卵巢上皮性癌p53基因突变的检测和序列分析.doc

卵巢上皮性癌p53基因突变的检测和序列分析中华妇产科杂志 1998年第3期第0卷 论著作者：关新郎景和卞美璐单建军关钧范慕贞单位：100029 北京，中日友好医院妇产科(关新、卞美璐)，临床研究所生化室(关钧、范慕贞)；北京协和医院妇产科(郎景和)；吉林炭素厂职工医院妇产科(单建军)关键词：卵巢肿瘤；基因；p53；突变；聚合酶链反应【摘要】目的了解卵巢上皮性癌p53基因突变的特点及其与临床分期的关系。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性检测(PCR-SSCP)和序列分析的方法对46例卵巢上皮性癌进行外显子5、6、7突变的检测和分析。结果p53基因突变8例并得到证实。包括8个点突变(6个错义突变，1个静息突变和1个内含子突变)和1个碱基对插入突变(在下游产生终止信号)。突变中碱基转换突变占总突变的88.9%(8/9)，并以GA的转换突变为主，占转换突变的87.5%(7/8)。175、245位密码子的突变占总突变的62.5%。临床、期的突变率为20.0%，临床、期为16.7%，差异无显著性(P0.05)。结论卵巢上皮性癌p53基因突变是自发性突变，是由于DNA合成和修复过程中的随机错误所致。175与245位密码子可能是卵巢上皮性癌p53基因突变的主要位点。p53基因突变与临床分期无关，故认为p53基因突变于卵巢癌早期就有所发生，并持续于肿瘤发展的全过程。 Detection and Sequence Analysis of the p53 Gene Mutation in Epithelial Ovarian CancerGuan Xin, Lang jinghe, Bian Meilu, et al. China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029【Abstract】ObjectiveTo find thd characteristics of p53 gene mutation in epithelial ovarian cancer and to analyze the relationship between p53 mutation and FIGO stage. Methodsp53 mutations in exon 5 to 7 were detected by single-strand conformational polymorphism (SSCP) and sequencing technique. Results8 of 46 tumor tissues demonstrated a SSCP band shift in the region of the gene. All of them have been characterized to represent DNA alterations by sequencing, including 8 point mutations (6 missence, 1 silent mutation and 1 in intron) and a 1-base pair insertion (introducing a stop codon downstream). Overall, 88.9% of mutation were transitions, and most of them are GA transitions (7/8, 87.5%). 62.5% of the mutation were found in 175 and 245 codon. The percentage of the mutation in stage and stage was 20.0%, and in stage and stage was 16.7% (P0.05). ConclusionThe arising of p53 mutations in ovarian cancer is due to spontaneous error in DNA synthesis and repair. Codon 175, 245 are the two mutational hot spots. There is no relationship between the mutation of p53 gene and FIGO stage in epithelial ovarian cancer.【Key words】Ovarian neoplasmsGenes, p53MutationPolymerase chain reaction据文献报道1，2，卵巢癌p53基因突变可散见于编码区的不同部位，主要集中在129149，171179，234260，260287区域，相当于外显子5、6、7、8范围内。因此，我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性检测(PCR-SSCP)和序列分析的方法对46例卵巢上皮性癌组织进行了p53基因外显子5、6、7突变的检测和分析。现将结果报告如下。材料与方法一、标本收集46例卵巢上皮性癌及癌旁正常组织分别取自1992年至1996年中日友好医院及北京协和医院妇科手术标本，均经病理证实。其中粘液性癌4例，浆液性癌14例，粘液性与浆液性混合癌1例，透明细胞癌6例，子宫内膜样癌13例，未分化腺癌8例。按1985年FIGO标准进行临床分期。其中，期8例，期2例，期29例，期7例。二、实验方法1.基因组DNA的提取及PCR扩增：按照卢圣栋3的酚、氯仿、异戊醇抽提法提取DNA，PCR所用3对引物由中国科学院微生物所合成，引物序列见表1。