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第十五章、标记化合物的制备15.1 示踪原子自1912年G. Hevesy 和F. Paneth 将放射性核素作为示踪剂以来，示踪实验已成为目前科学研究的重要手段之一。特别是生物学、医学和农业科学等领域中，已得到了广泛的应用。随着示踪实验方法在各学科中被广泛采用，对带有示踪原子的标记化合物的需求量也愈来愈大。标记化合物的制备就成为示踪实验能否进行的前题。因此，几十年来，曾对标记化合物的制备作了大量研究。四十年代后期，人工放射性核素开始大规模生产，为制备放射性标记化合物提供了条件。采用放射性标记化合物进行示踪，具有方法简便、易于追踪、准确性和灵敏度高等特点，因而，在示踪实验中，至今它仍占有主导地位。近年来，快速制备方法与快速分离技术的发展，使制备短半衰期放射性标记化合物也成为可能。例如，为满足医学研究和临床上的需要，短半衰期的11C、13N、18F、15O、67Ga、77Br、111In及123I等核素所制备的标记化合物的品种和数量已愈来愈多。六十年代末期，生产稳定核素的方法不断改进，有效测定稳定核素的质谱仪和核磁共振谱仪技术的发展，以及某些元素缺少合适的放射性核素进行示踪等原因，使早在本世纪初就用在示踪实验中的稳定同位素标记化合物又重新引起人们的重视。目前常用的稳定同位素标记化合物是由2H、13C、17,18O、15N、33,44S等示踪原子所标记的。15.2 标记化合物的命名标记化合物是指原化合物分子中的一个或多个原子、化学基团，被易辨认的原子或基团取代后所得到的取代产物。标记化合物中一些易被辨认的原子或基团称为示踪原子（或基团）。根据示踪原子（或基团）的特点，可将标记化合物分成以下几类：（1）用放射性核素作为示踪剂的标记化合物称为放射性标记化合物。例如：NH2CHTCOOH、Na18F、14CH3COOOH等。（2）如果人为地改变化合物中某一元素的稳定同位素丰度到可以观测的程度，那么这类化合物就称为稳定核素标记化合物。例如，NH213CH2COOH、15NH3、 等。（3）在特定条件下，还可用非同位素关系的示踪原子，取代化合物分子中的某些原子而构成非同位素标记化合物。例如用75Se取代半胱氨酸分子中的硫原子，制成硒标记的半胱氨酸，即（4）当在化合物分子中引入两种或多种示踪原子时，则称之类标记化合物为多标记化合物。例如：、等。标记化合物的命名法，目前尚无统一规定。下面仅介绍一些通常使用的符号与术语。定位标记（Specific labeling），以符号“S”表示，在这类化合物中的标记原于是处在分子中的特定位置上，而且标记原子的数目也是一定的。定位标记化合物命名时，除了在化合物名称后（或前），要注明示踪原子的名称外，还需注明标记的位置与数目。例如用14C标记丙氨酸时，若在甲基上得到标记，即，命名为丙氨酸314C（S）；若在羧基上得到标记，即命名为丙氨酸114C（S）当甲基与羧基上得到标记时，则命名为丙氨酸1,314C（S）,即。其他定位标记化合物的命名法，可依此类推。例如腺嘌呤8T（S），表示氚标记化合物的命名法，可依此类推。例如腺嘌呤8T(S)，表示氚标记的位置仅局限于腺嘌呤分子中与第八位碳原子相联。通常已注明示踪原子的具体标记位置后，符号（S）亦可省略。在14C标记分子中，用符号（U）来表示“均匀标记”（uniform labeling）。它是指14C或13C原子在被标记分子中，呈均匀分布，对于分子中的所有碳原子来讲，具有统计学的均一性，例如用14CO2通过植物的光合作用制得带标记的葡萄糖分子，其中14C被统计性地均匀分布在葡萄糖分子的六个碳原上，这种标记分子可命名为葡萄糖14C（U）。在放射性药品广告中，常用符号（UL）表示。对氚标记化合物，还有用符号（n）或（N）及（G）来表示“准定位标记”或“近似标记”（nominal labeling）与“全标记”（general labeling）。准定位标记是指根据标记化合物的制备方法，理应获得定位标记分子。但实际测定结果表明，氚原子在指定位置上的分布低于化合物中总氚含量的95%。对这类化合物在其名称后可用符号(n)或(N)标明。例如尿嘧啶5T(n)，表示氚原子主要标记在分子的第五位上，但仍有5%以上的氚分布在尿嘧啶 分子的其他位置上。全标记是指在分子中所有氢原子都有可能被氚取代，但由于氢原子在分子中的位置不同，而被氚取代的程度，也可能不同。