时 3 人工合成 基因比较小 核苷酸序列已知 DNA合成仪 目的基因的mRNA 单链cDNA 反转录 双链DNA 即目的基因 双链cDNA 合成 1 反转录法 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 化学合成 推测 2 人工合成基因法 2 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 合成的基因中均无内含子和启动子 杂交双链 RNA DNA 核酸酶H 二 基因表达载体的构建 基因工程的核心 1 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 说一说 如何构建 二 基因表达载体的构建 核心 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种 一个切口两个黏性末端 2 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因 资料 科学家在培育抗虫棉时 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中 然后导入棉花的受精卵中 结果抗虫基因在棉花体内没有表达 然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子 导入棉花受精卵 长成的棉花植株还是没有抗虫能力 科学家又在有启动子 抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子 导入棉花受精卵 结果成长的植株 有了抗虫能力 资料证明 表达载体构建组成要完整 载体与表达载体的区别 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 表达载体在载体基础上增加了目的基因 启动子 终止子三部分结构 用到的工具酶 既用到限制酶切割载体 又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接 两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子 终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞 必需以表达载体的方式携带进去 注意 三 将目的基因导入受体细胞 一 转化 二 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 例 若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗 答 不可以 糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成 而内质网和高尔基体存在真核细胞中 大肠杆菌是原核生物 细胞中不含这两种细胞器 以酵母菌作为工程菌可以吗 答 可以 酵母菌为真核生物 真菌类 四目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 导入过程完成后 全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少 目的基因进入受体细胞后 是否都能稳定维持和表达 不一定 需要检测 1 检测方法 分子杂交技术 1 DNA分子与DNA分子的之间杂交 2 DNA分子与RNA分子的之间杂交 3 蛋白质分子 抗原与抗体 之间杂交 2 个体生物学水平的鉴定 抗虫 抗病结种实验 活性比较实验 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗 不能 受体细胞必须表现出特定的性状 才能说明目的基因完成了表达 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 P15思考与探究 归纳 基因工程的基本操作程序 获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因 启动子 终止子 标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法 显微注射法目的基因的检测与鉴定检测 是否插入 转录 翻译鉴定 练习1 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 1 获得耐盐基因后 构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处 DNA连接酶作用于处 填 a 或 b a a 练习1 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 2 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法 3 由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术 该技术的核心是和 4 为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测 又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性 基因枪法 花粉管通道法 植物组织培养 脱分化和再分化 耐盐基因 一定浓度盐水浇灌 巩固练习 1 人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因 该抗性基因的主要作用是 A 提高受体细胞在自然环境中的耐药性B 有利于对目的基因是否导入进行检测C 增加质粒分子的分子量D 便于与外源基因连接2 在遗传工程技术中 限制性内切酶主要用于 A 目的基因的提取和导入B 目的基因的提取和检测C 目的基因与载体的结合和导入D 目的基因的提取与载体结合 B D 3 在遗传工程技术中 下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 A 人的胰岛素基因B 蚕的蚕丝蛋白基因C 芽孢杆菌的抗虫基因D 菜豆储藏蛋白基因4 1976年 美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌 并获得了表达 此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 A 能进行DNA复制B 能传递给细菌后代C 能合成生长抑制素释放因子D 能合成人的生长素 C C 1 下列属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用P