大负荷运动及针刺干预对骨骼肌微管蛋白的影响.doc

www.CRTER.org刘晓然，等. 大负荷运动及针刺干预对骨骼肌微管蛋白的影响大负荷运动及针刺干预对骨骼肌微管蛋白的影响刘晓然1，李俊平2，王蕴红1，王瑞元2(1首都体育学院运动科学与健康学院，北京市 100191；2北京体育大学运动人体科学学院，北京市 100084)引用本文：刘晓然，李俊平，王蕴红，王瑞元. 大负荷运动及针刺干预对骨骼肌微管蛋白的影响J.中国组织工程研究，2016，20(33):4949-4956.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.012 ORCID: 0000-0003-1560-1194(刘晓然)文章快速阅读：大负荷运动及针刺干预对大鼠骨骼肌微管蛋白的影响刘晓然，女，1982年生，天津市人，2013年北京体育大学毕业，博士，实验师，主要从事运动对骨骼肌机能影响的研究。通讯作者：王瑞元，博士，教授，北京体育大学运动人体科学学院，北京市 100084中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)33-04649-08稿件接受：2016-05-25取材安静对照组运动和/或针刺后即刻、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后取材检测：骨骼肌-tubulin蛋白和MAP4蛋白表达运动组针刺组一次运动组运动后即刻针刺运动针刺组大鼠3周安静组取材3周运动组长期训练组3周针刺组运动后即刻针刺 3周运动针刺组文题释义：微管蛋白：由tubulin组成微管的蛋白质称为微管蛋白。微管蛋白是球形分子，有两种类型：微管蛋白(-tubulin)和微管蛋白(-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。亚基由450个氨基酸组成，亚基是由455个氨基酸组成，它们的相对分子质量约55 000。运动负荷：又称生理负荷，是指人做练习时所承受的生理负荷。运动负荷包括运动量和运动强度两个方面。大负荷运动尤其是离心运动，可诱导细胞骨架蛋白解聚或降解，致使肌纤维超微结构改变，收缩蛋白结构破坏，影响肌肉的收缩活动。摘要背景：大负荷运动可诱导骨骼肌骨架蛋白的解聚或降解，改变骨骼肌的超微结构，影响骨骼肌的收缩活动。目的：观察大负荷运动和针刺对骨骼肌微管的影响，并探讨运动和针刺在骨骼肌损伤和修复中的作用及其机制。方法：选用8周龄SD雄性大鼠138只，分为一次性运动组114只和长期训练训练组24只。一次性运动组又分为4个亚组：安静对照组6只、运动组36只、针刺组36只和运动针刺组36只。一次性运动实验是大鼠完成一次中大强度下坡跑运动，在运动后施以针刺，根据运动和/或针刺后0，6，12，24，48和72 h点取材。长期训练实验是大鼠完成为期3周的下坡跑训练，并在每次运动后施以针刺，最后一次训练后的24 h取材。方法检测各组比目鱼肌-tubulin和微管结合蛋白4的蛋白表达。结果与结论：一次运动后：-tubulin蛋白表达一过性表达下调，微管结合蛋白4蛋白表达一过性表达上调；一次运动后针刺：减小了-tubulin和微管结合蛋白4蛋白表达的变化量；3周训练后：-tubulin蛋白表达有升高趋势，微管结合蛋白4蛋白表达显著下调，针刺的干预显著减小了微管结合蛋白4蛋白表达的变化量；结果显示：大负荷运动可诱导骨骼肌微管解聚，而针刺干预可缓解微管的损伤。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 关键词：组织构建；组织工程；大负荷；运动；针刺；骨骼肌；细胞骨架；微管；tubulin；MAP4；国家自然科学基金主题词：运动医学；细胞骨架；微管蛋白；针刺基金资助：国家自然科学基金(31271277)；北京市高等学校“青年英才计划”项目(YETP1700)和北京市教育委员会科技计划面上项目(KM201510029001)缩略语：微管结合蛋白：microtubule-associated protein，MAPEffects of heavy load exercise and acupuncture treatment on tubulin in rat skeletal muscleLiu Xiao-ran1, Li Jun-ping2, Wang Yun-hong1, Wang Rui-yuan2 (1School of Kinesiology and Health, Capital University of Physical Education and Sports, Beijing 100191, China; 2School of Sports Human Science, Beijing