血栓与止血是一门新兴的边缘学科.doc

血栓与止血是一门新兴的边缘学科，涉及基础医学及预防医学的各个领域。 在血栓/止血实验室中最基本的设备就是血液凝固分析仪（以下简称血凝仪）。利用血凝仪进行血栓与止血的实验室检查，可为出血性和血栓性疾病的诊断、溶栓以及抗凝治疗的监测及疗效观察提供了有价值的指标。随着科学技术的日新月异，血栓与止血的检测从传统的手工方法发展到全自动血凝仪，从单一的凝固法发展到免疫法和生物化学法，血栓与止血的检测也因此变得简便、迅速、准确、可靠。 第一节血凝仪的发展概况 1910年Kottman发明了世界上最聚早的血凝仪，通过测定血液凝固时的粘度的变化来反应血浆凝固的时间。 1922年，Kugelmass用浊度计通过测定透射光的变化来反应血浆凝固时间。 1950年，Schnitger和Gross发明了基于电流法的血凝仪。 60年代，机械法血凝仪得到开发。 70年代以后，由于机械、电子工业的发展，使各种类型的全自动血凝仪先后问世。 80年代，由于发色底物的出现并应用于血液凝固的检测，使全自动血凝仪除了可以进行一般的筛选试验外，尚可以进行凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子的检测。 80年代末，双磁路磁珠法的发明给血栓与止血的检测带来新概念，由于其独特的设计原理，使光学法检测的一些影响因素在本类型的检测仪器上均不复存在。 90年代，全自动血凝仪免疫通道的开发又为血栓与止血的检测提供了新的手段。 第二节血凝仪的基本原理 表1列出了目前可开展的血栓/止血成份检测方法，主要方法有凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集法等。在表中可注意到，在血栓/止血检验中最常用的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）、内源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等均可用凝固法测量。所以目前半自动血凝仪基本上都是以凝固法测量为主，而在全自动血凝仪中也一定有凝固法测量。 凝固法中又可分为光学法和磁珠法两类。由于光学法几乎可涵盖各种检测方法，为了降低仪器制造成本，全自动血凝仪以光学法居多。但也有少数高级全自动血凝仪中凝固法测量采用无样品干扰的双磁路磁珠法，而其它测量采用光学法，并可同时进行检测。 测定项目 凝固法 底物 显色法 乳胶 凝集法 ELISA 凝血酶原时间（PT） 活化部分凝血活酶时间（APTT） 凝血酶时间（TT） 纤维蛋白原（FIB） 外源性凝血因子II、V、VII、X 内源性凝血因子VIII、IX、XI、XII 凝血因子VIII 肝素 低分子量肝素 抗凝血酶III（AT-III） 蛋白C（PC） 蛋白S（PC） 血栓调节蛋白（Thromodulin） 活化蛋白C抵抗性（APC-R） 纤溶酶原（PLG） 2抗纤溶酶（2-AP） 补体1脂酶抑制物（CI） 组织纤溶酶原激活物（t-PA） 纤溶酶原激活物抑制物（PAI） 纤维蛋白单体 纤维蛋白降解产物（FDP） D-二聚体（D-Dimer） 纤维蛋白肽A（FPA） 凝血酶原断片1+2（F1+2） 表1血栓/止血成份检测方法 （一）凝固法（生物物理法） 凝固法是通过检测血浆在凝血激活剂作用下的一系列物理量的变化（光、电、机械运动等），由计算机分析所得数据并将之换算成最终结果，所以也可将其称作生物物理法。 1. 电流法 电流法（图1）利用纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性的特点，将待测样品作为电路的一部分，根据凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。 由于该电流法的不可靠性及单一性，很快被更灵敏、更易扩展的光学法所淘汰。. 光学法（比浊法） 光学式血凝仪是根据凝固过程中浊度的变化来测定凝血的。根据不同的光学测量原理，又可分为散射比浊法和透射比浊法两类。 （1）散射比浊法：散射比浊法（图2）是根据待验样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90直角，当向样品中加入凝血激活剂后,随着样品中纤维蛋白凝块的形成过程，样品的散射光强度逐步增加，仪器把这种光学变化描绘成凝固曲线，当样品完全凝固以后，散射光的强度不再变化。