例如用气体曝射法制备的氚标记胆固醇分子，在分子的环上、角甲基及侧链上的氢或多或少地被氚所标记，但各位置上氚标记的程度并不相同。在命名这类标记化合物时，应在其名称后注上符号（G），例如胆固醇T（G）。15.3 标记化合物的特性目前，作为商品供应的标记化合物已有 种，其中绝大多数是放射性标记化合物。本节主要介绍有关放射性标记化合物的某些特性。15.3.1 对标记化合物的选择进行标记时，采用那种形式化合物；示踪原子标记在分子的那个位置上；用稳定示踪原子，还是用放射性碘的标记化合物诊断甲状腺、肝脏、肾上腺等病症。由于甲状腺有吸收体内碘离子，而不积聚有机碘化物的特性。因此进行甲状腺诊治时，只能选择在体内形成碘离子的标记化合物如Na131I。而碘标记的有机化合物如131I玫瑰红对甲状腺诊治的疗效较差。但它却能在肝脏中积聚，故可在肝脏扫描时使用。将示踪原子标记到化合物分子上时，一般应注意下列问题：(1) 示踪原子应标记在化合物分子的稳定位置上，不至于在示踪过程中发生脱落或因同位素交换等因素而失去标记。一般讲，极性基团（如COOH、OH、NH2及NH等）中的氢原子，位于羰基位置的氢原子，苯环上与羟基处于邻位或对位的氢原子都不稳定。此外，连接在碳上的氧，较为活泼，易与水中的氧相互交换而失去标记。(2)示踪原子应标记在化合物的合适位置上。例如研究氨基酸的脱羧反应，标记必须在羧基的位置上。否则，就不可能观察到氨基酸脱羧而生成CO2的生化过程。另一方面，即使是同一化合物，但因需标记的位置不同，而使制备标记化合物的难易程度有很大的差别。例如，乙酸114C的合成仅需一步格氏反应，就可完成。而乙酸214C的合成，却要经历以下四步反应后才得到标记产品。合成途径的长短、难易程度的不同，使标记化合物的产率和纯度会有很大的差别。因此，在选择标记位置时，既要注意到示踪研究中的需要和该位置上示踪原子的牢固性，又要注意到在这位置上标记时，合成方法的难易程序。在这一些实验中，为了揭示分子中不同基团所起的作用和特性，常选用多标记化合物进行示踪。例如，为了证实体内胆固醇是由简单的乙酸所合成的，并确定乙酸的每个碳原子在胆固醇生物合成中的作用，则需采用或双标记化合物。实验结果表明，乙酸中的两个碳原子都参与胆固醇的生物合成，并进入分子结构中。还表明胆固醇分子的环状结构中，由乙酸中甲基与羧基所提供碳原子的比值为10:9，而在侧链部分，两者比值为5:3，如下式所示（有*者为乙酸中的甲基酸）：(3)选择合适的示踪原子进行标记。用放射性示踪原子还是用稳定示踪原子标记，应根据实际情况来定。稳定标记化合物的优点在于无辐射损伤，制备和示踪时不受时间因素的限制，也不存在标记化合物的辐射自分解等弊病。但稳定同位素标记化合物的价格昂贵，观测所需的设备和它的灵敏度不如用放射性标记化合物那样迅速，简便和灵敏。特别是自然界中如P、Na、I、Co、Au等15种元素，只有一种稳定核素，对它们就只能用放射性核素来示踪。另外，稳定同位素标记化合物虽不存在辐射操作，但亦不是绝对没有毒性而能被生物体所接受。例如重水（D2O）占体内含水量的1520%时，则会出现阻碍细胞呼吸及酵解作用，使生物体功能失调。鉴于上述原因，只是在缺乏合适放射性核素作为示踪剂；对某些禁用放射性示踪的领域或在放射性标记化合物供货不便的情况下，稳定同位素标记化合物才被优先采用。(4)正如上一章所述，选择放射性标记化合物时需考虑到放射性核素来源的难易、释放出射线的类型和能量、半衰期的长短以及它的毒性和可能引起的辐射损伤。还应注意到标记化合物自射的稳定性及示踪时同位素效应的影响。碳和氢是构成有机化合物的基本成分，以14C或3H作为示踪原子具有许多突出的优点。因此，至今14C或3H的标记化合物仍是应用得最多的示踪剂。用14C或3H标记的优点在于它们都只放射能量较低的粒子，外照射的影响小，但又不难探测。14C或3H在体内的生物半衰期短，都属于低毒组的放射性核素。它们可由反应堆生产，无论在数量或比活度方面，都能满足标记化合物制备的需要。14C或3H均有较长的半衰其（14C: 5715年, 3H: 12. 32年），使制备和使用时可不受时间因素的限制。用14C标记或用3H标记化合物各有利弊。化合物分子中的CH键比CC键弱，故3H标记脱落的可能性较大。在蛋白质、生物碱等复杂标记化合物的制备中，用14C标记往往很困难，而用3H标记就较方便。但当分子的稳定位置上不含有氢原子时（如8氮杂鸟嘌呤），则不能进行3H标记。制备3H标记化合物时的放射性产率一般比14C标记要低得多。