表1PCR扩增所用引物序列外显子引物序列长度(bp)5a 5-TGTTC ACTTG TGCCC TGACT-3320b 5-AGCAA TCAGT GAGGA ATCAG-36a 5-TGGTT GCCCA GGGTC CCCAA-3244b 5-TGGAG GGCCA CTGAC AACCA-37a 5-CTTGC CACAG GTCTC CCCAA-3256b 5-AGGGG TCAGC GGCAA GCAGA-3PCR反应条件为94，45秒；55，45秒；72，60秒；35个循环之后在72下再延伸7分钟。PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。2.SSCP检测基因变异：根据Saiki等法4并稍作改进。将PCR产物与变性液(95%甲酰胺、20 mmol EDTA, 0.05%二甲苯蓝FF和溴酚蓝)混匀后，97下变性10分钟后骤冷。10%中性聚丙烯酰胺凝胶(1TBE缓冲液)中，4下预电泳2小时后取变性的单链10 l加样，电压分别为exon 5, 200V; exon 6, 120V; exon 7， 150V。根据PCR扩增片段长短决定电泳的持续时间46小时不等。停止电泳后用溴乙锭染色观察结果。3.序列分析：本研究采用ABI公司生产的ABI373A DNA序列分析仪进行全自动序列分析。结果一、人卵巢癌p53基因突变的检测结果1.PCR扩增片段的SSCP检测：46例卵巢上皮性癌组织及癌旁正常组织DNA的p53基因特异片段经PCR扩增后，再经SSCP检测。结果表明，所有癌旁组织均未发现p53基因的改变，癌组织中有8例发生突变，突变率为17.4%。外显子5检出3例，外显子6检出1例，外显子7检出4例。见图1。图1T1出现异常电泳条带，为突变标本(T为肿瘤组织，N为癌旁正常组织)2.PCR扩增片段的序列分析：8例阳性标本经测序证实突变存在。见表2及图2。从表2可以看出，(1)8例突变标本中7例发生在外显子区，1例发生在内含子区。提示p53基因突变主要发生在外显子区，即编码区。(2)编码区的突变均为错义突变，提示p53基因突变引起蛋白结构的改变。(3)突变主要是碱基转换突变，而转换突变又以GA的转换为主(7/8)。(4)发生在175、245位密码子的突变占总突变的62.5%(5/8)。二、卵巢癌病理类型及临床分期与p53突变的关系从表3可以看出，透明细胞癌的p53突变率较高(3/6)。但例数较少，尚待进一步扩大标本，加以证实。46例卵巢上皮性癌中，临床期8例，检出突变2例；临床期2例，未检出突变；临床期29例，检出突变5例，临床期7例，检出突变1例。总突变率为17.4%，临床、期的突变率为20.0%，临床、期的突变率为16.7%。两组经2检测差异无显著性(P0.05)。说明p53基因突变与临床分期无关。表2卵巢癌p53基因的突变类型病例序号病理类型临床分期细胞分化p53突变类型外显子E或内含子I(密码子)碱基改变氨基酸改变5透明细胞癌中5E(175)CGCCACArgHis6透明细胞癌中、低6I(-7位)CT8子宫内膜样癌低5E(176)TGCTACCysTyr20子宫内膜样癌中7E(245)CGCGACGlyAsp30子宫内膜样癌中6E(187)(205)CTGCTATATTCAT使读码框架位移，翻译提前终止在208位密码子33粘液性囊腺癌高5E(175)CGCCACArgHis37乳头状囊腺癌中7E(245)GGCAGCGlySer42透明细胞癌低7E(245)GGCGACGlyAsp表3卵巢上皮性癌的病理类型与p53突变的关系病理分型总例数突变例数百分率(%)粘液性癌411/4*浆液性癌1400.0粘浆混和性癌100.0透明细胞癌633/6*子宫内膜样癌13323.1未分化腺癌811/8*合计46817.2%*例数少于10，不计百分率讨论一、p53突变与蛋白结构改变的关系从8例突变标本的测序结果可以看出，7例突变位于外显子区，1例位于内含子，提示p53突变主要发生在编码区，这些突变又均是错义突变，说明p53基因突变常常引起蛋白结构的改变，位于内含子的1例突变位点是在剪接信号范围内，也会引起p53蛋白构象的改变，继而导致其p53功能异常或失活。二、175、245可能是上皮性卵巢癌p53突变的主要位点测序结果表明，发生在外显子7的4例突变中除1例位于内含子外，其余3例均位于245例密码子。外显子5突变的3例中，2例位于175例密码子。发生在175、245位密码子的突变占总突变的62.5%。故认为175、245位密码子可能是卵巢上皮性癌p53的突变热点。Kupryjanzyk等5通过对38例卵巢癌进行p53基因分析，发现32%的突变位于175、245、248和273密码位置。我们的研究结果与文献报道基本一致。参考文献1Skiling JS, Sood A, Niemann T, et al. An abundance of p53 null mutations in ovarian cancer. Oncongene, 1996,13:117.2Chi-Ho M, Sai-wal T, Knapp RC, et al. Unifocal origin of advanced human epithelial ovarian cancer. Cancer Res, 1992, 52:5119.3卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.96-97.4Saiki PK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer directed enzymatic amplification of DNA wit