通常是把凝固的起始点作为0%，凝固终点作为100%，把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光的变化，将其转化为电信号，经过放大再被传送到监测器上进行处理，描出凝固曲线。当测定含有干扰物（高脂血症、黄疸和溶血）或低纤维蛋白原血症的特殊样本时，由于本底浊度的存在，其作为起始点0%的基线会随之上移或下移，仪器在数据处理过程中用本底扣除的方法来减少了这类标本对测定的影响。但是这是以牺牲有效信号的动态范围为代价的，对于高浊度标本并不能有效解决问题。 接收器 光源 样品 光源样品接收器 图2散射比浊法示意图 图3透射比浊法示意图 （2）透射比浊法：透射比浊法（图3）是根据待测样品在凝固过程中吸光度的变化来确定凝固终点。与散射比浊法不同的是该方法的光路同一般的比色法一样呈直线安排：来自光源的光线经过处理后变成平行光，透过待测样品后照射到光电管变成电信号，经过放大后在监测器处理。当向样品中加入凝血激活剂后，开始的吸光度非常弱，随着反应管中纤维蛋白凝块的形成，标本吸光度也逐渐增强，当凝块完全形成后，吸光度趋于恒定。血凝仪可以自动描记吸光度的变化并绘制曲线，设定其中某一点对应的时间为凝固时间。 就浊度测量原理而言，散射比浊法更为合理、准确。在这类仪器中，光源、样品、接收器成直角排列，接收器得到的完全是浊度测量所需的散射光。 而在透射比浊法中，光源、样品、接收器成一直线排列，接收器得到的是很强的透射光和较弱的散射光，前者是有效成份，后者应扣除，所以要进行信号校正，并按经验公式换算到散射浊度。此法虽仪器简单，但精度较差。 在上述的设计中都是吸光度从弱变强，而有的产品设计正好相反吸光度从强变弱。 例如在“光电磁珠法”的设计中，在待测样本中加入具有一定浊度的试剂和一粒钢珠，钢珠在磁场的作用下起搅拌作用，样本在凝固过程中产生的纤维蛋白丝不断缠绕于钢珠上，使液体反而逐渐变清，吸光度值逐渐降低。该方法重复性好，监测范围大（可以监测结果超高和低纤维蛋白原的各种异常血浆），但是由于仍以监测吸光度变化为依据，所以无法从根本上解决溶血、高脂血症或乳糜微粒、浑浊等干扰物对检测的影响。 光学法凝血测试的优点在于灵敏度高、仪器结构简单、易于自动化，缺点是样品的光学异常、测试杯的光洁度、加样中的气泡等都会成为测量的干扰因素。针对光学法血凝仪遇到有较高初始浊度的样品就无能为力的弱点，不同型号的光学法血凝仪采取了各种不同的措施。例如，有的用本底扣除的百分浊度法（图4），这对中、低初始浊度有补偿作用，而不能解决高浊度样品的测试；又如，有的利用一阶微分的峰值作为凝固终点（图5），但微分处理会引起重复性变差。 3. 双磁路磁珠法 早期的是在检测杯中放一粒磁珠，与杯外一根铁磁金属杆紧贴呈直线状，标本凝固后，由于纤维蛋白的形成，使磁珠移位而偏离金属杆，仪器据此检测出凝固终点。这类仪器也可称为平面磁珠法。早期的平面磁珠法虽能有效克服光学法中样品本底干扰的问题，但也存在着灵敏度低等问题。 现代磁珠法在八十年代末提出、九十年代初商品化。现代磁珠法曾形象地称为摆动磁珠法，不过双磁路磁珠法的名称更为确切。双磁路磁珠法的测试原理（图6）如下：测试杯两侧的有一组驱动线圈，它们产生恒定的交替电磁场，使测试杯内特制的去磁小钢珠保持等幅振荡运动。凝血激活剂加入后，随着纤维蛋白的产生增多，血浆的粘稠度增加，小钢珠的运动振幅逐渐减弱，仪器根据另一组测量线圈感应到小钢珠运动的变化，当运动幅度衰减到50%时确定凝固终点。 双磁路磁珠法进行凝血测试，完全不受溶血、黄疸及高血脂症的影响，甚至加样中产生气泡也不会影响测试结果。 光学法血凝仪的试剂用量只有手工测量的一半。而磁珠法的试剂用量只有光学法的一半！这是因为在比浊测定过程中，激发光束必须打在测试杯的中间，所以要有足够的试剂量。在双磁路磁珠法测量中，钢珠在测试杯的底部运动，因此试剂只要覆盖钢珠运动即可。 双磁路磁珠法中的测试杯和钢珠都是专利技术，有特殊要求。测试杯底部的弧线设计与磁路相关，直接影响测试灵敏度。小钢珠经过多道工艺特殊处理，完全去掉磁性。在使用过程中，加珠器应远离磁场，避免钢珠磁化。为了保证测量的正确性，钢珠应当一次性使用。 