且3H在分子中的标记位置及其具体分布，在制备时不易控制。在标记分子中，引进一个3H标记原子的产品，其理论比活度为29.2 Ci.mmol-1, 而引进一个14C标记原子仅为62.4 mCi.mmol-1。3H标记化合物的比活度一般比14C标记化合物要高的多。在比活度相同时，3H标记化合物的辐射自分解比14C标记化合物要严重。3H标记化合物在示踪时出现的同位素效应也比14C标记化合物显著。再从放射性防护的角度来比较，14C标记比3H标记安全得多。为满足各领域科学研究和应用上的需要，对非同位素标记化合物的使用也愈来愈多。如32P、59Fe、75Se、77Br、87Srm、99Tcm、111In、113Inm、123,125,131I、169Yb、197Hg及198Au等放射性核素常用于制备非同位素标记化合物。这类标记化合物有时也称为“外来”标记化合物（“forging” labeled compound）。15.3.2 标记化合物的同位素效应与辐射自分解标记化合物的同位素效应与辐射自分解，对标记化合物的制备、使用和贮存有显著的影响。1、 同位素效应不能忽略因同位素效应引起标记化合物与原化合物之间产生性质上的差异。对3H或14C这类轻核所标记的化合物，同位素效应更为明显。在有共价键结构的有机化合物分子中，正常CC键的键能为82.6 kcal. Mol-1, 而测得14CC键的键能比正常的要高出610。质量为氢原子三倍的3H，它与氧、氮、碳结合所形成的氚键比正常氢键要稳定得多。这些效应使3H或14C标记化合物，在一些反应中所表现出来的反应速度较原化合物要慢。例如，用HTO水解Grignard试剂，发生如下反应：2RMgX + 2HTO RH + MgXOH + RT + MgXOT当R=C6H5、CH3C6H4时，制得RT标记化合物的比活度仅是理论值的40%左右。由于Grignard试剂优先与键能较低的普通水分子反应，从而造成产品RT比活度低于理论值。又如，在生化反应中，甲基氧化酶在氧化14C标记的甲基（14CH3）和氚标记的甲基（CTH2）时有明显的选择性，它优先氧化14CH3中的氢。另外，在色层分离中，也曾观察到3H或14C标记化合物的比移值Rf比原化合物的Rf值扁低，这一差异可认为来自它们的同位素效应。除3H或14C标记化合物外，春他较重核素的标记化合物，在化学与生物化学过程中的同位素效应并不显著。2、 辐射自分解标记化合物的辐射自分解是另一个值得注意的问题。辐射自分解包括：初级内分解、初级外分解和次级分解。（1）初级内分解它是由标记化合物中放射性核素衰变所造成。核衰变结果产生含有子核的放射性或稳定的杂质。（2）初级外分解它是由标记的放射性核素放出的射线与标记化合物分子作用，造成化学键的断裂，产生放射性或稳定的杂质。初级外分解的程度，取决于标记化合物在介质中的分散程度、它的比活度和发射出射线的类型和能量。(3)次级分解标记化合物周围的介质分子，由于吸收射线的能量而被激发或电离，进而生成一系列自由基、激活的离子或分子。它们再与标记化合物作用，使分子断键而分解。次级分解常常是标记化合物辐射自分解的主要因素。由次级分解所产生的杂质亦是多种多样的。标记化合物除辐射自分解外，还有化学分解。对生物标记化合物还有细菌、微生物所引起的生物分解。因此，标记化合物的分解，在制备、使用和贮存时，均应加以注意。目前常用以下方法来减少标记化合物的分解。（1）降低标记化合物的比活度通过加入稳定载体或稀释剂是控制辐射自分解的有效方法。一般将氚标记化合物稀释剂是控制辐射自分解的有效方法。一般将氚标记化合物稀释到1 mCi. Ml-1，而14C标记化合物则为0.1mCi. ml-1。对固态标记化合物常用纤维素粉、玻璃粉、苯骈蒽作稀释剂。液体标记化合物的稀释剂，原则上应选择与标记化合物互溶性好，不易产生自由基的溶剂，如苯等。但有许多重要标记化合物如糖类化合物，氨基酸、核某酸等都不溶于苯，只能用水或甲醇来作稀释剂。