Sport University, Beijing 100084, China)AbstractBACKGROUND: Heavy load exercises can induce the ultrastructural changes in the skeletal muscle by the depolymerization and/or degradation of tubulin in the skeletal muscle, thereby lessening contraction activities of the skeletal muscle.OBJECTIVE: To observe the effects of heavy load exercise and acupuncture on tubulin levels, and to analyze their roles and mechanisms in skeletal muscle injury and repair.METHODS: 138 male Sprague-Dawley rats aged 8 weeks were randomly divided into acute exercise group (n=114) and long-term exercise group (n=24). The acute exercise group included four subgroups: sedentary group (n=6), exercise group (n=36), acupunctured group (n=36) and exercise plus acupuncture group (n=36). In the acute exercise experiment, rats were acupunctured after a medium-large intensity downhill running. Rats soleus samples were taken immediately, 6, 12, 24, 48 and 72 hours after exercise and/or acupuncture. In the long-term exercise experiment, rats underwent exercise and acupuncture for 3 weeks, and rats soleus samples were collected at 24 hours after the last training. Expressions of -tubulin and microtubule-associated protein 4 (MAP4) in the soleus were detected by western blot assay.Liu Xiao-ran, M.D., Technician, School of Kinesiology and Health, Capital University of Physical Education and Sports, Beijing 100191, ChinaCorresponding author: Wang Rui-yuan, M.D., Professor, School of Sports Human Science, Beijing Sport University, Beijing 100084, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: After acute exercise, expression of -tubulin and MAP4 was up- or down-regulated transiently. After acute exercise combined with acupuncture, the protein expressions of -tubulin and MAP4 changed slightly. However, the long-term exercise induced an increase in -tubulin protein expression, while a significant decrease in MAP4 protein expression. It was worth noting that acupuncture treatment reduced long-term exercise-induced variations of MAP4 expression. These