磁珠振幅检测电路 磁珠振幅检测电路 图6双磁路磁珠法示意图 血凝仪的测量过程中，充分搅拌至关重要，这对于凝血过程的描述和凝固终点的判断都会有很大帮助，CV会有很大改进。在仪器中常用磁珠搅拌或离心方式来达到目的。现在有相当一部分光学式半自动血凝仪采用磁珠搅拌。有人误以为这就是磁珠法。实际上，以测量吸光度变化来研究凝血过程的，其实质都属于光学比浊法。例如“光电磁珠法”、“光电电磁法”等，都回避不了光学法的缺陷。 如果把测试杯用墨涂黑，那么在磁珠法血凝仪中仍可测量，而在光学法血凝仪则是“一团漆黑”，无法测量了。至此，也就容易理解为何双磁路磁珠法样品的黄疸、溶血等混浊的影响。 由于磁珠法中测量的是磁电信号，对测试杯无任何光学要求，所以测试杯可反复清洗使用。而光学比浊法中，测试杯不能有擦痕，一般不宜重复使用。 （二）底物显色法（生物化学法） 底物显色法（图7）通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的，该方法又可称为生物化学法。检测通道由一个卤素灯为检测光源，波长一般为405nm。探测器与光源呈直线，与比色计相仿。 凝血仪使用产色底物检测血栓与止血指标的原理是：通过人工合成与天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序并还有特定作用位点的小肽,并将可水解产色的化学基因与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白不解酶的活性，它不仅作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基因，使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系，故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种，而最常用的是对硝基苯胺（PNA），呈黄色，可用405mm波长进行测定。 底物显色法灵敏度高、精密度好，而且易于自动化，为血栓/止血检测开辟了新途径。 底物显色法通常使用以下三种形式： a)先将被检血浆中的某种酶加以激活，然后由此活化的凝血因子对人工合成的底物进行水解而呈色，如纤溶酶原，蛋白C测定等。 b)向被检血浆中加入过量的有关试剂，以中和相应的抗凝因子，然后测定其残余的酶活性，如AT-活性测定，2-抗纤溶酶测定，肝素测定等。 以测定抗凝血酶(AT-)为例，在反应体系中加入过量的凝血酶，后者与血浆中的AT-形成1：1复合物，剩余凝血酶作用于合成的凝血酶底物S-2238（H-D-Phe-Pip-Arg-PNA2Hcl），释放出显色基团PNA，显色反应的深浅与剩余凝血酶的量呈正相关，而与AT-的活性呈负相关。 c)直接测定被检血浆中某种蛋白水解酶的活性，如凝血酶，Xa，尿激酶测定等。 （三）免疫学方法 在免疫学方法中以纯化的被检物质为抗原，制备相应的抗体，然后用抗原抗体反应对被检物进行定性和定量测定。常用方法有：1免疫扩散法将被检物与相应抗体在一定的介质中结合，测定其沉淀环的大小，与标准进行比较，计算待测物的浓度。此法操作简单，不需特殊设备，但耗时过长，且灵敏度不高，仅适于含量较高的凝血因子的检测。 2火箭电泳在一定电场中，凝胶支持物内的被检测与其相应抗体结合形成的一个个“火箭峰”，火箭峰的高度与其含量成正比，通过测定峰高并与标准比较而进行定量测定。此法操作复杂，临床应用较少。 3双向免疫电泳通过水平与垂直两个方向进行电泳可将某些分子结构异常的凝血因子进行分离。 4.酶联免疫吸附试验（ELISA法）用酶标抗原或抗体和被检物进行抗原结合反应，经过洗涤除去未结合的抗原或抗体及标本中的干扰物质，留下固定在管壁的抗原抗体复合物，然后加入酶的底物和色原性物质，反应产生有色物质，用酶标仪进行测定，颜色的深浅与被检物浓度呈比例关系。该法灵敏度高，特异强，目前已用于许多止血、血栓成分的检测。 5免疫比浊法将被检物与其相应抗体混合形成复合物，从而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比浊或散射比浊进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。 