表15.1 某些b放射性标记化合物的贮存条件标记化合物比活度贮存状态贮存温度贮存浓度碳14标记化合物：氨基酸低冷冻干燥固体0高含20%乙醇的灭菌水溶液20或00.050.1mCi.m1-1碳水化合物与核苷低冷冻干燥固体或糖浆0高含2%乙醇的灭菌水溶液200.050.1mCi.m1-1核苷酸低、高含50%乙醇的水溶液，pH7缓冲液200.050.1mCi.m1-1甾族化合物低、高含510%乙醇的苯溶液2或20邻苯二酚胺类低、高冷冻干燥固体或水溶液20其他化合物水、乙醇或含乙醇水溶液20苯溶液220氢3标记化合物：氨基酸低冷冻干燥固体2高含2%乙醇的水溶液（灭菌）1mCi. m1-1碳水化合物与核苷低、高含2%乙醇的水溶液（灭菌）2核苷酸低、高含50%乙醇的水溶液（灭菌）21mCi. m1-1甾族化合物含乙醇的苯溶液2或201mCi. m1-1邻苯二酚胺类水溶液140或191mCi. m1-1196其他化合物水、乙醇或苯溶液2、20(2)加入自由基的清除剂次级分解是标记化合物辐射自分解的重要因素。若在标记化合物的体系中，加入能与自由基发生快速反应的物质，阻止及清除自由基与标记化合物使用，则可有效地降低标记化合物的次级分解。实验证明，13%的乙醇是常用的自由基清除剂。选用清除剂时，应注意到它本身或它的辐解产物不能与标记化合物发生化学或生物化学反应。例如，醇与酸发生酯化反应，故乙醇不能用于有机酸类的标记化合物中。13的乙醇不影响酶的活性，但高浓度的乙醇会破坏酶的活性，使标记化合物的生物活性降低，故选用清除剂的浓度应恰当。乙醇辐射分解产生乙醛，它与二羟苯丙酸、5羟色胺发生反应，故乙醇就不能作这类标记化合物的自由基清除剂。(3)调节贮存温度降低温度，使分解产生的自由基与标记化合物作用的速度减慢，亦能使标记化合物的分解减少。但对于标记化合物的溶液来说，当温度下降而发生缓慢冻结时，标记分子被聚集在一起，反而加速自辐射分解，对氚标记化合物更应注意到这一问题。只有在140下快速冷却时，标记分子才能保持均匀分散在溶剂中，例如胸腺嘧啶核苷酸甲基3H水溶液，在20下贮存5周，分解率为17%；而在2下贮存同样时间，仅分解4。因此一般标记化合物在04温度下贮存较好。对一些极不稳定的标记化合物，最好在140条件下贮存（液氮冷冻）。在表12.1中列举了某些放射性标记化合物的贮存条件。15.4 标记化合物的制备有机标记化合物的种类繁多，制备途径、方法与一般的有机合成往往不同。标记化合物的制备方法归结起来可分成四类：化学合成法，同位素交换法，生物合成法及热原子标记法。12.4.1 化学合成法化学合成法是目前制备各种标记化合物最常用和最重要的方法。此法的优点是产品纯度高，并有较好的重复性。对产品种类、产量和定位标记等要求均有较好的适应性。其缺点是流程长、步骤多，生产设备复杂和产率较低。1. 14C标记化合物的化学合成除生物活性物质及某些复杂的生物分子外，极大多数14C标记化合物都由化学合成法制得。反应堆提供的Ba14CO3是化学合成各种14C标记化合物的初始原料。先由它转化成14CO2、K14CN、BaN14CN,再经一系列化学反应合成出各类14C标记化合物。(1)以14CO2为原料的合成途径以14CO2为原料的主要合成途径有两条：一是按下述反应得到14CH3OH：再由通过简单的反应得到的衍生物、及。反应过程如下：用上述三种简单的化合物，可合成14C定位标记的氨基酸、生物碱、糖类化合物、维生素及抗菌素等。特别是14CH3I与复杂化合物的中间体反应，向分子内引入14CH3，是许多分子内含有甲基的复杂化合物获得标记的方便途径。例如，14CH3I与可可碱反应制得咖啡碱（1甲基）14C标记化合物。标记途径如下：以14CO2为原料的另一合成途径是通过Grignard反应，制得14C标记在羧基上的脂肪酸或芳香酸。其反应通式为：通过标记羧基酸进而可合成多种重要的定位标记化合物，在设计14C标记化合物合成途径时，通常是首先考虑14CO2与Grignard试剂反应方法。这一合成途径，常用于制备脂肪酸、甘油脂、氨基酸、激素及生物碱类标记化合物。例如DL麻黄素（羟甲基）14C的制备：由14CO2 通过Grignard 反应制得的CH314COOH 可进一步用于标记嘧啶、固醇类化合物，14C则被标记在这类化合物分子的环状结构中，例如，用此方法可制得尿嘧啶614C及乳清酸-6-14C等。(2)以K14CN为原料的合成途径将Ba14CO3还原成K14CN，再与有机卤化物发生取代反应或与醛分子中的羰基进行加成反应，得到含14C原子的中间化合物。中间化合物经水解，氨解或还原等一系列反应，可合成14C标记的羧酸、胺类化合物、氨基酸、嘌呤及嘧啶类的标记化合物。K14CN对合成标记糖类化合物尤为重要，是14C标记糖类化合物合成的主要原料。下面例举以K14CN为原料，合成丙氨酸314C和胸腺嘧啶214C的途径：（丙氨酸314C）(3)以BaN14CN为原料的合成途径氨基腈化钡14C由Ba14CO3与 NaN3，作用制得：以生成物为原料，可合成14C标记的尿素和硫脲。