results suggest that the heavy load exercise can induce the depolymerization of tubulins in the skeletal muscle, and acupuncture may relieve this effect.Subject headings: Sports Medicine; Cytoskeleton; Tubulin; AcupunctureFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31271277; the Program for the Youth Talents of Higher Education in Beijing, No. TETP1700; the General Program of Science and Technology Planning in Beijing, No. KM201510029001Cite this article: Liu XR, Li JP, Wang YH, Wang RY. Effects of heavy load exercise and acupuncture treatment on tubulin in rat skeletal muscle. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(33):4949-4956.4953ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction早期研究发现，大负荷运动后，参与工作的肌肉的超微结构发生改变，并随着时间延长，超微结构变化加剧，同时受试者主观感觉伴有延迟性肌肉酸痛，肌肉的工作能力下降1-2。随着研究的不断深入，发现骨骼肌收缩蛋白(myosin和actin)、细胞外基质(collegan和laminin)、膜骨架蛋白(dystrophin和integrin)、肌节外骨架蛋白(desmin)以及肌节内骨架蛋白(titin和nebulin)在大负荷运动后均会发生解聚或降解3-6，提示肌纤维超微结构的改变是由于蛋白质解聚或降解引起的。 另有研究证实，针刺能够治疗肌肉损伤，缓解大负荷运动后骨骼肌延迟性酸痛，通过调整或促进运动后骨骼肌收缩蛋白的转化或其分解代谢与合成代谢的平衡，促进运动后骨骼肌收缩结构和功能的恢复7。已有研究认为其可能机制是针刺作为一种修复手段能快速激活肌卫星细胞，并加速其分化、融合，修复运动对骨骼肌造成的损伤8。细胞骨架是真核细胞中由一系列特异蛋白质构成的纤维网架体系。微管作为细胞骨架的重要组成部分，是细胞内起支撑作用的主要支架，对细胞内物质运输起轨道和指引方向的作用。更重要的是，线粒体的分布9-10、移动和功能的变化均与微管的二聚体结构的解聚和/或聚合有一定的关联11-14。有研究报道，不同的生理刺激或干扰均可以破坏微管结合蛋白(microtubule- associated protein，MAPs)对微管的稳定作用，促使微管蛋白的二聚体结构解聚15。为此，实验建立大鼠大负荷运动(一次性运动和长期训练)模型，并在运动后即刻施以针刺干预，分析大负荷运动和针刺对骨骼肌微管，包含微管蛋白-tubulin及微管结合蛋白MAP4表达的影响，探讨大负荷运动和针刺在骨骼肌损伤和修复中的作用及其机制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2012年9月至2013年3月在北京体育大学运动人体科学学院骨骼肌实验室完成。1.3 材料 选用8周龄SD雄性大鼠138只，SPF/VAF级，体质量均为(196.166.96) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2002- 003。SD大鼠在北京体育大学科研实验中心小动物房内饲养和训练。分笼饲养，自由饮食饮水，室温(222) ，相对湿度30%-60%，12 h光照/12 h熄灯模拟日昼交替。1.4 实验方法1.4.1 实验分组 根据实验设计的需要，将实验动物分为两大组，即：一次性运动组(114只)和长期训练组(24只)。一次性运动组的实验中将SD大鼠分为4个组别，即：安静对照组(6只)、运动组(36只)、针刺组(36只)和运动针刺组(36只)，其中运动组、针刺组和运动针刺组根据运动和/或针刺后取材的不同时间点再划分为即刻组(6只)、6 h组(6只)、12 h组(6只)、24 h组(6只)、48 h组(6只)和72 h组(6只)6个组别。长期训练组实验中将SD大鼠分为4个组别，即：3周安静对照组(6只)、3周运动组(6只)、3周针刺组(6只)和3周运动针刺组(6只)。