免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。 直接浊度分析既可通过透射比浊，也可通过散射比浊。 透射比浊是指凝血仪光源的光线通过待检样本时，由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗体复合物，使透过的光强度减弱，其减弱程度与抗原量成一定的数量关系，通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。 散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时，由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物，使溶质颗粒增大，光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系，通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。 另一种是乳胶比浊法，即将将待检物质相对应的抗体包被在直径为1560nm的乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集，体积增大，使透射光和散射光的变化更为显著，从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前，多用于FDP和D-二聚体的检测。 第3节 血凝仪的基本结构 血凝仪按自动化程度可分为半自动化及全自动化，前者主要检测一般常规凝血项目，后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能，除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能进行全面的检测，尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室监测。 （1） 半自动血凝仪 目前市售的半自动血凝仪主要由样品、试剂预温槽、加样器、检测系统（光学、磁场）及微机组成。有的半自动仪器还配备了发色检测通道，使该类仪器同时具备了检测抗凝及纤维蛋白溶解系统活性的功能。 针对光学式半自动血凝仪受人为的因素影响多、重复性较差等缺陷，仪器中应有自动计时装置，以告知预温时间和最佳试剂添加时间；在测试位添加了试剂感应器，后者感应从移液器针头滴下的试剂后自动振动，使反应过程中血浆与试剂得以很好地混合；此外，该类仪器在测试杯顶部安装了移液器导板，在添加试剂时由导板来固定移液器针头，从而保证了每次均可以在固定的最佳的角度添加试剂并可以防止气泡产生。这一系列改进，提高了光学式半自动血凝仪检测的准确性。 一般半自动血凝仪都可进行凝固法测试，而需要用其它测试方法实现的凝血项目则可用生化分析仪、酶标仪等进行。 （2） 全自动血凝仪 该类仪器的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。图8为一台全自动血凝仪的实例。 1.样品传送及处理装置一般血浆样品由传送装置依此向吸样针位置移动，多数仪器还设置了急诊位置，可以使常规标本检测必要时暂停以服从免疫比浊法将被检物与其相应抗体混合形成复合物，而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比法或散射比浊进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。 直接浊度分析既可通过透射比浊，也可通过散射比浊。 透射击比浊法是指凝血仪光源的光线通过待检样本时，由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗菌素体复合物，使透过的光强度减弱，其减弱程度与抗原量成一定的数量关系，通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。 