与主要用于合成嘧啶、嘌呤及维生素B等含杂环分子的标记化合物。例如制备尿嘧啶214C及维生素B2214C。 （4）以为原料的合成途径被金属镁或钡还原得到，以为原料合成标记化合物的唯一途径是将它水解,生成。再由标记的乙炔，进行加氢、加卤或环合等反应，制得一系列14C标记的化合物。例如用于合成乙醇-1,2-14C、乙酸纳-1,2-14C、苯-14C(U)及17-炔睾丸酮-(炔-1,2) 14C等标记化合物，它们的合成途径如下：图12.1中综合了以14CO2、K14CN、BaN14CN及Ba14C2为原料制备各类14C标记化合物的主要途径。关于14C标记化合物的合成，已有不少专著和综合报道，可供查阅。2. 3H标记化合物的化学合成化学合成3H标记化合物的原料是由反应堆生产的氚气，其次是由它所制得的氚水。化学合成3H标记化合物有两条主要途径：一是用氚气对适当的不饱和碳氢化合物（也称为前身化合物）进行催化还原；另一是氚气对欲标记化合物的卤代物进行催化卤氚置换。化学合成法是获得定位3H标记化合物的唯一可靠和实用的方法。且对制备高比活度的产品特别有用。(1)不饱和化合物的催化还原法将带有双链或三链的不饱和前身化合物，溶于适当的溶剂中，加入催化剂，在室温下搅拌，再通入氚气进行催化还原反应，使分子中引入3H原子。其反应通式如下：上述反应中常用的溶剂是烃类、二氧六环、四氢呋喃、乙酸乙酯和二甲基亚砜等有机溶剂。使用的催化剂是吸附在载体炭、CaCO3、Al2O3或BaSO4上的铂或钯。近年来，亦有用三（三苯基膦）氯化铑RhCl(Ph3)3作为均相催化剂。腈基和酮基的还原，常需加热、加压。为了避免这种操作方式，则用金属氚化物LiAlT4、NaBT4、Li Et3BT等进行还原。将酸、酮、醛、酯和腈类化合物还原成相应的氚标记化合物的反应通式如下：上述合成途径所制得的标记化合物是严格定位的，3H仅限于标记在与双键或三键相联的碳原子位置。例如去甲肾上腺素7T的制备：(甲肾上腺素7T)对某些化合物可用去氢试剂，在适当的反应条下，先制备出不饱和的前身化合物，然后再进行加氚反应制得所需的标记化合物。例如用四氯代苯对醌（DDQ）使雌酚酮分子中1，2，6，7位碳原子脱氢，形成双键。再将这不饱和前身化合物与氚气反应，则可得到雌酚酮1,2,6,7-T标记化合物。其合成过程如下所示。(2)催化卤氚置换在催化剂的存在下，用氚来置换化合物中的卤素原子，而制得氚标记化合物。其反应通式为：在与催化氚化相似的反应条件下，氚很容易与Cl、Br、I等卤素原子发生置换反应。从上述反应式中可看出，有一半的氚生成TX。它在体系中积累，使得催化剂中毒而使反应缓慢。因此，需用氢氧化钾甲醇、三乙胺二氧六环等碱性溶液，将反应所生成的TX中和。若反应体系不能有碱存在时，则需用以CaCO3或碳粉为载体的铂或钯作催化剂。例如腺嘌呤-8-T的合成，其反应途径如下：用催化卤氚置换法可制备2,8位被3H标记的嘌呤化合物和5,6位被3H标记的嘧啶类化合物。对于尚无理想标记方法的肽和蛋白质而言，催化卤氚法是一种有效的标记途径。如有人以3碘酪氨酸为原料，用卤氚置换反应得到酪氨酸3T，再用它合成3H标记的肽类激素。又如：将后叶催产素和血管紧张素直接碘化，在5的Pd/CaCO3催化下，进行卤氚置换，最后得到相应的高比活度、高生物活性的3H标记化合物。若用溴代或氯代氨基酸为原料，进行卤氚置换，还可制得具有旋光性的3H标记氨基酸，如L苯丙氨酸2,4T；L谷氨酸4T。3. 其他标记化合物的化学合成化学合成法也常用于非同位素标记化合物的制备。近十多年来，对短寿命核素的标记化合物的化学合成法作了大量研究，不少产品已被医学界采用。(1)放射性碘标记化合物的化学合成碘标记化合物的合成，一般采用过氧化氢、一氯化碘或氯胺等氧化剂或电化学方法将Na131I（或Na125I）氧化成元素碘或碘的正离子（如131ICl,125ICl）。然后，利用许多有机化合物容易与碘发生碘代反应的特点，制备各种标记化合物，其反应通式为：例如5碘尿嘧啶5131I则是用131ICl与尿嘧啶按上述碘代反应所制得的。通常把用氯胺T作氧化剂，合成碘标记化合物的方法称为氯胺T法。氯胺T能将溶液中的131I（或125I）离子氧化成元素碘，然后取代酪氨酸芒香环上的氢，生成二碘酪氨酸3，5-131I.用这种方法可标记含酪氨酸残基的蛋白质、多肽或甾体类化合物。联接标记法是近年来发展的一种新方法。