1.4.2 实验前准备 大负荷运动模型选用中大强度离心跑台运动，所有运动大鼠在正式实验前进行适应性跑台训练7 d：第1、2天跑台坡度0，16 m/min，10 min；第3、4天跑台坡度-5，16 m/min，15 min；第5天跑台坡度-10，16 m/min，30 min；第6、7天休息。1.4.3 运动方案一次性运动组：下坡跑台运动，坡度-16，速度 20 m/min，持续时间90 min。长期训练组：下坡跑台运动，第1周，坡度-16，16 m/min，训练时间60 min，训练5 d，休息2 d；第2周，坡度-16，20 m/min，训练时间60 min，训练5 d，休息2 d；第3周，坡度-16，20 m/min，训练时间90 min，训练5 d。1.4.4 针刺方案 在每次运动结束后即刻，对运动针刺组和针刺组进行针刺干预。用直径0.25 mm的针灸针沿小腿三头肌的纵向，从远端斜刺(进针角度约30)穿到小腿三头肌肌腹，留针2 min。1.4.5 取材 一次性运动组的取材时间点设为运动和/或针刺后的0，6，12，24，48和72 h点。长期训练组的取材时间点设为最后一次训练后的24 h点。取材大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠(2.5 mL/kg)，腹主动脉取血，快速分离出比目鱼肌，用锡纸包好，保存于液氮中，取材完成后将样本全部保存至-80 冰箱备用。1.4.6 Western Blot检测-tubulin和MAP4蛋白表达100 mg冻存组织，在研钵中加入液氮，将组织研磨成粉末。加入到含1 mL Western细胞裂解液、20 L蛋白酶抑制剂和10 L100 mmol/L PMSF的EP管中。涡旋震荡，静置30 min，4 12 000g离心10 min，取上清液。以BSA作为标准蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装，-20 保存。配制分离胶8%(MAP4)、10% (-tubulin和GAPDH)，以及5%积层胶。电泳前将样本以41比例加入5上样缓冲液，98 ，煮沸5 min。每孔加样 20 g。接通电源，积层胶90 V，40 min；分离胶120 V，通过预染蛋白Marker来确定电泳停止时间。电泳后将蛋白转至PVDF膜。将膜在一抗中孵育，4 过夜(一抗溶于封闭液，-tubulin abcam公司提供，14 000稀释，MAP4 SantaCruz公司提供，11 000稀释，GAPDH abcam公司提供，11 000稀释)；用TBST洗6次，每次轻摇5 min ；在二抗(中杉金桥公司提供，15 000用封闭液稀释)中孵育2 h ；用TBST洗6次，每次轻摇 5 min。ECL发光底物进行孵育1.0-2.0 min。在暗室用X射线片曝光，显影、定影。X射线片进行扫描后经ipp 6.0软件对目的蛋白质进行吸光度相对定量分析，以GAPDH为内参。目的蛋白表达量的计算方法为：目的蛋白相对表达量=目的条带的灰度值/同一样本内参的表1 一次大负荷运动和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达 (s，n=6，相对表达量)Table 1 Expression of -tubulin protein at different time points after acute exercise and/or acupuncture表2 一次大负荷运动和/或针刺后骨骼肌MAP4蛋白表达变化 (s，n=6，相对表达量)Table 2 Expression of microtubule-associated protein 4 protein at different time points after acute exercise and/or acupuncture时间安静对照组运动组针刺组运动针刺组01.0000.0000.7110.1860.8590.2260.8480.2636 h0.4600.107bf1.1750.332d0.7690.104f12 h0.3970.074bf1.1350.251d0.6370.069e24 h0.6800.1150.9460.1641.2700.268de48 h1.0600.068e1.1390.2621.4990.290bc72 h0.9500.202e1.4070.312ac1.6270.457bd表注：组内与安静对照组相比，aP 0.05，bP 0.01；同一时间点与运动组相比，cP 0.05，dP 0.01；同一时间点，与针刺组相比， eP 0.05，fP 0.01。表注：组内与安静对照组相比，aP 0.05，bP 0.01；同一时间点与运动组相比，cP 0.05，dP 0.01；同一时间点，与针刺组相比，eP 0.01。