散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时，由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物，使溶质颗粒增大，光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系，通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。 另一种是乳胶比浊法，即将待检物质相对应的抗体包被在直径为1560nm的乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集团，体积增大，使透射光和散射光的变化更为显著，从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前，多用于FDP和D-二聚体的检测。 急诊标本的优先测定。样品处理装置由标本预温盘及吸样针构成，前者可以放置几十份血浆样品。吸样针将血浆标本吸取后放于预温盘的测试杯中，可供重复测试，自动再稀释和连锁测试之用。 2.试剂冷藏位为避免试剂的变质，仪器往往有试剂冷藏功能，一般同时可以放置几十种试剂进行冷藏。 3.样品及试剂分配系统样品臂会自动提起标本盘中的测试杯，将其置于样品预温槽中进行预温。然后试剂臂将试剂注入测试杯中（性能优越的全自动血凝仪为避免凝血酶对其他检测试剂的污染，有独立的凝血酶吸样针），带有旋涡混合器的装置将试剂与样品进行充分混合后将送至测试位，经检测的测试杯被该装置自动丢弃于特设的废物箱中。 4检测系统这是涉及仪器测量原理的关键部分。检测血浆的凝固可以通过凝固反应检测法检测，即当纤维蛋白凝块形成时，检测散射光在660nm处浑浊液吸光度的变化；或通过凝固点检测法检测，即计算达到预先设定好的吸光度值时的凝固时间；而磁珠法则是通过测定在一定磁场强度下小钢珠的摆动幅度变化来测定血浆凝固点。发色底物法及免疫法是检测反应液在405nm、575nm及800nm时的吸光度变化来反映被检测物质的活性。 5.电子计算机根据设定的程序计算机指挥血凝仪进行工作并将检测得到的数据进行分析处理，最终得到测试结果。计算机尚可对患者的检验结果进行储存，记忆操作过程中的各种失误，及进行质量有关的工作。 6.输出设备通过计算机屏幕或打印机输出测试结果。 7.附件主要有系统附件、穿盖系统、条码扫描仪、阳性样品分析扫描仪等。 现代全自动血凝仪有以下一些性能特点，使它在临床应用中日益受到欢迎： 测速度快、检测项目齐全目前广泛使用的的检测速度多在50300测试/小时，较快的可达700测试/小时；检测的项目除常规的凝血筛选实验外，可进行单个凝血抗凝、纤溶系统因子的检测，也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。 活性与抗原性同时检测目前有的全自动血凝仪除了利用血浆凝固法和显色底物法进行有关因子活性检测外，尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。 检测通道、同时检测项目性能优越的血凝仪有多个检测通道，同时检测的项目可以多达10个。 标本及试剂位全自动血凝仪一般有超过50个标本位，有的尚设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的血凝仪设有几十个15的试剂位，可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机，有的仪器检测时可以不打开样品管，从而使检测的自动化又有提高。 平行线生物学分析功能有的血凝仪可以进行全自动多浓度稀释分析，根据与标准曲线呈平行状态的平行线图象来显示不同稀释浓度的测试结果。 自动重检、连锁功能当检测结果异常时，有的全自动血凝仪可以根据先前的设定，自动对样品进行稀释重检或不稀释重检，并进行自动连锁筛选实验。如当APTT检测结果异常时，仪器可以自动进行重检，结果如仍然异常，血凝仪自动进行PT测定，若结果正常，根据设定，仪器可以自动检测F：C、FIX：C、FXI：C或F：C；若PT的结果亦为异常，仪器可以自动检测Fib的含量。质量控制有些全自动血凝仪拥有10组各2个质控文件，1个为现用质控文件，另一个是新批号质控文件，以全面支持实验室质控要求。在均数或L-J之外，有的全自动血凝仪还另外附加了一种新型的多规则质控方法（Westgard），从而为检验提供具有高可靠性的测试结果。 