其特点是预先将放射性碘标在3(4羟基苯)丙酸琥珀酰亚胺脂上。多肽类化合物和标记的酯混合，经一定时间反应后，多肽便和碘标记的酯联接在一起。这种方法特别适用于无酪氨酸残基末暴露在肽链表面的多肽类化合物的标记。由于在标记化合物的制备过程中未引入氧化剂，故能使标记分子保持原有的生物活性。例如肌红蛋白的碘标记化合物，就采用这种方法制得的，其反应过程如下：(2)短寿命标记化合物的化学合成尽管短寿命标记化合物的制备，要求有快速和高效的反应步骤及分离方法，但化学合成法仍是目前制备11C、18F、13N等短寿命标记化合物的主要途径。(a) 11C标记化合物的合成11C核素常用小型 旋加速器，通过11B(p,n)、10B(d,n)等核反应产生。生成的11CO2及11CO混合物形式存在。用惰性气体氖等将它从靶室引至反应体系中。因此，11C标记化合物制备的初始原料一般是11CO2及11CO。若用NaCN或N2-H2混合气体作靶，经14N(p,a)反应，则可得到Na11CN或H11CN。它们是合成11C标记化合物的另一种原料。曾报道以11CO2为初始原料，制备了L蛋氨酸（甲基）11C，其合成途径为：当加速器的质子流强为10A时，每生成100mCi的11CH3I约需10min。生成的11CH3I收集在100l丙酮内，再将它加到含有H2O蒸汽，混在气流之中，用生理盐水吸收可得15O-H2O注射液。以上四种15O标记药物在临床使用时，有果要采用连续吸入或由静脉连续注入的给药方式，此时生产过程也采用流水线方式，边照射，边纯化，边使用，在照射的同时将纯化后的药物快速而连续地通过管道送到患者身上。18F目前主要利用20Ne（d,）18F和18O(p,n)18F两种应用制备。前一种反应须用能量较高的氚束。靶气为混有0.2%氟气的氖气。照射时产生的18F与存在的F2作用生成18FF2，性质活泼，为Ne带出后，可用于亲电子的氟化反应。例如用于苯环上的氟化反应制备L-6-18F氟多巴。利用另一种反应18O(p,n)18F反应制备18F，在能量较低的小回旋加速器中即可进行，反应的产率高。制备时不必额外加入稳定性的氟，对医用有利，近年来已得到更为广泛的应用。但反应需用价格比较昂贵的18O富集的水，即18OH2O为靶。照射时产生的18F以氟负离子（F）形式存在于靶水中，因此适合于给电子的（即亲核的）氟化反应。最主要的用途是合成高纯度的18FFDG，即氟代脱氧葡萄糖。目前公认较佳的合成18FFDG方法是Hamacher法。该法的反应过程如下式由于作为另一反应物的18FKF为无机物，只能溶于水溶液而不会溶于底物所处的有机溶剂乙腈中。如将它们两者直接混合，则由于两者难以接触，反应速度很慢。Hamacher 等加入了隐烷-2.2.2商品外Kryptofix 2.2.2，反应式中简写为K2.2.2) 作为将18FKF从水相转移到有机相的相转移的催化剂，其原理是隐烷-2.2.2能与K牢固地配合形成大的亲有机溶剂的阳离子K/K-2.2.2+，可把18F-F-阴离子一起带入极性有机溶剂CH3CN中。两种反应物处于同一种溶剂中，反应速度就大大加快。300l (2mg) 的高半胱氨酸、70l 10mol/1 NaOH 和1ml HCl 的水溶液中。在密闭并加热到100条件下，反应8min 再经过一系列的分离纯化，最后再经硅胶（F1500， LS254）薄层色层技术纯化，最终得到放射化学纯的蛋氨酸（一甲基）11C制品。另外，曾报道将11CO2在催化剂的作用下，生成H11CN。由H11CN制备了DL缬氨酸11C及肾上腺皮质多肽（ACPP11C）等标记化合物。整个合成和纯化过程仅用45分钏，DL缬氨酸11C的化学产额为70。(b) 18F标记化合物的合成。15.4.2 同位素交换法利用两种不同分子中同一元素的同位素交换过程，把示踪原子引入欲标记的化合物分子上，则是同位素交换法制备标记化合物的基本原理。同位素交换法是目前制备氚标记化合物的重要方法，它亦用于放射性碘、硫、磷标记化合物的合成。同位素交换法的优点是方法简便，对复杂的或难以用化学合成法制备的标记化合物，具有实用的意义。它的缺点是标记位置不易确定，产品的比活度低，副产品的种类和数量较多，造成对产品分离和纯化的困难。现以氚标记化合物的制备为例，对此法作一概要介绍。利用同位素交换法制备氚标记化合物的主要途径有：1.氚气曝射法（Wilzbach法）氚气曝射法是将需标记的化合物，置于高比活度的氚气（氚气的丰度为98）中，密封放置几天或数周。