时间安静对照组运动组针刺组运动针刺组0 h1.0000.0002.1300.8050.9210.1025.4791.851bce6 h5.4850.804be0.7070.079c6.3562.049be12 h7.0091.309be0.8180.095c3.4041.871bce24 h1.7590.2651.6180.1982.4080.73448 h3.3931.572a1.8910.2100.8310.474d72 h5.0420.918be0.8940.109d4.4521.585be表4 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌MAP4蛋白表达的 (s，n=6，相对表达量)Table 4 Expression of microtubule-associated protein 4 protein after 3 weeks of heavy load training and/or acupuncture表3 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达 (s，n=6，相对表达量)Table 3 Expression of -tubulin protein after 3 weeks of heavy load training and/or acupuncture组别MAP4 3周安静组1.0000.0003周运动组0.2150.131a3周针刺组0.7980.384b3周运动针刺组0.7380.350b表注：与3周安静组相比，aP 0.05组别alpha-tubulin3周安静组1.0000.0003周运动组1.2190.2273周针刺组1.0420.1733周运动针刺组1.4360.349a表注：与3周安静组相比，aP 0.01；与3周运动组相比，bP 0.05)，则进一步建立非饱和模型进一步分析；如两因素交互作用显著，则采用SNK-q检验对不同组别间进行比较，并参考Bonferron法与Tukey法的比较结果。长期训练的实验数据中比较安静对照组、3周离心运动组、3周针刺组和3周运动针刺组骨骼肌中各蛋白表达变化统计学差异时，采用多个独立样本的非参数检验的kruskal-Wallis H法分析统计学差异，多组比较后总体有差异，由于是小样本检验，不需要调整水准，直接进行两两独立样本t-检验。统计学显著性水平定为 P 0.05，非常显著性水平定为P 0.01。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠138只，分为8组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。2.2 一次大负荷运动和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达的变化 实验结果显示(表1、图1)：运动组：-tubulin蛋白表达在一次大负荷运动后即刻有下降趋势，运动后6 h和12 h分别比安静对照组显著降低了54.0%和60.3%，运动后24 h表达上调，运动后48 h和72 h已基本恢复到安静对照组水平。针刺组：针刺后不同时间点骨骼肌-tubulin蛋白表达无明显变化。-tubulin蛋白表达在针刺后即刻有下降趋势，针刺后6 h回升至安静对照水平，针刺后12，24和48 h均无明显变化，直至针刺后72 h -tubulin蛋白表达比安静对照组显著升高了40.7%。运动针刺组：不同时间点骨骼肌-tubulin蛋白表达与运动组相似。-tubulin蛋白表达在C0 h6 h12 h24 h48 h72 halpha-tubulin蛋白表达倍速变化bdbcddfee运动针刺组针刺组运动组针刺组GAPDHalpha-tubulin72 h48 h24 h12 h6 h0 hCGAPDH72 h48 h24 h 12 h6 h0 hCalpha-tubulinGAPDHalpha-tubulin1.21.00.20d运动组efbb运动针刺组C 0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h图1 一次大负荷运动和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达Figure 1 Expression of -tubulin protein at different time points after acute exercise and/or acupuncture图注：组内与安静对照组(C)相比，aP 0.05，bP 0.01；同一时间点与运动组相比，cP 0.05，dP 0.01；同一时间点，与针刺组相比，eP 0.05，fP 0.01。