结果的储存、传递计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存，通过特定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。 科研通道目前较高级的血凝仪均为用户设计了科研通道，使其应用范围得以扩大。 开放的试剂系统根据我国的国情，许多仪器厂商在血凝仪上设置了开放的试剂检测系统，以使用户可以灵活选用不同试剂进行检测。 第四节血凝仪的检测项目 目前的半自动血凝仪以凝固法测定为主，而全自动血凝分析仪可以进行凝血、抗凝和纤维蛋白溶解系统功能的测定。 1 凝血系统可以进行凝血系统的筛选实验：如凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）测定；也能进行单个凝血因子含量或活性的测定，2 如纤维蛋白原（FIB）、凝血因子、。 3 抗凝系统可进行抗凝血酶（AT-）、蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗活化蛋白C（APCR）、狼疮抗凝物质（LAC）等测定。 4 纤维蛋白溶解系统可测定纤溶酶原（PLG）、2-抗纤溶酶（2-AP）、FDP、D-二聚体（D-Dimer）等。 5 临床用药的检测当临床应用普通肝素（UFH）、低分子肝素（LMWH）及口服6 抗凝剂如华发灵时，7 可用血凝分析仪进行监测以保用药安全。 第五节血凝仪的发展和应用展望 血凝仪的发展较生化分析仪为短，70年代凝血因子的活性检测方法问世，80年代发色底物技术的广泛运用使抗凝、纤溶的检测成为可能，近年来，血凝仪普遍安装了免疫比浊技术通道及软件，结果使血栓与止血的自动化检测日臻完善；同时由于全自动血凝仪检测的快速、简便、结果准确及精密度高等特点，极大地提高了检测的速度及质量。 血凝仪的发展方向与全自动生化分析仪一样进一步提高仪器的检测的自动化程度，如将自动离心机处理的标本通过传输装置运至全自动血凝仪；ID条形码识别装置识别样本，根据不同的测试要求对样品进行分配，由盖帽贯穿式进样机吸样后血凝仪自动进行检测，计算机对结果进行分析、报告并传输至指定场所；提高仪器检测的灵敏度与特异性，使检测结果更符合检测实际；逐步缩小不同仪器检测结果的差异，增强检测结果的可比性，进一步完善检测的标准化；建立血凝检测的网络化，使同一患者在不同的医疗单位的检测结果可以交互使用，有利于减轻患者的负担及疗效的判断；对于在中国销售的血凝仪，应促使生产厂实现人机操作界面的汉化，以利于血栓与止血检测的自动化的普及和提高。 参考文献： 王鸿利。血栓与止血实验室检查的应用。见汪钟、郑植荃。现代血栓病学。北京，北京医科大学-协和医科大学联合出版社，1997；456475。 何鞠诚，邓新立。凝血仪及临床应用。见丛玉隆、王淑娟主编。今日临床检验学。北京，中国科学技术出版社。1997；196203。 胡翊群、王鸿利、熊树民主编。现代血液学与临床实践。上海，上海科学技术文献出版社。1999；115181。 TomasLC.Mutiplemeasuringmodesofcoagulationinsruments.ClinHemoRev.1993;13(8):6 LeeGR.Wintrobesclinichematology,10thBaltimore:Williams&Wilkins.1999. (王学锋、王鸿利) 止凝血机理概述 止血是机体的重要保护功能，如果止血功能异常，则可导致病理性出血或血栓形成。正常的止血功能是由血管、血小板和血液的凝固性来完成的。三者相互联系，协同作用。 第一部分血管壁的止血功能 血管壁的结构及舒缩功能调节 血管壁的结构 血管壁的完整性及通透性是保证血流通畅的前提。如果血管内皮损伤，胶原物质暴露则可促进血小板粘附和聚集，加速血栓的形成。血管舒缩的调节 微循环中的小血管舒缩状态对止血起着一定的作用。血管收缩血流减慢时，局部凝血物质的积聚可致局部高凝状态，有利于止血，甚至导致血栓形成。若血管扩张，血流加速，凝血物质易被冲走，则不利于止血，阻止血栓形成。影响血管舒缩的因素如下： 体液因素：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、5-HT等均可影响血管的舒缩。 