交换后，除去过剩的氚气，再将产品经分离、纯化，即得到所需的氚标记化合物。用此法曾标记了如秋水仙碱3H；喜树碱3H等中草药中的有效成分。氚气曝射法进行同位素交换的详细机制尚不清楚。有人认为它是辐射诱导的交换过程，氚氢之间的交换可能由以下反应过程：(1)反冲氚原子和化合物分子间的反应：(2)被激活的或游离的氚原子和化合物分子间反应：(3)被激活或离子化的化合物分子与氚气反应：其中，反冲氚原子直接与化合物作用，而得到标记的可能性较小。上述的(b)和(c)过程，可能是主要的标记过程。一般情况下，氚与化合物分子结合的速度，每天只占体系中总氚量的1左右，因此需要长时间的曝射。从而也产生了许多辐射分解产物。在曝射过程中，辐射还可引起多种副反应，这些副产品的放射性活性要比产品高10100倍。副产品的性质往往又与产品相似，难以从产品中分出。为了提高同位素交换速度，缩短曝射时间，降低产品中由辐射引起的杂质含量，曾对气体曝射法作了改进。例如借助微波、高频放电、超声波、紫外或X射线照射等方法，使化合物与氚受到诱导激发和电离，从而提高同位素交换的速度。如用充有氚气的放电管，并将欲标记的化合物置于放电管的阴极上。通过微波放电，使氚气形成3H等离子体，并得到加速，它与靶物作用生成3H标记化合物。用这种微波放电法曾制备了3H标记的苯、硬脂酸等一系列标记化合物。改进后的曝射法，目前用于多肽、蛋白质、和一些结构复杂的有机化合物的标记。所得产品的比活度较气体曝射法高，并可保持标记的生物产品有较高的生物活性。例如用高频放电法，对胰液中的核酶进行了成功的标记。制备的时间仅530min，而产品的比活度可达到 Ci. Mmol-1 的数量级，标记产物还保持原有的生物活性。另外，还用加入Pt-C、Pd-C作催化剂；将欲标记的化合物分散在碳粉上，扩大反应接触面积等方法来提高气体曝射法的效率。2.液体内催化交换法将醇、醛和酸等有机化合物溶于氚水中，这些分子中的某些氢原子即与氚水中的3H发生交换，并很快达到平衡。若化合物不溶于水，用适当溶剂（分子中无不稳定的氢原子）使之溶解，同样可达到交换的目的。曾报道，在pH7的氚水中,经水浴加热即可获得氚标记的嘌呤核苷及含嘌呤基的抗菌素等。而在相同的条件下却不能标记嘧啶核苷。在上述无催化剂存在的条件下，获得不易脱落标记的产品，实际上并不多见。为了使氚原子进入化合物分子的稳定位置上，必须通过催化交换反应。常用的催化剂是铂或钯。溶液内催化交换法是将需标记的化合物，溶于含有催化剂铂（或钯）。的氚水（或70的氚化醋酸）中，将整个反应体系调至中性或碱性。在20200的温度范围内，搅拌一定时间（一般为124h），使同位素交换反应得以进行。溶液内催化交换法常用于制备芒香族、甾类、杂环类及生物碱的3H标记化合物。近来，对上述方法作了改进。用氚气取代氚水，以Pt-C作催化剂，溶液Ph控制在710范围内，在室温下即可获得3H标记的产品。改进后的方法常用于制备氨基酸、含嘌呤基的核苷和核苷酸及糖类标记化合物。例如曾用改进后方法制备26 Ci.mmol-1的环化腺嘌呤-5-磷酸（Camp）的3H标记化合物。对单糖或多糖类化合物、含苄基化合物，催化交换法还可制得定位的标记化合物。凡属还原糖类化合物，3H都标记在醛基位置；含苄基的化合物3H则标记在亚甲基上。溶液内催化交换法的优点是简便、快速；氚气欲标记化合物的用量少，适用于标记稀有或昂贵的复杂化合物；产品的比活度高。但此法亦因以下原因而受到限制：欲标记化合物必须能溶解在溶剂中；反应必须在中性或碱性条件下进行；在欲标记的分子中，不能含有碘或硝基，否则就会阻碍同位素交换反应的进行。15.4.3 生物合成法生物合成法是利用动植物、藻类、微生物或菌类的生理代谢过程，将示踪原子引入需标记的化合物分子中。整个生物合成过程大体上分成四步。(1)把示踪原子或简单的标记化合物引入活的生物体内；（2）控制适宜生物体代谢的条件，在生理代谢过程中，示踪原子经一系列复杂的生物化学过程后，标记到所需的分子上；(3)将上述生物体转化成某种需要的化学形式，以便进行分离、纯化，或用其它标记化合物制备的方法作进一步合成；(4)进行分离和纯化，将所需的标记化合物同生物体分开。生物合成法能标记一些结构复杂，具有生物活性，难以用其它标记方法制备的化合物。但因生物活体对放射性有一定耐受量，在生理代谢过程中，放射性示踪原子以各种途径的代谢和排泄，生成不需要的副产品。因而使这一方法的产量及产率较低，产品的分离、纯化亦较复杂。