运动针刺组12 h24 h48 h72 h6 h0 hCMAP4GAPDHMAP4GAPDHMAP4bebcebebced9.08.07.06.05.04.03.02.01.00针刺组bebebedGAPDH运动组针刺组MAP4 protein蛋白表达倍速变化12 h6 h0 hC72 h48 h24 h运动组aC72 h48 h24 h12 h6 h0 h运动针刺组C 0 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h图2 一次大负荷运动和/或针刺骨骼肌MAP4蛋白表达Figure 2 Expression of microtubule-associated protein 4 protein at different time points after acute heavy load exercise and/or acupuncture图注：组内与安静对照组(C)相比，aP 0.05，bP 0.01；同一时间点与运动组相比，cP 0.05，dP 0.01；同一时间点，与针刺组相比，eP 0.01。3周运动针刺组3周针刺组3周运动组3周安静组3周针刺组3周运动针刺组3周运动组3周安静组MAP43EA3A3E3C3EA3A3E3Calpha-tubulinMAP4MAP4GAPDHGAPDHGAPDHalpha-tubulin蛋白表达倍速变化a2.01.21.00.20MAP4 protein蛋白表达倍速变化b1.11.00ba运动针刺组针刺组运动组安静组运动针刺组运动组安静组针刺组图4 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌MAP4蛋白表达的变化Figure 4 Expression of microtubule-associated protein 4 protein the changes after 3-week heavy load training and/or acupuncture图注：与3周安静组相比，aP 0.01；与3周运动组相比，bP 0.05。图3 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达Figure 3 Expression of -tubulin protein after 3-week heavy load training and/or acupuncture图注：与3周安静组相比，aP 0.05。运动针刺后即刻有下降趋势，运动针刺后6 h和12 h表达下调，在12 h达到最低峰，运动针刺后24 h迅速回升，在48 h和72h-tubulin蛋白表达均比安静对照组显著升高了49.9%和62.7%。2.3 一次大负荷运动和/或针刺后骨骼肌MAP4蛋白表达的变化 实验结果显示(表2、图2)。运动组：MAP4蛋白表达在一次大负荷运动后即刻、6 h和12 h分别比安静对照组显著升高了1.13倍、4.49倍和6.01倍。运动后24 h表达迅速下调，但仍比安静对照显著升高了75.9%，在48 h和72 h表达回升，显著升高了2.39倍和4.04倍。针刺组：MAP4蛋白表达在针刺后即刻有下降趋势，针刺后6 h仍下降，针刺后12 h、24 h和48 h回升，在针刺后72 h又回落到安静对照水平。运动针刺组：不同时间点骨骼肌MAP4蛋白表达与运动组相似。MAP4蛋白表达在运动针刺后即刻和6 h分别比安静对照组显著增加了4.48倍和5.36倍，运动针刺后12，24和48 h下降， 其中运动针刺后12仍比安静对照显著增加2.40倍，在运动针刺后72 h蛋白表达回升，比安静对照组升高3.45 倍。2.4 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌-tubulin蛋白表达的变化 实验结果显示(表3，图3)，3周运动后骨骼肌-tubulin蛋白表达有升高趋势；3周针刺干预对- tubulin蛋白表达没有明显变化；3周运动针刺组- tubulin蛋白表达较安静对照组显著升高，升高了43.6%。2.5 长期大负荷训练和/或针刺后骨骼肌MAP4蛋白表达的变化 实验结果显示(表4，图4)，3周运动组MAP4蛋白表达较安静对照组显著降低了78.5%；3周针刺组和3周运动针刺组MAP4蛋白表达较安静对照组都有降低趋势，而与3周运动组相比，它们MAP4蛋白表达显著升高，分别升高了2.71倍和2.43倍。3 讨论 Discussion3.1 大负荷运动对骨骼肌微管的影响 Argstrong16将大鼠在坡度-16的跑台上以16 m/min的速度持续90 min下坡跑，复制出运动性肌肉损伤模型。