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流式细胞术基本原理 产品技术专员 流式细胞术 流式细胞术 FlowCytometry 简称FCM 是一种可以快速 准确 客观 并且同时检测单个微粒 通常是细胞 的多项特性的技术 同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒 如各种细胞 染色体 微生物 及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 并加以定量 2 流式细胞仪的特点 单个细胞 生物颗粒分析同时多参数 多荧光分析高通量检测 高速度10000个细胞 秒以上定性 定量分析分选特定性状或功能的细胞可检测的样本种类多样 1 外周血 骨髓 细针穿刺 洗脱液 实体组织 培养细胞 2 血清 血浆 培养上清 细胞裂解液 3 目前流式细胞仪可以检测的类别 细菌 浮游生物 DM 0 2 m 15 m 单核细胞 中性粒细胞 淋巴细胞 红细胞 4 5 流式细胞仪的基本构造 激光发射器发出所需要的波长的激光 前向散射光检测器 侧向散射光检测器 光学滤镜 流动室与液流系统 将细胞单个压入流动室 信号收集与数据处理系统 光源与光学系统 6 流动室 7 当光子遇到滤片时 光子或通过滤片 或被滤片吸收 或被滤片反射 光学滤片 8 光学滤片的种类 长通滤片 LP 630LP短通滤片 SP 550SP带通滤片 BP 488 10 9 10 共有两类 散射信号与荧光信号前向角散射信号 FSC 反映细胞大小侧向角散射信号 SSC 反映细胞颗粒度荧光信号 FLSignals FL1 2 3 胞内 胞外染色情况 流式细胞仪可获取的信号种类 11 FSC和SSC 直方图 流式细胞仪显示图的种类 12 把前向散射光图和侧向散射光图的一维图像在二维图像上投影 便是我们平常所看到的流式图 所以横坐标表示的是细胞的直径大小 纵坐标表示的是细胞的复杂程度 两者相结合就能说明细胞种类 散点图 13 二维等高图和密度图 14 假三维图与三维图 15 流式细胞仪如何获取细胞信号 FSCSSCFL 16 前向角信号 ForwardScatter FSC 17 前向角信号 细胞的大小 18 19 侧向角信号 SideScatter SSC 20 21 FL 22 23 FSC SSC FL 24 如何分离90 角内的各种荧光信号 25 荧光染料 吸收某一波长的光波后能发射出大于吸收光波长的光波的物质 PI 488n 600nm 26 荧光染料种类 荧光染料激发波长 nm 发射波长 nm 用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE RD1 488575免疫荧光橙色PerCP488670免疫荧光红色PI488620DNA染色橙红ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红色APC633670免疫荧光红色DAPI359462DNA染色蓝色 27 荧光染料光谱特征 28 荧光分离原则 在流式细胞仪中 一般经过LP或SP滤片将荧光大致分开后 再经过一BP滤片分离出特征荧光 29 开放式光路Calibur Influx 流式细胞仪的光路 30 封闭式光路 Canto LSR系列 Aria系列 31 分选 将目标细胞分离并富集 进行后续研究 分选纯度 99 32 震荡 33 偏转板 34 几个概念 信号放大模式信号类型CV值样本流速激光延迟液滴延迟荧光补偿阈值门对照 35 信号放大PMT将光信号转换成电信号 调整PMT的电压 信号强度将随之改变 光信号 光电倍增管 PMT 放大器 电信号 放大器两种放大方式 线性放大 lin 对数放大 log 36 线性放大 lin 按光强度的线性关系输出信号 适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物过程的信号 如DNA含量 总蛋白含量等 37 对数放大 log 按光强度的对数关系输出信号 在免疫学测量中通常使用对数放大 38 电脉冲信号类型 将与电脉冲信号强弱相关的电压数字化有三类电脉冲信号高度信号H面积信号A宽度信号W 39 CV值 CV值 变异系数 样品均一度及仪器分辨率的标志 CV值一般 2 40 样本流速 41 高流速 一般用于定性分析 如免疫分型 采集速度快 但分辨率低 低流速 一般用于对分辨率要求较高的分析 如DNA分析 样本流速选择 42 激光延迟 laserdelay Laser1 Laser2 43 液滴延迟 dropdelay 44 颜色补偿 采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差 在完成双色以上荧光标记的样本时 都需要作颜色补偿 45 FITC主要由FITC的检测器检测 但部分光也会进入PE检测器 如果单染FITC 同时打开PE检测器 则如图 46 阈值 信号放大过程会产生不需要的脉冲信号 通常来自于碎片 通过设定某一信号的最低强度值 可将不需要的脉冲信号去除 这一设定值称为阈值 屏蔽噪音信号和碎片信号 47 门 Gate 分析 分选感兴趣的细胞群 48 对照 同型对照 为没有特异性 与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白 通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2 用于检测和消除 一抗 非特异性结合到组织细胞而产生的背景染色 空白对照 即不进行标记的细胞 主要用于确定待测标本的基础荧光阈值或检测染