多肽类：血管紧张素、血管加压素可使血管收缩激肽类使血管扩张。 花生四烯酸的代谢产物： 前列环素（PGI2）可使血管明显扩张，而血栓素A2（TXA2）使血管收缩。 在正常情况下，体内产生的血管舒缩物质处于动态平衡状态，因此血流通畅、流速稳定，如果上述物质的动态平衡失调。例如缩血管物质增多，则有利于血管损伤后的止血。但若持续太久，则可导致局部血栓的形成。 血管壁与血小板的相互作用 体内一定数量的血小板是有保护血管壁完整性的功能。当血小板明显减少时，皮肤毛细血管脆性增高，可出现紫瘢，其原因与毛细血管内皮细胞功能改变有关。（主要是毛细血管的通透性），因为血小板致密颗粒内含有的5-HT可使内皮细胞收缩，从而维持血管壁的完整性。另外内皮细胞合成和分泌的相关抗原（即VW因子）是血小板粘附功能所必需的因子。如果VW因子缺乏，则血小板的粘附功能降低，即会出现出血现象。 正常内皮细胞层具有生物屏障功能，可阻止血浆中的大分子物质，包括一些凝血因子和血小板与内皮下层接触。此外，内皮细胞和血小板表面均有一层含唾液酸的糖蛋白和糖脂的细胞外衣，两者均带负电荷。故可阻止两者相互紧密接触。当内皮细胞受到某些因素的刺激或损伤时，血小板与血管壁即可发生过强的相互作用，如血小板粘附、聚集和释放反应增强，从而导致病理作用。 导致血管内皮受损的病因 血管内血流状态的改变 在血管分枝处血流呈旋涡状，常可引起血小板粘附或聚集成团。血流受到障碍之处血流减慢，使一些有害物质，如代谢产物、抗原抗体复合物等在局部停留，导致内皮细胞损伤，产生病理作用。（如血栓的形成） 内皮细胞损伤 内皮细胞损伤引起血小板的粘附、聚集、多见于下列情况： 血流受阻血液淤滞引起内皮细胞间隙增大、细胞水肿。 化学物理及生物因素：高胆固醇可改变内皮层的功能，促使血小板与血管壁相互作用增强，另外还有吸烟、病毒、内毒素、胆盐、放射线和免疫复合物都可引起血管内皮细胞损伤。 免疫因素：内皮细胞的自身特异抗体或致敏淋巴细胞可损伤内皮细胞，主要是激活补体，特别是C5a吸引WBC粘附于内皮层并释放脂质过氧化物，造成内皮细胞的严重损伤。 血小板释放产物对内皮细胞的作用： 血小板与受损的内皮细胞或皮下层相互接触可使血小板释放一些因子，如肾上腺素。5-HT使内皮细胞收缩，使粘附聚集的血小板轩脱落，如ADP、组胺可增加内皮层的通透性，PGE2（前列腺素内过氧化物E2）可使内皮层生物屏障功能破坏，使血浆中的凝血因子直接与皮下层接触，引起血栓形成。 受损血管的止血作用 受损血管在止血过程中所起的作用有以下几个方面： 血管收缩 血管受损时立即发生明显的收缩，所有的血管都有这种功能。血管的收缩使血流减慢，使凝血物质在局部堆积，并使血小板粘附、聚集增加，有利于止血。血管的收缩包括神经的因素和体液的因素。 内皮细胞的抗凝功能减弱 在正常情况下，内皮细胞能合成分泌一些抗凝物质，如PGI2、tpA、血栓调节蛋白（加速蛋白C的活化）AT-等，如果内皮细胞受损严重，上述一些抗凝物质减少，则常导致血栓形成。 内皮细胞的促凝功能增强 实验证明，内皮细胞在内毒素的刺激下，可增加组织因子的释放，启动外源性凝血系统促进凝血过程，最近研究提示，内皮细胞还能促进内源性X因子的激活和凝血酶原酶复合物的形成。 激活内外源性凝血系统 受损的血管壁释放组织因子启动外源凝血系统。内皮下组织暴露双可激活因子，启动内源凝血系统形成凝血酶促进凝血过程，有利于止血。局部血粘度增高 血管内皮受损后，内皮下层组织不仅可以激活因子，并通过a激活激肽酶原转变为激肽释放酶，后者再将激肽原转变为激肽，使毛细血管通透性增加，此外，血小板激活后释放血小板通透因子亦可使毛细血管通透性增加，使血浆外渗、局部血液浓缩、血粘度增高，使血流变慢，有利于局部止血。 第二部分血小板的止血功能 血小板是由骨髓及少数其它部位（如肺）中的巨核细胞产生的。正常状态的血小板呈两面微凸的圆盘状，形似运动员用的铁饼，血小板的平均直径2-3m，平均体积为8m3。血小板是一个多功能的细胞。它在生理性止血以及某些病理过程，如血栓形成、动脉粥样硬化、癌肿转移和炎症反应等过程中起着重要的作用，血小板在这些生理和病理过程中所起的作用与血小板粘附，释放和聚集等活性密切相关。 