大量研究证实肌肉损伤的实质是运动诱导骨骼肌骨架蛋白产生解聚或降解，从而导致肌细胞内的结构蛋白产生改变17-18。微管是细胞骨架的主要组成部分，在真核细胞中以游离和/或聚合的状态存在，时刻处于动态平衡状态19，这对维持细胞稳定性20、收缩性和其他功能具有重要意义。Boudriau等21观察到型和型肌纤维中微管的分布和构成没有明显差异，但慢肌(比目鱼肌)中-tubulin蛋白含量大约是快肌(股外侧肌)的1.7倍。微管位于肌原纤维间，并以螺旋方式包绕肌原纤维，向四周扩散22。肌细胞核周也有大量微管分布。当肌纤维发生损伤时，肌膜下微管结构会变得不完整，部分区域出现长而尖的板样状微管插入到肌纤维中间21。此次研究发现，一次大负荷运动后6 h和12 h- tubulin蛋白表达分别降低了54.0%(P 0.01)和60.3% (P 0.01)，并在12 h点出现了表达最低值。这一结果与其他关于大负荷运动对骨骼肌骨架蛋白影响的研究结果相似3，6。大负荷运动可以诱导骨骼肌-tubulin蛋白的解聚，并做出快速应答。Heins等23的研究证实心肌细胞骨架的变化先于心肌缺血的其他超微结构的变化，并且该损伤明显影响心肌细胞的结构和功能。Sakurai等24的研究发现，大鼠下肢悬垂可导致比目鱼肌中tubulin含量显著下降，经5 d恢复后其含量也基本恢复至对照水平。目前，大负荷运动导致微管解聚的具体机制尚不清楚。但可能的机制有：一是大负荷运动导致细胞内钙超载，钙激活中性蛋白酶可引起微管断裂、破坏25；一是大负荷运动导致细胞水肿，产生外向张力增加，推动肌膜向外突起，由此导致微管断裂26。MAP4是构成非神经细胞骨架中微管的主要结合蛋白。MAP4包被在微管外壁，其功能是使微管蛋白亚单位不脱离微管的末端，从而起到稳定微管的作用。MAP4的过表达能刺激细胞微管蛋白二聚体总量增加，增强细胞骨架的刚性效应27。此次研究发现，一次大负荷运动后即刻、6 h和12 h MAP4蛋白表达分别升高了1.13倍、4.49倍(P 0.01)和6.01倍(P 0.01)。MAP4是稳定微管结构的伴侣因子，在大负荷运动诱导微管损伤时，通过其蛋白含量和表达的增加，尽可能维系微管的稳定状态，减小微管的损伤程度。有文献显示心肌缺氧后MAP4蛋白表达上调，缺氧15 min MAP4磷酸化显著增强；缺氧30 min其磷酸化进一步增强，并一直维持到缺氧 60 min28。一次大负荷运动实验的结果发现MAP4蛋白变化趋势与-tubulin蛋白相反，运动后12 h分别是这两个蛋白表达峰值出现的时间点。3周大负荷训练后骨骼肌-tubulin和MAP4蛋白表达也是相反的变化。3周运动组骨骼肌-tubulin蛋白表达有升高趋势，MAP4蛋白表达较安静对照组显著降低了78.5%(P 0.01)。3周运动针刺组蛋白表达较安静对照组升高了43.6%(P 0.05)，MAP4蛋白表达较安静对照组有降低趋势。此结果与实验假设不符，但其他骨架蛋白在大负荷训练后变化的结论却与本实验结果相似。李俊平的研究发现常氧环境下1，2，3和4周离心运动后，大鼠骨骼肌Titin蛋白表达均比安静对照组升高29。在袁建琴的实验中显示大负荷运动后即刻desmin蛋白表达下降，到第4天就开始恢复，第7天就已超量恢复3。大鼠在3周大负荷训练过程中，每周训练5 d，休息2 d，肌纤维损伤已有足够的恢复时间，再加上重复运动效应，这可能是-tubulin蛋白表达上调、MAP4蛋白表达下调的原因。另外，MAP4蛋白表达的变化量较大，提示MAP4可能是一个极为敏感的蛋白，易受调控因素的影响30。3.2 针刺对骨骼肌微管的影响 临床上运用针刺治疗骨骼肌急、慢性损伤的疗效研究颇多，均证实疗效很好。一些人体和动物实验证明，针刺能促进损伤骨骼肌的结构和功能的恢复。屈竹青等31证实，针刺能迅速降低肌肉损伤后肌细胞胞浆内增加的钙浓度，加快结构恢复。李澎涛等32提出针刺能显著改善家兔超负荷运动后损伤骨骼肌超微结构的变化，同时迅速降低因运动后增加的肌细胞内钙离子的浓度。近年随着研究的深入，提出针刺通过促进损伤骨骼肌内源性胰岛素样生长因子1 mRNA提早表达和/或生肌调节因子Myf-5的升高，使肌卫星细胞增殖速度加快，针刺能直接刺激坏死部位的肌卫星细胞核，坏死肌纤维周围正常肌纤维的肌卫星迅速移行到坏死部位一起参与修复反应8，33。此次研究首先观察了一次针刺对骨骼肌-tubulin和MAP4蛋白的影响，发现-tubulin蛋白表达在针刺后无明显变化，而针刺后72 h表达比对照组升高了40.7%(P 0.05)。MAP4蛋白表达在针刺后即刻和6 h有下降趋势，却在针刺后12 h回升，72 h已恢复到对照水平。提示，针刺对正常骨骼肌的微管蛋白具有一定影响作用。一次大负荷运动后施以针刺的实验观察到，-tubulin和MAP4蛋白表达的变化趋势与运动组基本相似，但变化幅度比单纯运动组小，说明针刺使骨骼肌超微结构损伤能快速恢复，缓解骨骼肌的微损伤。