生物合成法的另一缺点是，标记的位置难于确定，生产的重复性较差。用生物合成法可制备某些核苷酸、蛋白质、糖类及激素等C、P、S、3H及I的标记化合物。例如：用海绿藻合成14C均匀标记的多种氨基酸。先将足够量的海绿藻避光24h，引起它的“光饥饿”，然后通入14CO2，温度控制在2528、光照36h，使14CO2随光合作用进入藻体细胞。从上述处理过的海绿藻中提取蛋白质，并将它水解。蛋白质的水解产物用阳离子交换柱或薄层色层。将制得的14C标记的氨基酸进行分离及纯化。最终得到了14C标记的丙、精、天门冬、谷、甘、组、亮、赖、蛋、脯、丝、酪、缬和苯丙氨酸。还报道了利用美人焦叶，烟叶的光合作用合成右旋葡萄糖-1，614C标记化合物。利用毛地黄的叶，将娠烯醇酮73H转化成地高辛3H和毛地黄毒苷3H等。利用酶的催化作用，曾将胸腺嘧啶14C标记化合物与从大白鼠肝中分出的脱氧核糖酸转移酶混合在一起，则可制得胸腺嘧啶核苷糖核酸转移酶混合在一起，则可制得胸腺嘧啶核苷14C。从啤酒酵母中提出的酶液，能使氚标记尿嘧啶核苷单磷酸3H（UMP3H），转化成尿嘧啶核苷三磷酸3H（UTP3H）。还用生物合成法和化学合成法结合在一起，制备了碘标记化合物。如常用的乳过氧化物酶法就是其中之一。乳过氧化物酶法的基本原理是将牛乳中提取的乳过氧化物酶与H2O2形成配合物，然后使碘氧化，再加入蛋白质，生成碘标记的蛋白质分子。乳化氧化酶催化蛋白质碘化的反应式如下：以促甲状腺激素标记为例：将促甲状腺激素（HTSH）2.5g，0.4mol/1醋酸缓冲液（pH5.6）25l,乳过氧化物酶液25l(1.0g),Na125I 50l (1.0m Ci)及10l H2O2混匀，反应10min.然后将反应液通过用缓冲液平衡过的1.07.5cm凝胶色谱柱（Sephadex G-50），即将制得的HTSH125I与游离碘分开。生物合成法也用于制备比活度高的32P或35S的标记化合物。曾报道了用无载体的与二磷酸腺苷混合，经一系列酶促反应后制得比活度高达(5.8-6.5)103Ci.mmol-1的三磷酸腺苷标记化合物。将制得的在多核苷酸激酶、核酸酶Pi (Nuclease Pi)、肌激酶和丙酮酸激酶作用下，还可得到标记化合物。产品的比活度虽不如高，但仍有(0.2-1)103 Ci.mmol-1。用酶促反应还合成了环化单磷酸核糖核苷类的32P标记化合物。这些标记化合物在分子生物学的研究中起着极其重要的作用。15.4.4 热原子标记法有关热原子标记法的原理和制备标记化合物的实例，在本书的12.6章节中已有阐述，这里不再重复。近年来有人在热原子反冲法的基础上，发展成用离子分子束反应的标记化合物制备方法。用这种方法已制备出一些14C和3H的标记化合物。离子分子束反应法是用一种特殊的化学加速器，产生含有放射性核素的高速离子束，去轰击欲标记的化合物或中间体，发生离子分子反应，制备出所需的标记化合物。例如曾用加速的14C 离子束，轰击由500mg苯制成的靶，经24h轰击后，产生比活度为0.2mCi.mg-1的苯14C标记化合物。产物中除14C标记的苯外，还有甲苯及其他14C标记的副产品存在。15.5.5 多标记化合物的制备若需观察分子中不同基团或某些部位各自的特性和作用时，使用双标记或多标记化合物进行示踪是相当有效的。例如为了观察炔诺酮庚酯的环状结构和侧链部份各自的药理作用，则可将分子中的环状结构用3H加以标记，而侧链部分用 14C加以标记的双标记化合物。3H与 14C在分子中标记的位置如下所示：双标记化合物的制备方法有两种：一是简单而常用的方法，它是先分别制备炔诺酮庚酯6,7T与炔诺酮庚酯这两种标记化合物。然后将两者以一定比例混合。该混合物在示踪时，即可起到双标记化合物的作用。但其缺点是，在制得的标记化台物中没有一个分子同时含有两种示踪原子。另一制备的方法是采用3H标记的炔诺酮与 14C标记的庚酸进行酯化反应。用此法制得的标记化合物，在分子中同时含有两种示踪原子。实际上，产品分子中，同时含有14C与3H示踪原子的双标记分子所占的比例极小，故这种制备方法并不常用。15.5 标记化合物的质量鉴定标记化合物进行严格的质量鉴定和控制，是保证示踪实验得到正确结果的先决条件。标记化合物的质量鉴定可概括为物理鉴定和化学鉴定。对生物示踪剂，则需加生物鉴定的项目。下面例举了这三类鉴定所应作的主要项目。标记化合物需鉴定的项目物理鉴定化学鉴定生物鉴定(1)外观和性状；(1)化学纯度；(1)无菌、无热源；(2)放射性活