血小板初期止血功能 正常的初期止血，首先是血管壁收缩改变了局部的血液动力学特性，流动在血管内的血小板在血浆VWF（血管性假血友病因子）存在下，粘附于受损的内皮下组织，在ADP和TXA2（血栓烷A2或血栓素A2）的作用下引起血小板聚集，加上血浆纤维蛋白原的参与，形成白色血栓，血小板在初期止血过程中发生粘附变形释放聚集等反应，这些是血小板的基本反应，统称为血小板的活化反应。 血小板的粘附反应 血小板的粘附反应是指血小板粘附于血管壁或其它的异物表面的特性，目前认为血小板的粘附除了流变学的因素外。起主要作用的成份有三个：血小板膜的糖蛋白I、血浆因子相关蛋白和皮下组分（胶原或纤维）。糖蛋白I6缺乏的病人血小板粘附有缺陷，多见于巨大血小板病。血浆由两种蛋白分子组成，因子凝血蛋白（简称：C）其缺损者为血友病甲；因子相关蛋白（简称：R）亦称VonWillebrand因子（简称VWF）。它不仅在血浆中作为：C的载体，而且与血小板粘附功能有关、：R缺损者为血管性假血友病，即VonWillebrand病（VWD）。血管内皮下组织有许多成份如胶原、微纤维、弹性蛋白纤维连接蛋白，但与血小板粘附有关的主要是胶原和微纤维，尤其是胶原中的型，被认为是引起血小板粘附与聚集的活性中心。而微纤维引起的血小板粘附与聚集要依赖于因子相关蛋白的存在。血小板的粘附功能可因损伤处的血流发生涡流而引起血小板表面活性增加，可促使血小板的激活，同时也可损伤红细胞。血小板的这种功能是机体止血和血栓形成的启动步骤。血小板的粘附性可用粘附仪来测定，其正常值为：男34.905.95%女39.405.19% 血小板的聚集反应 粘附的血小板立即发生变形、释放和聚集等一系列活化反应，血小板聚集是指活化粘附血小板相互作用聚集成团的特性。研究证实ADP是诱导血小板聚集的主要介质。目前认为血小板聚集至少可通过三条途径：ADP途径，前列环素内过氧化物及TXA2途径，PAF途径（血小板激活因子）。70年代中期，人们研究证实前列腺素环内过氧化物和TXA2是引起血小板聚集的主要介质。阿斯匹林的药理作用就是通过抑制环氧化酶，从而影响血小板的聚集反应，一些研究提示PAF具有钙离子载体的作用抑制钙流的药物如异博定、三氟拉嗪等均能通过阻断PAF的作用而引起抑制血小板聚集的作用。在血小板聚集过程中，除了Fib和钙离子以外，血小板膜糖蛋白b和a也起着重要作用。缺失GPb或a将出现血小板无力症而使血小板不能聚集。血小板的聚集功能可用血小板聚集仪来测定。其正常参考值为：男42.068.0%女48.5070.50%（以ADP为诱导剂） 血小板的释放反应 血小板在各种诱导剂的作用下，将其颗粒内容物释放出的反应称为释放反应，也有称之为分泌反应。这是体现血小板生理功能的重要反应，因为大部分血小板的功能是通过释放反应时形成或释放出的物质所产生的生物效应得以实现的。血小板的释放反应很迅速，依诱导剂不同所需时间在20200s。血小板的释放反应主要由血小板内的致密斑颗粒和颗粒来完成，致密斑颗粒主要释放ADP和5-HT。而颗粒主要释放血小板第4因子（PF4）和血小板球蛋白（TG）。 血小板的二期止血功能 血小板除了具有初期止血功能外，在血液凝固中亦起着重要作用。血小板表面吸附有各种凝血因子，如血浆Fib，因子、和，此外还含有“内源性”凝血因子（如血小板Fib、/VWF、等）这些因子在血小板活化时都参与凝血过程。另外血小板膜表面具有的促凝活性称为血小板第3因子（PF3）、PF3参与了的活化及凝血酶原转变为凝血酶的反应，促使产生大量的凝血酶。血小板的颗粒分泌的PF4具有中和肝素的作用，保护了凝血酶免受肝素的破坏。 除了促凝活性外，血小板还有促使血块收缩和维护血管内皮完整的生理功能。激活的血小板在纤维蛋白网中伸出伪足联接到相邻的血小板或纤维蛋白原上，当伪足收缩时，挤出纤维网中血清，使血块得以加固，有利伤口愈合。血小板与内皮细胞紧密结合，阻止RBC从毛细血管逸出，降低毛细血管的脆性具有保护血管内皮的完整性的作用。 第三部分抗凝及纤溶系统 正常抗凝是机体防止在血管内形成血栓，保证血液能在血循环中正常运行的重要功能。因为即使在正常情况下，不可避免地会有极少量的凝血因子被激活或促凝物质进入血液循环，形成凝血酶，使Fib转变为纤维蛋白。凝血过程需要有抗凝功能来对抗，已形成的纤维蛋白要通过纤溶系统使其溶解。故抗凝及纤溶与凝血处于动态平衡状态，若平衡遭到破坏，则会发生出血，相反引起血栓形成。 抗凝的机理