本研究还发现，3周运动针刺使骨骼肌-tubulin蛋白表达比3周运动组升高了17.8%，；MAP4蛋白表达比3周运动组升高了2.43倍(P 0.05)。另有研究观察到针刺能使紊乱的骨骼肌超微结构，如Z线扭曲、肌节断裂、肌丝缠绕等恢复到正常水平，并且促进M线收缩结构稳定，粗丝结构排列正常34。相关研究报道确定针刺能够治疗肌肉损伤，具有缓解大负荷运动后骨骼肌延迟性酸痛35。总之，大负荷运动后，大鼠骨骼肌微管蛋白通过其结合蛋白的结构损伤，使微管的二聚体的聚合能力降低，产生微管的解聚。同时，针刺有效抑制了大负荷运动后骨骼肌微管蛋白的解聚或降解，加快骨架蛋白的合成代谢，从而有效地促进大负荷运动后骨骼肌微管蛋白结构和功能的重塑。致谢：感谢北京体育大学运动科学学院骨骼肌实验室刘阳博士和于亮博士以及科研中心龚丽景博士在本研究实验过程中给予的帮助，感谢首都体育学院运动科学与健康学院吴昊教授、阎守扶教授和朱一力副教授对本研究的大力支持。作者贡献：第一作者负责实验设计、实验实施和实验评估，第一作者成文。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合 2009 年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例，并通过北京体育大学科研中心伦理委员会批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 卢鼎厚,樊景禹,屈竹青,等.针刺和静力牵张对大负荷运动后骨骼肌收缩结构变化影响的免疫电镜研究J.体育科学,1992,12(6): 47-51.2 李晓楠.针刺与静力牵张对大负荷斜蹲后人骨骼肌Z带变化影响的免疫电镜研究J.体育科学,1992, 6: 60-65.3 袁建琴,王瑞元,李肃反.离心运动对大鼠骨骼肌结蛋白分布和表达的影响-对骨骼肌操作机制的研究J.体育科学, 2005,25(6):63-66.4 YM Xu,JP Lee,WB Fang,et al. Effects of Hypoxic Uphill Exercise on Changes in Sarcolemma Integrity and Dystrophin Centent in Rat Skeletal Muscle. Journal of Exercise science and fitness,2008,6(2): 97-105.5 李俊平.低氧、低氧运动对骨骼肌Titin和Nebulin的影响机理D.北京体育大学,2007.6 马新东,高前进,李俊平,等.离心运动对细胞外基质蛋白含量和膜完整性的影响.北京体育大学学报J,2008, 31(5): 618-622.7 张学林,史冀鹏,高晓娟,等. 针刺对离心运动性骨骼肌过度使用损伤的治疗研究J.中国运动医学杂志, 2013, 32(10):899-909.8 史冀鹏,徐红旗,高晓娟,等.一次性离心运动及针刺对大数骨骼肌生肌调节因子的影响J.北京体育大学学报, 2014, 37(10):65-70.9 Jos MG. Introduction to mitochondria in the heart. Mitochondria and their role in cardiovascular disease. 2013;3-11. 10 Marc L,Orian SS. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metabolism.2013;17:491-506.11 Cai Q, Sheng ZH. Mitochondrial transport and docking in axons. ExpNeurol.2009;218: 257-267.12 Jos MG, Alexander TA, Gordon WM. Mitochondria in heart failure: the emerging role of mitochondrial dynamics. J Card Fail.2013;18(4):439-456.13 Guzun R,Varikmaa MK,Granillo MG,et al. Mitochondria-cytoskeleton interaction: Distribution of -tubulin in cardiomyocytes and HL-1 cells. Biochim Biophys Acta.2011;1807: 458-469.14 Kely LS, Philip AG, Sergey MB, et al. Tubulin tail sequences and post-